WO2024011822A1 - 用于定量检测mdck细胞dna片段大小分布的引物对及检测方法 - Google Patents

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WO2024011822A1
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primer pair
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mdck cells
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吴婉欣
袁小铃
宗伟英
吴晓双
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湖州申科生物技术有限公司
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the field of biological detection, and in particular, to a primer pair and a detection method for quantitatively detecting the size distribution of DNA fragments in MDCK cells.
  • MDCK Mesh-Darby canine kidney
  • MDCK cell line is a continuously passaged canine kidney cell line, which has the advantages of high virus infection efficiency, rapid proliferation, and resistance to mutation.
  • the European Pharmacopoeia has approved the use of this cell line to produce influenza vaccines and related vaccines have been marketed.
  • Novartis launched MDCK cell-based influenza vaccine Optaflu and H1N1 influenza vaccine in 2007 and 2009 respectively.
  • MDCK cell culture technology greatly saves production time.
  • the residual amount of host cell DNA in vaccines is generally allowed to be within 100% in the vaccine. Between pg ⁇ 10 ng/dose.
  • the limit for residual DNA in biological products stipulated in the European Pharmacopoeia is mostly no more than 10 ng/dose, but the residual DNA limit for individual vaccines is more stringent.
  • the residual DNA in the inactivated hepatitis A vaccine must not exceed 100 pg/dose.
  • the amount of DNA residue in the hepatitis B vaccine should not exceed 10 pg/dose.
  • the reported methods for analyzing residual DNA fragments in finished vaccines mainly include capillary electrophoresis and quantitative PCR (qPCR).
  • Capillary electrophoresis is a separation and analysis technology developed in recent years. It is used to determine the concentration and purity of nucleic acids. Its detection sensitivity for DNA/RNA is about 1 ⁇ 5 pg/ ⁇ L. Compared with capillary electrophoresis, the detection limit of qPCR method can reach fg level, with higher sensitivity, and qPCR method is easy to operate and has high sample throughput.
  • As an internationally recognized detection method for residual DNA current molecular biology experiments Laboratories are generally equipped with qPCR experimental conditions. Although there is an urgent market demand for the detection and analysis of residual DNA fragments of MDCK cell matrix vaccine, there have been no relevant reports.
  • the present invention is to overcome the imperfect detection and analysis methods for residual DNA in MDCK cells in the prior art, and therefore provides a primer pair and a detection method for quantitatively detecting the size distribution of DNA fragments in MDCK cells.
  • the present invention first provides a primer pair for quantitatively detecting the size distribution of DNA fragments in MDCK cells
  • the forward primer and reverse primer in each primer pair specifically bind to the segment shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells;
  • the lengths of the amplification products obtained by the amplification of each set of primer pairs are below 100 bp, 100-200 bp, 200-500 bp and above 500 bp respectively.
  • the primer pair is selected from the following primer pairs:
  • the first primer pair wherein the forward primer binds to positions 774-816 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells; the reverse primer binds to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells. Positions 832-876 of the sequence are shown, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 74-94 bp;
  • the second primer pair wherein the forward primer binds to positions 732-773 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells; the reverse primer binds to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells. Positions 850-893 of the sequence are shown, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 132-152 bp;
  • the third primer pair wherein the forward primer binds to positions 746-786 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells; the reverse primer binds to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells. Positions 931-969 of the sequence are shown, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 194-214 bp;
  • the fourth primer pair wherein the forward primer binds to positions 746-786 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells; the reverse primer binds to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells. Positions 1227-1269 of the sequence are shown, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 494-514 bp.
  • the primer pair is selected from the following primer pairs:
  • the first primer pair wherein the forward primer binds to positions 784-806 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells; the reverse primer binds to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells. Positions 842-866 of the sequence are shown, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 84 bp;
  • the second primer pair the forward primer of which binds to 742-763 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells position; the reverse primer binds to positions 860-883 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 142 bp;
  • the third primer pair the forward primer of which binds to 756-776 of the sequence shown in SEQ ID NO:1 on the genomic DNA of MDCK cells position; the reverse primer binds to positions 941-959 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 204 bp;
  • the fourth primer pair wherein the forward primer binds to positions 756-776 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells; the reverse primer binds to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells. Positions 1237-1259 of the sequence are shown, and the length of the amplification product amplified by the primer pair is 504 bp.
