CN109837345A - 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了检测小鼠细胞，例如NS0或SP2/0细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作不仅简便快捷、灵敏度高，还能区分真核宿主细胞，例如CHO细胞、Vero细胞，毕赤酵母菌、大鼠细胞，特别是人类的干扰性DNA以及原核宿主细胞，例如大肠杆菌的干扰性DNA。

Description

检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及小鼠细胞，例如SP2/0 或NS0细胞的残留DNA的检测引物及方法。

背景技术

在现代，生物重组制品，包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗 体以及各种细胞因子等已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作 用。国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。

重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复 杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其 中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要 的质量控制环节。

在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细 胞多为原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物 制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变 或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因 的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的 DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。

关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子 杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相 对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需 求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺 点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。

Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法， 它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产 物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于Taqman 探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基 因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样 本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对 以上问题仍需要进一步研究、解决。

综上所述，本领域急需检测生物制品中NS0细胞DNA的方法，该方法应具 备灵敏性、操作简便、标准统一等优点并且能区分NS0细胞DNA与其它真核宿 主细胞DNA，从而能用于生物制品质量控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测生物制品中小鼠细胞基因组DNA，特别是 NS0细胞DNA的引物对以及方法。

在第一方面，本发明提供一种检测小鼠细胞基因组DNA的引物对，所述引 物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA 上SEQ ID NO:1所示序列的第1821-1840位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO: 1所示序列的第1900-1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 90-110bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为19-22bp；优选 20-21bp；更优选20和21bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并 且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。

在具体的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如 SEQID NO:3所示。

在优选的实施方式中，所述小鼠细胞包括但不限于NS0或SP2/0细胞。

在第二方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方 面所述的引物对。

在具体的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如 SEQID NO:3所示。

在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。

在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:5所示。

在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为0.3fg/μl。

在优选的实施方式中，所述检测试剂包含的引物对中，所述正向引物如SEQ IDNO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；而所述检测试剂包含的探针 如SEQ ID NO:5所示。

在第三方面，本发明提供一种检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述方法 包括：利用本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测试剂， 对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位 于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选 20-21bp；更优选20和21bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并 且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。

在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如 SEQID NO:3所示。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。

在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:5所示。

在优选的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向 引物如SEQ ID NO:3所示；而所述探针如SEQ ID NO:5所示。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。

在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：

在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对扩增目标产物。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选 20-21bp；更优选20和21bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并 且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。

在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如 SEQID NO:3所示。

在优选的实施方式中，所述PCR检测体系还包括探针。

在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:5所示。

在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示；而所述探针如SEQ ID NO:5所示。

在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的引物对或第二方面所述的 检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在小鼠细胞DNA。

在优选的实施方式中，所述待测对象是重组蛋白制品。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示；

图2显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示；

图3-4显示了利用SEQ ID NO:2和3所示引物对进行灵敏度检验的结果；

图5显示利用如SEQ ID NO:2和3所示引物对获得的碎片化程度不同的 DNA片段梯度稀释的qPCR检测结果；

图6显示碎片化程度不同的DNA片段的电泳结果；其中，DNA分子量标准： 由上至下依次为2000bp、1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1-6 分别为DNA marker、0min超声样本、10s超声样本、1min超声样本、10min 超声样本、30min超声样本；

图7-11显示了利用如SEQ ID NO:2和3所示引物对对未超声对照以及超声 10s、1min、10min、30min的一系列碎片化程度不同的DNA片段进行qPCR检 测的结果；

图12-13显示了利用CHO细胞DNA、大肠杆菌DNA、毕赤酵母菌DNA、vero 细胞DNA、Hcc827DNA、大鼠细胞DNA检验如SEQ ID NO:2和3所示引物对的 抗干扰性能的结果。

