JPWO2019240073A1 - 定量ｐｃｒプローブ - Google Patents

定量ｐｃｒプローブ Download PDF

Info

Publication number
JPWO2019240073A1
JPWO2019240073A1 JP2020525550A JP2020525550A JPWO2019240073A1 JP WO2019240073 A1 JPWO2019240073 A1 JP WO2019240073A1 JP 2020525550 A JP2020525550 A JP 2020525550A JP 2020525550 A JP2020525550 A JP 2020525550A JP WO2019240073 A1 JPWO2019240073 A1 JP WO2019240073A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
human
sequence
quantitative pcr
probe
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2020525550A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7410023B2 (ja
Inventor
山本　俊輔
俊輔 山本
松本　真一
真一 松本
英樹 平林
英樹 平林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPWO2019240073A1 publication Critical patent/JPWO2019240073A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7410023B2 publication Critical patent/JP7410023B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】ヒト以外の動物に移植または投与されたヒト細胞を検出することのできる新規の手段として、ｑＰＣＲ用のプローブ等を提供する。【解決手段】ヒトLINE-1遺伝子に由来する所定の塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列と、標識部分とを含む、定量ＰＣＲプローブ。当該定量ＰＣＲプローブは、さらにヒトLINE-1に由来するフォワードプライマーおよびヒトLINE-1に由来するリバースプライマーを含む（各配列は所定の位置関係にある）定量ＰＣＲキットの作製などに利用することができる。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、定量ＰＣＲ（polymerase chain reaction）（ｑＰＣＲ）プローブ、ｑＰＣＲキット、および当該キットを用いた検出方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒト以外の動物（代表的には、げっ歯類（マウス、ラット等）、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類等、中でも非ヒト霊長類、とりわけマカク属に分類される動物（例えば、カニクイザル））に移植されたヒト細胞を検出するための、ｑＰＣＲ用のプローブ、キットおよび検出方法に関する。
［発明の背景］
各種の疾患の治療の一環として、ヒト由来の幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞））から分化誘導により所望の細胞または組織を作製して患者に移植する、再生医療の研究開発が進められている。その研究開発において、ヒトを対象とする臨床試験に先だち、実験動物を対象として、上記ヒト由来の幹細胞から分化誘導された細胞等を移植する非臨床試験（前臨床試験）が行われるが、その際に移植されたヒト由来の細胞が実験動物の生体内でどのような挙動を示すか、かつ／あるいはどのように分布するかが分析項目の一つになっている。そのような実験動物として、非ヒト霊長類の一種であるカニクイザル（Macaca fascicularis）は、比較的ヒトに近いゲノムを有していることから多くの国において使用されている。
特許文献１には、ＰＣＲ用の特定の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ヒト以外の動物に移植されたヒト細胞の発現を検出するために使用することのできる、検出キットが記載されている。他方で、特許文献１の比較例には、ヒト特異的でカニクイザルには存在しないＤＵＦ１２２０配列を増幅するプライマーとプローブを用いても、カニクイザルのみのサンプル中でＤＮＡの増幅が観察され、カニクイザルにおいてヒト細胞を特異的に検出できなかったことが記載されている。
非特許文献１（図４等）には、LINE-1エレメント（遺伝子）には、Ｔａ−１およびＴａ−０を含むＴａファミリーが存在すること、このＴａファミリーはヒトに特異的である（ヒトの配列と、類人猿、旧世界ザル、新世界ザルなどの配列とが相違する）ことなどが記載されている。しかしながら、ヒトとその近縁種とで相違する塩基配列の全てが、ｑＰＣＲ用のプローブ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして利用できるとは限らない。非特許文献１は、進化の過程においてＴａファミリーの塩基配列がヒトに特異的なものとなり、類人猿等と異なる塩基配列になったことを開示しているにすぎず、Ｔａファミリーの塩基配列のどの部分が、ｑＰＣＲ用のプローブやプライマーに適しているかについては何も記載していない。
特開２０１７−１８０１１号公報
Boissinot et al., "LI (LINE-1) Retrotransposon Evolution and Amplification in Recent Human History", Mol. Biol. Evol. 17(6):915-928. 2000.