  • the forward primer of the first primer pair is as shown in SEQ ID NO:4, and the reverse primer is as shown in SEQ ID NO:5;
  • the forward primer of the second primer pair is as shown in SEQ ID NO:2, and the reverse primer is as shown in SEQ Shown as ID NO:6;
  • the forward primer of the third primer pair is as shown in SEQ ID NO:3, and the reverse primer is as shown in SEQ Shown as ID NO:7;
  • the forward primer of the fourth primer pair is as shown in SEQ ID NO:3, and the reverse primer is as shown in SEQ ID NO:8.
  • the present invention also provides a combination of primer pairs for quantitatively detecting MDCK cell DNA fragment size distribution
  • the primers are shown above and include at least the following combinations:
  • the present invention also provides a detection reagent for quantitatively detecting residual DNA in MDCK cells
  • the detection reagent includes the primer pair as described above or a combination of the primer pairs as described above.
  • the detection reagent further includes a probe.
  • the probe is as shown in SEQ ID NO:9, and the SEQ The sequence shown in ID NO:9 binds to positions 813-840 of the sequence shown in SEQ ID NO:1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • the detection reagent After combining the forward primer, reverse primer and probe, the detection reagent can be obtained.
  • this application proposes the following preferred combination methods.
  • Preferred detection reagent combination 1 the forward primer is shown in SEQ ID NO:4; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:5, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 84 bp.
  • Preferred detection reagent combination 2 the forward primer is shown in SEQ ID NO:2; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:6, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 142 bp.
  • Preferred detection reagent combination 3 the forward primer is shown in SEQ ID NO:3; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:7, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 204 bp.
  • Preferred detection reagent combination 4 the forward primer is shown in SEQ ID NO:3; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:8, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 504 bp.
  • the end of the probe in the detection reagent is labeled with a fluorescent reporter group FAM and a quencher group TAMRA.
  • the sensitivity of the detection reagent is 30 fg/rxn.
  • the present invention also provides a detection kit for quantitatively detecting residual DNA in MDCK cells
  • It includes the primer pair or combination of primer pairs or the detection reagent.
  • the detection kit also includes a standard control.
  • the present invention also provides a method for detecting residual DNA in MDCK cells
  • the method includes: using the primer pair or a combination of primer pairs or the detection reagent or the detection kit, performing qPCR on the sample to be tested, and detecting the qPCR amplification product.
  • the present invention also provides the use of the primer pair or detection reagent or detection kit for quantitatively detecting the residual amount of MDCK cell DNA and its fragment size distribution in the subject to be tested.
  • the present invention can also be used to quantitatively detect residual DNA fragments of MDCK cells in the subject to be tested.
  • the subject to be tested is selected from any one of vaccines, recombinant protein drugs, and antibody drugs prepared based on MDCK cell matrix culture.
  • the purpose of the present invention is to provide a primer pair and reagent for quantitatively detecting MDCK residual DNA fragments using real-time fluorescence quantitative PCR (real-time qPCR) technology, which can be used to analyze MDCK residues in biological product intermediates and finished products.
  • DNA fragments are beneficial to improving processes and product quality, and are used for product quality control and release.
  • the PCR detection method using the primer pair is simple and fast to operate, and it only takes 4 hours from obtaining the sample to giving the detection report; it is highly sensitive, with a quantitative limit of 30 fg/rxn; it is highly specific and can distinguish E.coli, CHO cells, NS0 cells, Vero cells, Pichia pastoris or human interfering DNA.
  • Figure 1 is the amplification curve of the standard curve of system 1.
  • Figure 2 is the linear relationship diagram of system 1.
  • Figure 3 is the amplification curve of the standard curve of system 2.
  • Figure 4 is the linear relationship diagram of system 2.
  • Figure 5 is the amplification curve of the standard curve of system 3.
  • Figure 6 is a linear relationship diagram of system 3.
  • Figure 7 is the amplification curve of the standard curve of system 4.
  • Figure 8 is a linear relationship diagram of system 4.
  • Figure 9 shows the amplification curve of the specificity test.
  • Figure 10 shows the amplification curve of the quantitation limit test.
  • the term "primer" used in the present invention has the meaning conventionally understood by those skilled in the art.
  • the MDCK cell residual DNA-specific primer of the present invention is not designed for the foreign gene itself or the viral vector itself, but for the sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the MDCK cell residual DNA.