具体实施方式

经过深入而广泛的研究，本发明人出乎意料地发现针对小鼠细胞，包括但 不限于SP2/0或NS0细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1所示序列设计的引物，不仅 能够高度灵敏地检测小鼠细胞基因组DNA，还能区分其它真核细胞，例如CHO 细胞、Vero细胞，毕赤酵母菌、人细胞、大鼠细胞以及原核细胞，例如大肠杆 菌细胞的干扰性DNA；从而获得兼具灵敏度和特异性的检测基因组DNA的引物 对以及检测方法。本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。在此基础上 完成了本发明。

小鼠细胞

包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等在 内的生物重组制品主要由基因改造的工程宿主细胞生产。国际上对生物重组制 品的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求，其中残余的生物遗传物 质，DNA是非常重要的污染源。

在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细 胞可以是原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。其中，哺乳动物细 胞的培养由于可用来大量生产疫苗、重组蛋白和其他医疗产品而倍受重视。目 前已建成来自鼠、人、猴等的许多重要细胞系。

例如，NS0细胞源自非分泌型的小鼠骨髓瘤细胞。该细胞是生物医学研究 和工业化生产治疗性蛋白药物的细胞模型。这个细胞系是胆固醇依赖的，源自 只分泌轻链而无重链的NSI/1亚细胞系。人们首先从BALB/c小鼠的肿瘤中分离 出能分泌IgG1的MOPC21肿瘤细胞。从这个肿瘤细胞中再得到P3K细胞，并发 展出两个细胞系289-16和P3-X63。而289-16细胞系只分泌轻链而不分泌重链， 其又被重新命名为NSI/1。再从NSI/1里分离了非分泌型的细胞亚克隆，鉴定命 名此非分泌型细胞亚克隆为NS0/1。作为骨髓瘤细胞，NS0能进行天然的悬浮培 养并能产生抗体。NS0细胞常常与GS(谷氨酰胺合成酶)选择系统结合使用。 GS-NS0是一个异源的哺乳动物表达系统，可以快速地表达重组蛋白。

而SP2/0细胞来源于用鸡红细胞免疫过的BALB/c小鼠的脾细胞和 P3X63Ag8骨髓瘤细胞的融合细胞。

以上源自小鼠的细胞系均主要用于生物重组制品的生产，因此，本发明为 检测小鼠细胞的残留DNA提供了物质手段。

本发明的引物对

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。发明人经过大 量和细致的工作，针对小鼠细胞基因组DNA的不同序列设计了大量引物对，但这 些引物对的灵敏度和特异性均无法令人满意；发明人进一步针对小鼠细胞基因组 DNA上SEQ ID NO:1所示序列的不同区域设计了多对引物对，最后发现针对SEQ ID NO:1所示序列的第1821-1840位以及SEQ ID NO:1所示序列的第1900-1920 位设计的引物对能够具备优异的灵敏度和特异性。