本発明は、ヒト以外の動物に移植または投与されたヒト細胞を検出することのできる、ｑＰＣＲ用のプローブ、キット、検出方法などを提供することを課題とする。
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［７］を提供する。
［１］
ヒトLINE-1遺伝子に由来する配列番号１で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、または
ヒトLINE-1遺伝子に由来する配列番号２で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、
および標識部分を含む、定量ＰＣＲプローブ。
［２］
前記標識部分が、蛍光物質と該蛍光物質に対応するクエンチャーの組み合わせである、項［１］に記載の定量ＰＣＲプローブ。
［３］
項[１]に記載の定量ＰＣＲプローブ；
ヒトLINE-1に由来するフォワードプライマー；および
ヒトLINE-1に由来するリバースプライマー；
を含み、ヒトLINE-1遺伝子の塩基配列上で、該定量ＰＣＲプローブ配列を挟むように該フォワードプライマーの配列と該リバースプライマーの配列が選択される、定量ＰＣＲキット。
［４］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（5' to 3' exonuclease activity）を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、項［３］、［６］または［７］に記載のキット。
［５］
項［３］、［６］または［７］に記載の定量ＰＣＲキットを使用する、ヒト細胞を移植または投与された非ヒト動物におけるヒト細胞の検出方法。
［６］
項［３］に記載の定量ＰＣＲキットであって、
定量ＰＣＲプローブが、下記（Ｐ１）〜（Ｐ４）のいずれかのオリゴヌクレオチドと標識部分（好ましくは、ＦＡＭ（より好ましくは、５−カルボキシフルオレセイン）とＮＦＱ−ＭＧＢとの組み合わせ）によって形成されるもの（好ましくは（Ｐ１））：
（Ｐ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ２）配列番号３の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）中の、配列番号３と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ３）配列番号３の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり該プローブがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｐ４）配列番号３の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド；であり、
フォワードプライマーが、下記（Ｆ１）〜（Ｆ４）のいずれかのオリゴヌクレオチドによって形成されるもの（好ましくは（Ｆ１））：
（Ｆ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ２）配列番号４の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）中の、配列番号４と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ３）配列番号４の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり該フォワードプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｆ４）配列番号４の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド；であり、かつ
リバースプライマーが、下記（Ｒ１）〜（Ｒ４）のいずれかのオリゴヌクレオチドによって形成されるもの（好ましくは（Ｒ１））：
（Ｒ１）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ２）配列番号５の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）中の、配列番号５と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ３）配列番号５の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり該リバースプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｒ４）配列番号５の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド；である、定量ＰＣＲキット。
［７］
項［３］に記載の定量ＰＣＲキットであって、
定量ＰＣＲプローブが、下記（Ｐ５）〜（Ｐ８）のいずれかのオリゴヌクレオチドと標識部分（好ましくは、ＦＡＭ（より好ましくは、５−カルボキシフルオレセイン）とＮＦＱ−ＭＧＢとの組み合わせ）によって形成されるもの（好ましくは（Ｐ５））：
（Ｐ５）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ６）配列番号６の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）中の、配列番号６と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ７）配列番号６の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり該プローブがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｐ８）配列番号６の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド；であり、
フォワードプライマーが、下記（Ｆ５）〜（Ｆ８）のいずれかのオリゴヌクレオチドによって形成されるもの（好ましくは（Ｆ５））：