  • the primer of the present invention can specifically bind to the sequence shown in SEQ ID NO: 1 of MDCK cell genomic DNA.
  • sequence shown in SEQ ID NO:1 of MDCK cell genomic DNA is specifically as follows:
  • the forward primer is as shown in any one of SEQ ID NO: 2 ⁇ 4.
  • SEQ ID NO: 2 The sequence shown in SEQ ID NO: 2 is specifically: CTGTTGGTGGGAATGTGAACTG, which binds to positions 742-763 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • sequence shown in SEQ ID NO:3 is specifically: GTGAACTGGTGCAGCCACTGT, which binds to positions 756-776 of the sequence shown in SEQ ID NO:1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • sequence shown in SEQ ID NO: 4 is specifically: TGTGTGGAGGTTCCTCAAACAGT, which binds to positions 784-806 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • the reverse primer is as shown in any one of SEQ ID NO: 5 ⁇ 8.
  • sequence shown in SEQ ID NO:5 is specifically: GTATCTTTGGGGTAAATCCCCAACA, which binds to positions 842-866 of the sequence shown in SEQ ID NO:1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • sequence shown in SEQ ID NO: 6 is specifically: GCGTTTCATTGCATTTGTATCTTT, which binds to positions 860-883 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • sequence shown in SEQ ID NO:7 is specifically: TTGGACACCGAGGCTCCTT, which binds to positions 941-959 of the sequence shown in SEQ ID NO:1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • sequence shown in SEQ ID NO: 8 is specifically: CCTTCTACCACCCCTAGTTCGTT, which binds to positions 1237-1259 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • the primer pair is selected from the following primer pairs:
  • the first primer pair the forward primer is as shown in SEQ ID NO:4, and the reverse primer is as shown in SEQ Shown as ID NO:5;
  • the second primer pair the forward primer is as shown in SEQ ID NO:2, and the reverse primer is as shown in SEQ Shown as ID NO:6;
  • the third primer pair the forward primer is as shown in SEQ ID NO:3, and the reverse primer is as shown in SEQ Shown as ID NO:7;
  • the fourth primer pair the forward primer is as shown in SEQ ID NO:3, and the reverse primer is as shown in SEQ ID NO:8.
  • the primer pairs are as shown in the first primer pair, the second primer pair, the third primer pair and the fourth primer pair as mentioned above, and at least include the following combinations:
  • probe used herein has the meaning conventionally understood by those skilled in the art, that is, a small piece of single-stranded DNA or RNA fragment used to detect a nucleic acid sequence complementary to it.
  • probes of the present invention are not limited to the probes specifically disclosed in the examples.
  • primer pairs of the present invention are not limited to pairing with the probes specifically disclosed in the examples.
  • the probe of the present invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • sequence shown in SEQ ID NO:9 is specifically:
  • FAM-TATACCTGCCCTACGACCCAGCAATTGC-TAMRA which binds to positions 813-840 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the genomic DNA of MDCK cells.
  • the present invention also provides a detection reagent for quantitatively detecting residual DNA in MDCK cells.
  • the detection reagent includes the primer pair of the present invention, a probe and other components required to implement PCR, such as qPCR reaction buffer, DNA diluent, and DNA quantitative reference. Taste.
  • the primer pair includes a first primer pair, a second primer pair, a third primer pair and a fourth primer as described above.
  • the probe is the sequence shown in SEQ ID NO:9.
  • the first primer pair, the second primer pair, the third primer pair and the fourth primer are combined with the probe.
  • this application proposes the following preferred combination methods.
  • Preferred detection reagent combination 1 the forward primer is shown in SEQ ID NO:4; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:5, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 84 bp.
  • Preferred detection reagent combination 2 the forward primer is shown in SEQ ID NO:2; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:6, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 142 bp.
  • Preferred detection reagent combination 3 the forward primer is shown in SEQ ID NO:3; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:7, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 204 bp.
  • Preferred detection reagent combination 4 the forward primer is shown in SEQ ID NO:3; the reverse primer is shown in SEQ ID NO:8, and the probe is shown in SEQ As shown in ID NO: 9, the length of the amplification product amplified by the detection reagent is 504 bp.
  • the detection sensitivity of the detection reagent of the present invention reaches 30 fg/rxn.
  • the present invention also provides a detection kit for detecting residual DNA of MDCK cells.
  • the kit includes a container and the above-mentioned primer pair of the present invention and probe located in the container. .