因此，本发明的小鼠细胞基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病 毒载体本身设计，而是针对小鼠细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1所示序列(ACCTGAAGTTTATCTTCGAGTATTGTTCGGACATCCCTTTGACTCCTGGAAC CGTCTCATGCGGCAGTTGGGCCTCACAGACAATCAAATCCAAATGGTCAAA GCCGAAACACTGGTCACACGTGAGGCCCTGTACCAAATGCTGCTCAAGTGGCGCCACCAGACTGGGCGAAGTGCCTCCATCAACCATCTGCTGGATGCCTTGGAAGCCGTGGAAGAGAGAGATGCCATGGAGAAAATTGAAGACTACGCAGTGAAATCCGGGAGGTTTACTTATCAGAACGCTGCAGCCCAACCAGAGACAGGGCCAGGAGGATCTCAGTGCGTTTGAAGTCAGCCTGATCTACTTAGTGAACTCAGGACAGCCAAGGCTATGTAGAGAGCCCCGAAGATGCAGGCTCTTCAGTATTATGAGAATGTACTTAATTTTTTCTTGTAGTAGTTAGTGTATCATATTATTGTATTATTTATATTATTACTGTTAAGTACTATGTTCTCTTATTAGAAGTTGAACACAGAACCTCTGAGAACACATATGCTACAAGTGTTCTAACACACCTCCAGCATCCCGGATTACCTTTGTTCCTGAACAAGGCACAATTGGTAGGGTATGATAGGGCCTGCCTATCATCCTAACACTCCGGTGATGGAGCCAGGAAGATCAAGAGTTCGAGGCCAGCTGGTTCACATAAGATCCCATATAATGTGCAGGATGGCTAAACTTGCTGAGAGCTGACTCTGTGGTCTCCTGTCCCAGATTCTAGCGATATTCATTACTAAGACCCTTGTCCAGAGACAAAAGACCACCTCTGTAACAGAGGGAAGAATAAAACAGCCCTAGGGTGGAAACTCCTTGTGAACACAGCCACTGCTGTTTACTGTTAGACTACTGCTCAGCACTACACAGCTGCACGGCACCTCCCTGTGCCAGGTGCTAGTGGGCAGCCTACTGAGGGTACATCTAACTTGAATCTAACACACTTGAAGTGAGTTTGCTGGTTTGGACACAGAGGGAGCATTAAGTGCTACCTGGGGTGACCCTTGAGGACCACGCCCCCTGTAAGCATTTGACCATTGTGAGAGTAAACACTGAAACTCACCATTGTCCTGCCTCAGCCTTTCTAGAGCTGGAATCATAGGTATGCTGCACCGGATCCAGAAGGAGAAATAACTACCTTTAGATACTGTGATAGGGATTTCTAGAAAGCTGCCACATACAGATTTTTGTCCTGTGTGAATTCCTATTGTTTTTTGTTTGTTTTTAATTTTTTATTATTTATTTTCTTCATTCACATTTCAAATGCTATCCCAAAAGTCCCCTATGCCCTCCCCCCCCCTGCCCCCCGCCCTGCTCCCCTACCCACTCACTCACTCCCACTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATTCACCTGCCTCTGCCTCCCAAGTGCTGGGATTAAAGGTGTGTGCCACCATGCCCGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTAATTAGGTATTTATTTCATTTAAATTTCCAATGCTATCCCAAAAGTCCCCCACATGCTCCCCCACCCACTCCCCACCTGACTTTATATGCCTCACTCCCACTTCTTGGCCCTGGTGTTCCCCTGTACTGGGGCATATAACGTTTGCAAGACCAAGGGGCGTCTCTTTCCACTGATGGCCGACTAGGCCATCTTCTGATACATATGCAGCTAGAGACACGAGCTCTGGGGGGGTACTGGTTAGTTCATATTGTTGTTCCACCTATAGGGTTGCCGACCCCTTCAGCTCCTTGGGTACTTTCTCTAGCTCCTCCACTAGGGGCCCTGTGTTCTATCCAATAGATGACTGTGAGCATCCACTTCTGTATTTGCCAGGCACTGGCATAGCCTCATACGAGACAGCTATATCAGGGTCCAGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTAAACTAGCATGCTGGAGAGGTAGCTCAGCGGTTAAGAGCAGTGGCTGCTCTTCCAGAGGTCCTGAGTTCCAATTCCCAGCAGCTACATAGTGGCTCACAACCTTCTCTAATGGGATCTGATGTCCTTTTCTAGTGTGTTTGAAGCCAGTGGCAGTGTAATTACATACACAAAATAAATAAATCTTTTT)设计的。换言之，本发明的 引物可以特异性结合于小鼠细胞基因组DNA上的SEQ ID NO:1所示序列。

在具体的实施方式中，本发明的正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA上 SEQ IDNO:1所示序列的第1821-1840位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1 所示序列的第1900-1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 90-110bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选 20-21bp；更优选20和21bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物 的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值 ≤2℃。