（Ｆ５）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ６）配列番号８の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）中の、配列番号８と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ７）配列番号８の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり該フォワードプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｆ８）配列番号８の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド；であり、かつ
リバースプライマーが、下記（Ｒ５）〜（Ｒ８）のいずれかのオリゴヌクレオチドによって形成されるもの（好ましくはＲ５）：
（Ｒ５）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ６）配列番号７の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）中の、配列番号７と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ７）配列番号７の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり該リバースプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｒ８）配列番号７の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド；である、定量ＰＣＲキット。
本発明のｑＰＣＲ用のプローブ、キット、検出方法などを使用することにより、ヒト細胞を移植または投与されたヒト以外の動物から採取されたサンプル中のヒト細胞を、ＰＣＲを用いて経時的に定量し検出することができる。
図１Ａは、ヒト細胞溶解液を含むカニクイザル大脳皮質サンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡの増幅曲線を示す。縦軸（ΔRn）は、ＰＣＲ反応生成物量を示し、蛍光強度の対数で表されている。横軸（Cycle Number）は、ＰＣＲ反応のサイクル数を示す。図中の横線（Threshold）は、ＰＣＲ反応生成物が指数関数的に増殖されている領域に引かれている。（図１Ｃ、図２Ａ、図２Ｃ、図３Ａにおいても同様である。）増幅曲線近傍の数値は、その増幅曲線が、それぞれの数に相当するヒト細胞の溶解液を添加したサンプルについてのものであることを表す。（図２Ａにおいても同様である。） 図１Ｂは、ヒト細胞溶解液を含むカニクイザル大脳皮質サンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡの検量線を示す。縦軸（Ct値）は、ＰＣＲ反応サイクル数を示し、増幅曲線とThresholdの交点を示す。横軸（Quantity）は、サンプルに添加したヒト細胞数を示す。（特に述べない限り、図２Ｂ、図３Ｂにおいても同様である。） 図１Ｃは、カニクイザル大脳皮質サンプル（ヒト細胞溶解液を含まない）におけるカニクイザルゲノムＤＮＡの増幅曲線を示す。 図２Ａは、ヒト細胞溶解液を含むマウス血液サンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡの増幅曲線を示す。 図２Ｂは、ヒト細胞溶解液を含むマウス血液サンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡの検量線を示す。 図２Ｃは、マウス血液サンプル（ヒト細胞溶解液を含まない）におけるマウスゲノムＤＮＡの増幅曲線を示す。 図３Ａは、カニクイザル肝臓サンプルから抽出したサルゲノムＤＮＡサンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡの増幅曲線を示す。 図３Ｂは、カニクイザル肝臓サンプルから抽出したサルゲノムＤＮＡサンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡの検量線を示す。横軸（Quantity）は、PCRウェル中に添加したヒトゲノムDNAの重さ(ng)を示す。
ヒトLINE-1（「Long interspersed nucleotide factor-1」、「Long interspersed nuclear elements-1」ともいう）遺伝子の塩基配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）において、所定のアクセッション番号（Accession No.）により登録されている（例えば、GenBankアクセッション番号：KP237032.1、GenBankアクセッション番号：JN698885.1、GenBankアクセッション番号：GU477637.1等）。ヒトLINE-1遺伝子には多くのファミリーが存在するが、本明細書において「ヒトLINE-1遺伝子」とは、上記の例示した以外のファミリー遺伝子も包含し、本発明で規定する定量ＰＣＲプローブ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計できるものであれば、どの塩基配列のヒトLINE-1遺伝子であってもよい。
本明細書において、LINE-1遺伝子に関して用いられる「アンチセンス鎖」とは、ＤＮＡの二本鎖のうち、LINE-1タンパク質（ORF（Open Reading Frame）1およびORF2）のｍＲＮＡが合成される際に鋳型となる塩基配列を有するＤＮＡ鎖を指す。
本明細書において、LINE-1遺伝子に関して用いられる「センス鎖」とは、上記LINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖を指す。
［定量ＰＣＲプローブ］
本発明における第１の定量ＰＣＲプローブ（本明細書において「第１プローブ」と呼ぶ。）は、LINE-1遺伝子に由来する（アンチセンス鎖上の）配列番号１で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列（本明細書において「第１プローブ配列」と呼ぶ。）と、標識部位とを含む。この第１プローブは、同じくアンチセンス鎖上に結合する、後述する本発明のフォワードプライマー（および、任意で、センス鎖上に結合する、後述する本発明のリバースプライマー）と組み合わせて使用されるものである。