  • the reagents in the present invention also include: qPCR reaction buffer, DNA diluent, DNA quantification reference.
  • the present invention further provides a method for detecting residual DNA in MDCK cells.
  • the method includes using the primer pair or the detection reagent as mentioned above to perform qPCR on the sample to be tested. detection.
  • the reaction program was set on the Applied biosystems 7500 fluorescence quantitative PCR instrument: pre-denaturation at 95°C for 10 min; 40 cycles of 95°C for 15 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 1min30 s; the reaction volume was 30 ⁇ L.
  • the correlation coefficient R 2 of the standard curve equation should be greater than 0.990, and the slope should be between -3.1 and -3.8 (that is, the amplification efficiency should be between 83.3% and 110.0%).
  • the present invention can provide a method using real-time fluorescence quantitative PCR (real-time A kit for the quantitative detection of MDCK residual DNA fragments using qPCR technology. It can be used to analyze MDCK residual DNA fragments in biological product intermediates and finished products. It is conducive to improving the process and product quality, and is used for product quality control and release.
  • the PCR detection method using the primer pair is simple and fast to operate, and it only takes 4 hours from obtaining the sample to giving the detection report; it is highly sensitive, with a quantitative limit of 30 fg/rxn; it is highly specific and can distinguish E.coli, CHO cells, Interfering DNA from NS0 cells, Vero cells, Pichia pastoris or humans.
  • the established method can be used to detect the size distribution of MDCK residual DNA fragments in biological products.

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Abstract

本发明公开用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对、检测试剂及检测方法，所述引物对至少包含4组引物对。本发明能够用于分析生物制品中的MDCK残留DNA片段。所述的方法能够用于定量检测生物制品中MDCK残留DNA片段大小分布情况。

Description

用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法 技术领域
本申请主张2022年04月06日申请的中国专利申请202210356503.7的优先权，上述说明书的全部内容为本申请的参考文献。
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法。
 背景技术
生物制品中的疫苗、重组蛋白药、抗体药等产品多采用连续传代的动物细胞株表达生产。MDCK（Madin-Darby canine kidney）细胞系是一种连续传代的犬肾细胞系，具有病毒感染效率高、增殖快、不易变异等优点，目前欧洲药典已经批准使用此细胞系生产流感疫苗且已有相关疫苗上市。诺华（Novartis）公司分别在2007年和2009年推出MDCK细胞基质的流感疫苗Optaflu和甲型H1N1流感疫苗，相比传统的鸡胚接种培养技术，MDCK细胞培养技术大大节约了生产时间。
 技术问题
但是，市场对与使用MDCK细胞来生产流感疫苗仍存有顾虑。因为有文献报道，MDCK细胞对免疫缺陷动物性动物具有不同程度的致瘤性，且有研究表明，细胞培养基成分可以影响MDCK细胞是否具有致瘤性。尽管在MDCK细胞基质流感疫苗生产过程中，通过超滤、核酸酶处理、层析、β-丙内酯灭活等方法可以去除多数宿主细胞残留DNA，但疫苗产品中仍有可能残留DNA片段。因此，为控制疫苗生产质量，需要对疫苗中MDCK宿主细胞残留DNA的片段进行监测。
国内外监管机构对于疫苗中宿主细胞DNA的残留量和残留DNA片段的大小分布等有强烈的关注。对于宿主细胞DNA的残留量，根据宿主细胞类型、给药方式和给药频率，一般允许疫苗中其含量在100 pg~10 ng/剂之间。欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂，但对个别疫苗的残留DNA限定标准更严格，如甲型肝炎灭活疫苗中的DNA残留量不得超过100 pg/剂，乙型肝炎疫苗中的DNA残留量不得超过10 pg/剂。而在对于残留DNA片段，有报道表明一个功能基因的长度至少200 bp，现国家药品监督管理局（NMPA）生物制品药学部在基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）中指出，残留DNA片段应小于200 bp。在美国，FDA要求疫苗生产企业应该测试成品中的残留DNA的数量和片段大小的分布情况，并在关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出HCD的片段要小于200 bp。
目前可见报道中对疫苗成品残留DNA片段的分析方法主要有毛细管电泳和定量PCR法（qPCR）。毛细管电泳是近年来发展起来一种分离、分析技术，用于对核酸浓度和纯度的测定，其对DNA/RNA的检测灵敏度约为1~5 pg/μL。相较于毛细管电泳法，qPCR法的检测限可达fg级别，具有更高的灵敏度，且qPCR法操作简便、样品通量较高，作为国际公认的残留DNA的检测方法，目前分子生物学实验室已普遍具备qPCR的实验条件。尽管市场对MDCK细胞基质疫苗的残留DNA片段检测分析有着迫切的需求，但尚未见相关报道。
背景技术中引用的相关参考文献如下所示：
1. E A Govorkova, G. M., B Meignier, C de Taisne, R G Webster, African green monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses. 1996, 70 (8).。