在具体的实施方式中，本发明的引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示(CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA)，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示(GCCTG GCAAATACAGAAGTGG)，扩增产物如SEQ ID NO:4所示 (CCCCTTCAGCTCCTTGGGTACTTTCTCTAGCTCCTCCACTAGGGGCCCTGT GTTCTATCCAATAGATGACTGTGAGCATCCACTTCTGTATTTGCCAGGC)。

探针

本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段 单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。

鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知 晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之 间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实 施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于 液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因 此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限 于与实施例中具体公开的探针配对使用。

在具体的实施方式中，本发明的探针为AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT (SEQ ID NO:5)。

本发明的检测试剂

本发明还提供一种检测小鼠细胞基因组DNA的检测试剂，所述检测试剂包 含本发明的引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、 Mg²⁺等等。

在具体的实施方式中，本发明的检测试剂包含的引物对为SEQ ID NO:2和 3所示的正向引物和反向引物；包含的探针为SEQ ID NO:4所示探针。

在具体的实施方式中，本发明检测试剂的检测灵敏度达到0.3fg/μl。

在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测小鼠 细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明的引物对或检测试剂，对 待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

在本发明的引物对的基础上，本发明还提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒 中包括容器以及位于所述容器中的上述本发明引物对。

在具体的实施方式中，本发明的PCR试剂盒还装有用于实施PCR的其它所 需成分，例如探针，以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。在优选的实 施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。

在本发明的引物对的基础上，本发明提供利用本发明的引物对扩增目标产 物的PCR方法。

本发明的优点包括:

1.本发明的引物对或检测试剂能够高度灵敏地检测小鼠细胞基因组 DNA；

2.本发明的引物对或检测试剂能够区分真核宿主细胞，例如CHO细胞、 Vero细胞，毕赤酵母菌、大鼠细胞，特别是人类干扰性DNA以及原核宿主细胞， 例如大肠杆菌的干扰性DNA；

3.本发明的检测方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料与方法

1.DNA检测体系：

2x Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg²⁺、本发明引物及探针等成分。

掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液

2.检测仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪。

3.检测过程

准备工作：

1)用DNA稀释液将30ng/μl的DNA定量参考品进行梯度稀释，浓度依次为 300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl。

2)按照试剂盒说明书操作步骤将样本纯化，得到模板。

检测体系：每反应孔17μl qPCR reaction buffer+3μl NS0primer&probe mix +10μl DNA标准曲线。

检测程序：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

实施例1.本发明引物对的设计及标准曲线检验

发明人根据SEQ ID NO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：

正向引物：CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA(SEQ ID NO:2)；

反向引物：GCCTG GCAAATACAGAAGTGG(SEQ ID NO:3)；

探针：AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT(SEQ ID NO:5)；

扩增片段： CCCCTTCAGCTCCTTGGGTACTTTCTCTAGCTCCTCCACTAG GGGCCCTGTGTTCTATCCAATAGATGACTGTGAGCATCCACTTCTGTATTT GCCAGGC(SEQ ID NO:4)。

发明人通过qPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，

qPCR体系为：17μl qPCR reaction buffer+3μl NS0primer&probe mix+10 μlDNA标准曲线、。

DNA标准曲线为：300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl。

实验结果如图1和图2所示。其中图1是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出 明显的指数增长期。图2是参考品标准曲线。由图2可知，当参考品浓度为300 pg/μl～3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.44，相关系数(R²)＝0.999，扩增 效率为95.3％。标准曲线线性良好。

实施例2.灵敏度检验

基于实施例1中的qPCR体系，将NS0DNA定量参考品稀释到1fg/μl、0.3 fg/μl、0.1fg/μl，并进行qPCR反应。

实验结果如图3和图4所示，在0.3fg/μl仍可检出，其Ct值为35左右。其检测 灵敏度可达到0.3fg/μl。

实施例3.超声破碎实验

DNA碎片化实验步骤：

1)将超声清洗机(舒美KQ-500DE)注水5cm，水温设置成25℃，功率设 置成100％(即500W)。取30ng/μl的DNA参考品20μl加入0.2mlPCR管，共准备5 管。