配列番号１：5'-CCATTACTGGGTATATACCCAAATGAGTATAAATCATGCTGCTATAAAGACACATGCACACGTATGTTTATTGCGGCACTATTCACAATAGCAAAGACTTGGAACCAACCCAAATGTCCAACAATGATAGACTGGATTAAGAAAATGTGGCACATATACACCATGGAATACTATGCAGCCATAAAAAATGATGAGTTCATATCCTTTGTAGGGACATGGATGAAATTGGAAACCATCATTCTCAGTAAACTATCGCAAGAACAAAAAACCAAACACCGCATATTCTCACTCATAGGTGGGAATTGAACAATGAGATCACATGGACACAGGAAGGGGAATATCACACTCTGGGGACTGTGGTGGGGTTGGGGGAGGGGGGAGGGATAGTATTGGGAGATATACCTAATGCTAGATGACACATTAGTGGGTGCAGCGCACCAGCATGGCACATGTATACATATGTAACTAACCTGCACAATGTGCACATGTACCCTAAAACTTAGAGTAT-3'
本発明における第２の定量ＰＣＲプローブ（本明細書において「第２プローブ」と呼ぶ。）は、LINE-1遺伝子に由来する（センス鎖上の）配列番号２で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列（本明細書において「第２プローブ配列」と呼ぶ。）と、標識部位とを含む。この第２プローブは、同じくセンス鎖上に結合する、後述する本発明のリバースプライマー（および、任意で、アンチセンス鎖上に結合する、後述する本発明のフォワードプライマー）と組み合わせて使用されるものである。
配列番号２：5'-ATACTCTAAGTTTTAGGGTACATGTGCACATTGTGCAGGTTAGTTACATATGTATACATGTGCCATGCTGGTGCGCTGCACCCACTAATGTGTCATCTAGCATTAGGTATATCTCCCAATACTATCCCTCCCCCCTCCCCCAACCCCACCACAGTCCCCAGAGTGTGATATTCCCCTTCCTGTGTCCATGTGATCTCATTGTTCAATTCCCACCTATGAGTGAGAATATGCGGTGTTTGGTTTTTTGTTCTTGCGATAGTTTACTGAGAATGATGGTTTCCAATTTCATCCATGTCCCTACAAAGGATATGAACTCATCATTTTTTATGGCTGCATAGTATTCCATGGTGTATATGTGCCACATTTTCTTAATCCAGTCTATCATTGTTGGACATTTGGGTTGGTTCCAAGTCTTTGCTATTGTGAATAGTGCCGCAATAAACATACGTGTGCATGTGTCTTTATAGCAGCATGATTTATACTCATTTGGGTATATACCCAGTAATGG-3'
「定量ＰＣＲ」（本明細書において「ｑＰＣＲ」と記載することもある。）はリアルタイムＰＣＲとも呼ばれ、ＰＣＲの改良法であって、試料中の目的遺伝子のコピー数を経時的に測定して定量する方法である。ｑＰＣＲは当業者にとって周知慣用（例えば、Stephen A. Bustin編集 A-Z of Quantitative PCR参照）であり、その基本的な技術的事項は当業者にとって技術常識となっており、本発明にも適用することができる。
典型的な定量ＰＣＲの実施形態として、蛍光標識を利用することによりＰＣＲ増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし、解析する「リアルタイム定量ＰＣＲ」が挙げられる。リアルタイム定量ＰＣＲの例としては、蛍光物質（および当該蛍光物質に対応するクエンチャー）で標識されたプローブを用いる蛍光プローブ法（例えばＴａｑＭａｎ法、モレキュラービーコン法、サイクリングプローブ法）が挙げられる（例えば、Stephen A.Bustin編集 A-Z of Quantitative PCR参照）。
本発明の定量ＰＣＲプローブを、ＴａｑＭａｎ法、モレキュラービーコン法、サイクリングプローブ法などのリアルタイム定量ＰＣＲに適した実施形態とするための基本的な技術的事項、例えば、定量ＰＣＲプローブの塩基配列の設計や、標識部分の設計、ＰＣＲの条件については、従来のリアルタイム定量ＰＣＲ（上記の各方法）に準じたものとすることができる。また、リアルタイム定量ＰＣＲを行うために、Thermo Fisher Scientific、タカラバイオ株式会社などから販売されている、酵素（例、ＤＮＡポリメラーゼ）、試薬（例、バッファー）、これらの酵素および／または試薬を含むキット（例、TaqPath ProAmp Master Mixes（Thermo Fisher Scientific））、装置（例、7900HT Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）、QuantStudio 7（Thermo Fisher Scientific））も利用可能である。
本発明の第１プローブ配列および第２プローブ配列（本明細書において、これらを「本発明の定量ＰＣＲプローブ配列」と総称する。）は、それぞれ配列番号１または２で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基、好ましくは１３〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列である。
本明細書において、「ハイブリダイズ可能」とは、定量ＰＣＲにおいて本発明の定量ＰＣＲプローブが実際に使用される工程（またはそれを想定した条件下）においてハイブリダイズすることができ、その結果、定量ＰＣＲの増幅曲線および検量線から試料中のヒト細胞のゲノムＤＮＡを所望の精度で定量することが可能であることを意味する。換言すれば、高い厳密性（高ストリンジェンシーの条件下）で、目的とする塩基配列に特異的に結合（ハイブリダイゼーション）し、それ以外の塩基配列には結合しないことを意味する。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。
「高ストリンジェンシーの条件下」とは、ある塩基配列の相補鎖配列を有する核酸と、オーバーラップする領域において約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相補性を有する塩基配列を有する核酸とがハイブリダイズし得る条件をいい、温度の場合は、約５０〜７０℃、好ましくは約５０〜６５℃が挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