2. Zhang DL, Li LJ., Xia GT, et al., Analyses of chromosomal karyotypes and cytogenetic variations of animal cell lines. Yi Chuan xue bao = Acta Genetica Sinica 2001, 28 (4), 327-344. 。
3. 闫璐瑶, 张家友, 张青梅,等, 宿主细胞残留DNA片段大小分布检测方法的建立及验证 [J]. 中国生物制品学杂志 2021, 34 (3), 6. 。
4.  闫璐瑶, 生物制品中宿主细胞残留DNA检测的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志 2021, 44 (3), 5. 。
5. FDA, Guidance for industry: characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the production of viral vaccines for infectious disease indications. 2010. 。
6. 国家药典委员会, 中华人民共和国药典2020年版三部 [M]. 北京：中国医药科技出版社 2020, 555. 。
7. FDA, 1130 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES—APPROACHES FOR DETECTING TRACE NUCLEIC ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING) [EB/OL]. 。https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/usp35/data/v35300/usp35nf30s0_c1130.html. 。
 技术解决方案
本发明是为了克服现有技术中对于MDCK细胞残留DNA的检测分析方法尚未完善，因此提供了一种用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
在第一方面，本发明首先提供了一种用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，
其至少包含4组引物对；其中：
各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于MDCK细胞基因组DNA 上SEQ ID NO:1所示区段；
各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp、200-500bp以及500bp以上。
作为优选，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第774-816位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第832-876位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为74-94bp；
第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第732-773位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第850-893位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为132-152bp；
第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第931-969位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为194-214bp；
第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1227-1269位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为494-514bp。
作为优选，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第784-806位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第842-866位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为84bp；
第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第742-763 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第860-883位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为142bp；
第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第941-959位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为204bp；
第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1237-1259位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为504bp。
作为优选，所述第一引物对的正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ ID NO:5所示；
所述第二引物对的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
所述第三引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示；
所述第四引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示。
在第二方面，本发明还提供了用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对的组合，
所述引物上所示，且至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。
在第三方面，本发明还提供了用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，
所述检测试剂包括如上所述的引物对或者如上所述的引物对的组合。
作为优选，所述检测试剂中还包括探针。
作为优选，所述探针如SEQ ID NO:9所示，所述SEQ ID NO:9所示的序列结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第813-840位。
将正向引物、反向引物以及探针组合后，即可获得所述检测试剂，在此本申请提出以下几种优选的组合方式。
优选检测试剂组合1：正向引物如SEQ ID NO:4所示；反向引物如SEQ ID NO:5所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为84bp。
优选检测试剂组合2：正向引物如SEQ ID NO:2所示；反向引物如SEQ ID NO:6所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为142bp。
优选检测试剂组合3：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:7所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为204bp。