2)其中1管作为对照组，余下4管分别依次放入超声清洗机中进行超声，时 间分别为10s、1min、10min、30min，获得一系列碎片化程度不同的DNA。

3)将这5管DNA片段分别进行梯度稀释，稀释成300pg/μl、30pg/μl、3 pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl，进行qPCR检测。

4)将这5管DNA各取10μl，进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳时长为30min， 电压100V。

结果如图5-11所示，证明显示DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影 响。

实施例4.本发明引物对的特异性检验

在本实施例中，利用本发明的上述引物对进行了抗干扰实验：

选取六种常见细胞的DNA(CHO、E.coli、vero、pichia、Hcc827、rat)，分 别稀释成300pg/μl，进行qPCR检测。

实验结果如图12-13所示。从产生的曲线可以看出，CHO细胞DNA、大肠 杆菌DNA、毕赤酵母菌DNA、vero细胞DNA、Hcc827DNA、大鼠细胞DNA对 本发明的引物对(SEQ ID NO:2和3所示)的检测结果明显没有造成影响。该引 物对具备优异的特异性。

实施例5.本发明引物对的适用性

在本实施例中，利用中检院单抗室提供的NS0生产重组蛋白的各个工艺点 的样品，对本发明的引物对的适用性进行检测。

1)取100μl待检测样本到1.5ml干净的离心管中，加入10μl蛋白酶K和100 μl蛋白酶K缓冲液，振荡混匀后，55℃水浴1小时。

2)从水浴中取出样本后加入200μl结合液、200μl异丙醇、10μl磁珠。置 于漩涡震荡器上振荡5min，静置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离 后，移去上清。

3)加入700μl洗涤液A，振荡使磁珠和洗涤液A混匀，将离心管重置于磁性 分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，移去上清。

4)加入700μl洗涤液B，振荡使磁珠和洗涤液B混匀，将离心管重置于磁性 分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，移去上清。

5)置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，将残余液体吸除干净。

6)打开管盖在室温下干燥3～5min，除去残留的乙醇。

7)加入50μl洗脱液，70℃水浴7min。

8)静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，转移溶液到干净的离心管中。所 得液体即为模板。

第一次检测结果如下表所示：

样本编号	样本检测值(pg/μl)	样本Ct
			A	1.031×10<sup>4</sup>	7.089
B	2.227×10<sup>3</sup>	9.395
			C	4.885	18.632
D	2.833	19.455
			E	9.152×10<sup>-3</sup>	28.095
F	6.887×10<sup>-3</sup>	28.523
			G	6.198×10<sup>-3</sup>	28.684
H	4.026×10<sup>-3</sup>	29.334
			I	2.635×10<sup>-3</sup>	29.971

以上实验结果说明随著纯化工艺流程从上往下，其DNA的残留量越来越 少，与实际情况完全相符；在最终产物中的DNA残留量符合标准要求。

本发明所用的序列总结于下表：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国食品药品检定研究院

中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心

湖州申科生物技术有限公司

<120> 检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法

<130> P2017-1015

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2168

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acctgaagtt tatcttcgag tattgttcgg acatcccttt gactcctgga accgtctcat 60