优选检测试剂组合4：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:8所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为504bp。
作为优选，所述检测试剂中的探针端部标记有荧光报告基团FAM以及淬灭基团TAMRA。
作为优选，所述检测试剂的灵敏度为30 fg/rxn。
在第四方面，本发明还提供了用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒，
其包含所述的引物对或者引物对的组合或者所述的检测试剂。
作为优选，所述检测试剂盒中还包括标准品对照。
在第五方面，本发明还提供了一种MDCK细胞残留DNA的检测方法，
所述方法包括：利用所述的引物对或者引物对的组合或者所述的检测试剂或者所述的检测试剂盒，对待测样品进行qPCR，并检测qPCR扩增产物。
第六方面，本发明还提供了所述的引物对或者检测试剂或者检测试剂盒的用途，用于定量检测待测对象中MDCK细胞DNA残留量及其片段大小分布。
作为优选，基于上述用途，本发明还能够用于定量检测待测对象中MDCK细胞残留DNA片段。
作为优选，所述待测对象选自基于MDCK细胞基质培育制备的疫苗、重组蛋白药、抗体药中的任意一种。
 有益效果
（1）本发明的目的是提供一种采用实时荧光定量PCR（real-time qPCR）技术定量检测MDCK残留DNA片段的引物对及试剂，其能够用于分析生物制品中间品、成品中的MDCK残留DNA片段，有利于改进工艺、提高产品质量，用于产品质量控制和放行。
（2）利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷，从获得样品到给出检测报告只需4h；灵敏度高，定量限均为30 fg/rxn；专属性强，能区分E.coli、CHO细胞、NS0细胞、Vero细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA。
 附图说明
图1为体系1的标准曲线的扩增曲线。
图2为体系1的线性关系图。
图3为体系2的标准曲线的扩增曲线。
图4为体系2的线性关系图。
图5为体系3的标准曲线的扩增曲线。
图6为体系3的线性关系图。
图7为体系4的标准曲线的扩增曲线。
图8为体系4的线性关系图。
图9 为专属性测试的扩增曲线。
图10 为定量限测试的扩增曲线。
 本发明的实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的引物对
本发明所使用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的MDCK细胞残留DNA特异性引物不是针对外源基因本身或者病毒载体本身设计，而是针对MDCK细胞残留DNA的SEQ ID NO:1所示序列设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于MDCK细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1所示序列。
其中MDCK细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1所示序列具体如下所示：
ATTCTCTGGCTGTCTTTGAGTTTTGTTGACTGTATCCTTTGCTGTGCAAAAGCTTCTTATCTTGATGAAGTCCCAATAGTTCATTTTTGCTTTTGTTTCTTTTGCCTTCGTGGATGTATCTTGCAAGAAGTTACTATGGCCGAGTTCAAAAAGGGTGTTGCCTGTGTTCTTCTCTAGGATTTTGATGGAATCTTGTCTCACATTTAGATCTTTCATCCATTTTGAGTTTATCTTTGTGTATGGTGAAAGAGAGTGGTCTAGTTTCATTCTTCTGCATGTGGATGTCCAATTTTCCCAGCACCATTTATTGAAGAGACTGTCTTTCTTCCAATGGATAGTCTTTCCTCCTTTATCGAATATTAGTTGCCCATAAAGTTCAGGGTCCACTTCTGGATTCTCTATTCTGTTCCACTGATCTATGTGTCTGAAGATATTTGCAAATGACATATCAGATAAAGGGCTAGTTTCCAAGATCTATAAAGAACTTATTAAACTCAACACCAAAGAAACAAACAATCCAATCATGAAATGGGCAAAAGACATGAACAGAAATCTCACAGAAGAAGACATAGACATGGCCAACATGCACATGAGAAAATGCTCTGCATCACTTGCCATCAGGGAAATACAAATCAAAACCACAATGAGATACCACCTCACACCAGTGAGAATGGGAAAAATTAACAAGGCAGGAAACAACAAATGTTGGAGAGGATGTGGAGAAAAGGGAACCCTCTTACACTGTTGGTGGGAATGTGAACTGGTGCAGCCACTGTGGAAAACTGTGTGGAGGTTCCTCAAACAGTTAAAAATATACCTGCCCTACGACCCAGCAATTGCACTGTTGGGGATTTACCCCAAAGATACAAATGCAATGAAACGCTGGGACACCTGCACCCCGATGTTTCTAGCAGCAATGGCCACGATAGCCAAACTGTGGAAGGAGCCTCGGTGTCCAACGAAAGATGAATGGATAAAGAAGATGTGGTTTATGTATACAATGGAATATTACTCAGCTATTAGAAATGACAAATACCCACCATTTGCTTCAACGTGGATGGAACTGGAGGGTATTATGCTGAGTGAAGTAAGTCAGTCGGAGAAGGACAAACATTATATGTTCTCATTCATTTGGGGAATATAAATAATAGTGAAAGGGAAAATAAGGGAAGGGAGAAGAAATGTGTGGGAAATATCAGAAAGGGAGACAGAACATAAAGACTGCTAACTCTGGGAAACGAACTAGGGGTGGTAGAAGGGGAGGAGGGCGGGGGGTGGGAGTGAATGGGTGACGGGCACTGGGTGTTATTCTGTATGTTAGTAAATTGAACACCAATAAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAAAAAAAAATAACATTCTCTGGC。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对SEQ ID NO:1所示序列可以设计多种引物对。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体的到的引物对。
在具体的实施方式中，正向引物如SEQ ID NO:2~4中的任意一项所示。
SEQ ID NO:2所示序列具体为：CTGTTGGTGGGAATGTGAACTG，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第742-763位。
SEQ ID NO:3所示序列具体为：GTGAACTGGTGCAGCCACTGT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776位。
SEQ ID NO:4所示序列具体为：TGTGTGGAGGTTCCTCAAACAGT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第784-806位。
在具体的实施方式中，反向引物如SEQ ID NO:5~8中的任意一项所示。
SEQ ID NO:5所示序列具体为：GTATCTTTGGGGTAAATCCCCAACA，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第842-866位。
SEQ ID NO:6所示序列具体为：GCGTTTCATTGCATTTGTATCTTT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第860-883位。
SEQ ID NO:7所示序列具体为：TTGGACACCGAGGCTCCTT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第941-959位
SEQ ID NO:8所示序列具体为：CCTTCTACCACCCCTAGTTCGTT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1237-1259位。
在具体的实施方式中，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对：正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ ID NO:5所示；
第二引物对：正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
第三引物对：正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示；
第四引物对：正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示。
引物对的组合
所述引物对如上所述第一引物对、第二引物对、第三引物对以及第四引物对所示，且至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。
本发明的探针
本文所述的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限 于与实施例中具体公开的探针配对使用。
在具体的实施方式中，本发明的探针如SEQ ID NO:9所示序列。
SEQ ID NO:9所示序列具体为：
FAM-TATACCTGCCCTACGACCCAGCAATTGC-TAMRA，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第813-840位。
本发明的检测试剂
本发明还提供用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对、探针以及实施PCR所需的其它成分，例如qPCR reaction buffer，DNA稀释液， DNA定量参考品。
在具体的实施方式中：
所述引物对，包含如上所述第一引物对、第二引物对、第三引物对以及第四引物。
所述探针为如SEQ ID NO:9所示的序列。
所述第一引物对、第二引物对、第三引物对以及第四引物与探针之间结合，在此本申请提出以下几种优选的组合方式。
优选检测试剂组合1：正向引物如SEQ ID NO:4所示；反向引物如SEQ ID NO:5所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为84bp。
优选检测试剂组合2：正向引物如SEQ ID NO:2所示；反向引物如SEQ ID NO:6所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为142bp。
优选检测试剂组合3：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:7所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为204bp。
优选检测试剂组合4：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:8所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为504bp。
在具体的实施方式中，本发明的检测试剂的检测灵敏度达到30 fg/rxn。
在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明还提供了用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于容器中的上述本发明引物对以及探针。
在具体的实施方式中，本发明中的试剂还包括：qPCR reaction buffer、DNA稀释液、DNA定量参考品。
在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供了MDCK细胞残留DNA的检测方法，所述方法包括利用如上所述的引物对或者如上所述的检测试剂，对待测样品进行qPCR检测。
下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件，除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
【本发明所用的材料、仪器及方法】
1. 材料
来自湖州申科生物技术有限公司，包含qPCR reaction buffer，DNA稀释液，本发明引物对，本发明探针，MDCK DNA定量参考品。其中本发明靶标序列、引物对以及探针的组成具体如下表1所示。
2. 仪器
Applied biosystems 7500荧光定量PCR仪。
3. 方法
3.1标准曲线样品准备
用DNA稀释液将MDCK DNA定量参考品进行10倍梯度稀释，配制成300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、0.3 pg/μL、0.03 pg/μL、0.003 pg/μL的标准品溶液。
3.2 qPCR反应体系
检测体系30μL：20 μL qPCR反应液 + 10 μL模板。
Applied biosystems 7500荧光定量PCR仪设置反应程序：95℃预变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1min30 s，40个循环；反应体积30 μL。
3.3数据分析
扩增结束后，设置阈值线，读取标准曲线的扩增效率、斜率、R 2以及各样品的检测值。
3.4结果判定
1）标准曲线方程的相关系数R 2应大于0.990，斜率在-3.1～-3.8（即扩增效率在83.3%～110.0%）。
2）阴性对照无模板对照（NTC）和干扰性DNA的Ct值未检出或者≥35.00。
表1
 
将引物对以及探针进行组合，得到如下表2所示的几种不同的体系。
表2
【具体实施例】
实施例1-线性范围
扩增四种不同片段检测体系的标准曲线，计算标准曲线相关系数（R 2）和扩增效率（En）。结果表明，建立的四种不同片段检测体系的线性范围为3 ng/rxn~30 fg/rxn，标准曲线R 2≥0.990，En为83.3%~110.0%，NTC Ct值≥35.00，内部质控信号Ct值≤32.00。
其中体系1~体系4的标准曲线的扩增曲线以及线性关系图如图1~8所示，表3为四种不同片段检测体系的线性范围测试结果表。
 表3. 四种不同片段检测体系的线性范围测试结果
实施例2-专属性
评估生产常用的工程细胞基因组CHO、E.coli、Human、NS0、Vero、毕赤酵母六种细胞/菌的基因组DNA对MDCK不同片段检测体系的干扰。结果表明，所选六种干扰基因组DNA的检测Ct值均≥35.00，说明其对已建立的四组体系干扰较小，体系表现出较优的专属性。专属性测试的扩增曲线如图9所示，专属性测试的扩增曲线如图9所示，表4为四种不同片段检测体系的专属性测试结果表。
表4专属性测试结果
实施例3-定量限
扩增四种不同片段检测体系的标准曲线（3 ng/rxn~30 fg/rxn），同时测定各组在模板量为30 fg/rxn的检测Ct值（10复孔），将检测Ct值代入标准曲线计算得到各孔检测浓度，计算10复孔检测浓度的变异系数（CV）和偏差。结果表明，各体系30 fg/rxn检测浓度的CV和偏差均≤30.0%，定量限均为30 fg/rxn，定量限测试的扩增曲线如图10所示，定量限检测结果如表5所示。
表5. 定量限检测结果