gcggcagttg ggcctcacag acaatcaaat ccaaatggtc aaagccgaaa cactggtcac 120

acgtgaggcc ctgtaccaaa tgctgctcaa gtggcgccac cagactgggc gaagtgcctc 180

catcaaccat ctgctggatg ccttggaagc cgtggaagag agagatgcca tggagaaaat 240

tgaagactac gcagtgaaat ccgggaggtt tacttatcag aacgctgcag cccaaccaga 300

gacagggcca ggaggatctc agtgcgtttg aagtcagcct gatctactta gtgaactcag 360

gacagccaag gctatgtaga gagccccgaa gatgcaggct cttcagtatt atgagaatgt 420

acttaatttt ttcttgtagt agttagtgta tcatattatt gtattattta tattattact 480

gttaagtact atgttctctt attagaagtt gaacacagaa cctctgagaa cacatatgct 540

acaagtgttc taacacacct ccagcatccc ggattacctt tgttcctgaa caaggcacaa 600

ttggtagggt atgatagggc ctgcctatca tcctaacact ccggtgatgg agccaggaag 660

atcaagagtt cgaggccagc tggttcacat aagatcccat ataatgtgca ggatggctaa 720

acttgctgag agctgactct gtggtctcct gtcccagatt ctagcgatat tcattactaa 780

gacccttgtc cagagacaaa agaccacctc tgtaacagag ggaagaataa aacagcccta 840

gggtggaaac tccttgtgaa cacagccact gctgtttact gttagactac tgctcagcac 900

tacacagctg cacggcacct ccctgtgcca ggtgctagtg ggcagcctac tgagggtaca 960

tctaacttga atctaacaca cttgaagtga gtttgctggt ttggacacag agggagcatt 1020

aagtgctacc tggggtgacc cttgaggacc acgccccctg taagcatttg accattgtga 1080

gagtaaacac tgaaactcac cattgtcctg cctcagcctt tctagagctg gaatcatagg 1140

tatgctgcac cggatccaga aggagaaata actaccttta gatactgtga tagggatttc 1200

tagaaagctg ccacatacag atttttgtcc tgtgtgaatt cctattgttt tttgtttgtt 1260

tttaattttt tattatttat tttcttcatt cacatttcaa atgctatccc aaaagtcccc 1320

tatgccctcc ccccccctgc cccccgccct gctcccctac ccactcactc actcccactt 1380

tttttttttt ttttgagaca gggtttctct gtgtagccct ggctgtcctg gaactcactc 1440

tgtagaccag gctggcctcg aactcagaaa ttcacctgcc tctgcctccc aagtgctggg 1500

attaaaggtg tgtgccacca tgcccggcct tttttttttt tttttaatta ggtatttatt 1560

tcatttaaat ttccaatgct atcccaaaag tcccccacat gctcccccac ccactcccca 1620

cctgacttta tatgcctcac tcccacttct tggccctggt gttcccctgt actggggcat 1680

ataacgtttg caagaccaag gggcgtctct ttccactgat ggccgactag gccatcttct 1740

gatacatatg cagctagaga cacgagctct gggggggtac tggttagttc atattgttgt 1800

tccacctata gggttgccga ccccttcagc tccttgggta ctttctctag ctcctccact 1860

aggggccctg tgttctatcc aatagatgac tgtgagcatc cacttctgta tttgccaggc 1920

actggcatag cctcatacga gacagctata tcagggtcca gttttgtttt gttttgtttt 1980

aaactagcat gctggagagg tagctcagcg gttaagagca gtggctgctc ttccagaggt 2040

cctgagttcc aattcccagc agctacatag tggctcacaa ccttctctaa tgggatctga 2100

tgtccttttc tagtgtgttt gaagccagtg gcagtgtaat tacatacaca aaataaataa 2160

atcttttt 2168

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccttcagc tccttgggta 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctggcaaa tacagaagtg g 21

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccccttcagc tccttgggta ctttctctag ctcctccact aggggccctg tgttctatcc 60

aatagatgac tgtgagcatc cacttctgta tttgccaggc 100

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agggccccca atggaggagc t 21

Claims (9)

1.一种检测小鼠细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1821-1840位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第1900-1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示。

3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。

4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示。

5.如权利要求3或4所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含探针。

6.一种检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

7.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1或2所述的引物对。

8.一种PCR方法，包括步骤：

在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对扩增目标产物。

9.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在小鼠细胞DNA。