综上所述，本发明能够提供一种采用实时荧光定量PCR（real-time qPCR）技术定量检测MDCK残留DNA片段的试剂盒，其能够用于分析生物制品中间品、成品中的MDCK残留DNA片段，有利于改进工艺、提高产品质量，用于产品质量控制和放行。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷，从获得样品到给出检测报告只需4h；灵敏度高，定量限均为30 fg/rxn；专属性强，能区分E.coli、CHO细胞、NS0细胞、Vero细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA。所建立的方法能够用于检测生物制品中MDCK残留DNA片段大小分布情况。

Claims (13)

  1. 用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
    至少包含4组引物对；其中：
    各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于MDCK细胞基因组DNA 上SEQ ID NO:1所示区段；
    各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp、200-500bp以及500bp以上。
  2. 根据权利要求1所述用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
    所述引物对选自以下引物对：
    第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第774-816位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第832-876位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为74-94bp；
    第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第732-773位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第850-893位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为132-152bp；
    第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第931-969位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为194-214bp；
    第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1227-1269位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为494-514bp。
  3. 根据权利要求1或2中任意一项用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
    所述引物对选自以下引物对：
    第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第784-806位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第842-866位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为84bp；
    第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第742-763 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第860-883位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为142bp；
    第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第941-959位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为204bp；
    第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1237-1259位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为504bp。
  4. 根据权利要求3所述用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
    所述第一引物对的正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ ID NO:5所示；
    所述第二引物对的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
    所述第三引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示；
    所述第四引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示。
  5. 用于定量检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对的组合，其特征在于，
    所述引物如权利要求2~4中任意一项所示，且至少包括下述组合：
    所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
    所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对；
    所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。
  6. 用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
    所述检测试剂包括如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合。
  7. 根据权利要求6所述的用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
    还包括探针。
  8. 根据权利要求7所述的用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
    所述探针如SEQ ID NO:9所示。
  9. 用于定量检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒，其特征在于，
    其包含如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者6~8中任意一项所述的检测试剂。
  10. 一种MDCK细胞残留DNA的检测方法，其特征在于，
    所述方法包括：利用如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者6~8中任意一项所述的检测试剂或者权利要求9所述的检测试剂盒，对待测样品进行qPCR，并检测qPCR扩增产物。
  11. 权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者6~8中任意一项所述的检测试剂或者权利要求9所述的检测试剂盒的用途，用于定量检测待测对象中MDCK细胞DNA残留量及其片段大小分布。
  12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于，
    用于定量检测待测对象中MDCK细胞残留DNA片段。
  13. 根据权利要求11或12所述的用途，其特征在于，
    所述待测对象选自基于MDCK细胞基质培育制备的疫苗、重组蛋白药、抗体药中的任意一种。
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