本発明の１つの実施形態では、本発明の定量ＰＣＲプローブ配列は、標的となる配列に高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ可能であれば、標的配列に対してミスマッチな塩基対を（例えば、５塩基以下、好ましくは３塩基以下、より好ましくは１塩基）含んでいてもよい。
本発明の別の実施形態では、本発明の定量ＰＣＲプローブ配列は、標的となる配列に高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ可能であれば、標的となる配列に１００％相補的な配列と比べて、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上の同一性を有する塩基配列であってもよい。
本明細書において、「同一性」は「相同性」と同義に用いられる。塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、BLASTNやBLASTX（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）などが挙げられる。これらのプログラムは、それぞれのデフォルトパラメーターを用いることができる。
本発明の定量ＰＣＲプローブ配列は、定量ＰＣＲの実施形態に応じたオリゴヌクレオチドにより形成することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ法、モレキュラービーコン法などに用いられるプローブのオリゴヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）によって構成されるＤＮＡプローブである。一方、サイクリングプローブ法に用いられるプローブのオリゴヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）によって構成されるＤＮＡと、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）によって構成されるＲＮＡとが連結した、キメラプローブ（オリゴヌクレオチド）である。その他、必要に応じて、修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ（locked nucleic acids））を利用することもできる。なお、これらの修飾ヌクレオチドは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計する際にも用いることもできる。
本発明の定量ＰＣＲプローブ配列（第１プローブ配列および第２プローブ配列）は、ヒトLINE-1遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、その適切な位置および長さの塩基配列（配列番号１または２）に結合し、定量ＰＣＲによって生じた増幅産物を標識するよう、設計することができる。特に、第１プローブ配列および第２プローブ配列はそれぞれ、ヒトのLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖およびセンス鎖に特異的であって、検体を採取する非ヒト動物のLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖およびセンス鎖には存在しない塩基配列を標的とするものであることが適切である。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の第１プローブ配列は、標的とする塩基配列にハイブリダイズ可能な、下記（Ｐ１）〜（Ｐ４）のいずれかによって形成されるもの（好ましくは（Ｐ１））である：
（Ｐ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ２）配列番号３の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）中の、配列番号３と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ３）配列番号３の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり第１プローブがハイブリダイゼーションの標的とするLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｐ４）配列番号３の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の第２プローブ配列は、標的とする塩基配列にハイブリダイズ可能な、下記（Ｐ５）〜（Ｐ８）のいずれかによって形成されるもの（好ましくは（Ｐ５））である：
（Ｐ５）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ６）配列番号６の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）中の、配列番号６と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｐ７）配列番号６の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり第２プローブがハイブリダイゼーションの標的とするLINE-1遺伝子のセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｐ８）配列番号６の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
本発明の定量ＰＣＲプローブに含まれる標識部分は、定量ＰＣＲの実施形態に応じたものとすることができる。例えば、ＴａｑＭａｎ法、モレキュラービーコン法、サイクリングプローブ法などに用いられる定量ＰＣＲプローブはいずれも、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の原理に基づく標識部分を含み、その標識部分は、プローブオリゴヌクレオチドの5’末端に連結された蛍光物質と、プローブオリゴヌクレオチドの3’末端に連結された（当該蛍光物質に対応する）クエンチャーとによって構成される。ＦＲＥＴに利用できる蛍光物質およびクエンチャーの組み合わせは多種多様であり、定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を行う装置の励起波長および検出波長に適合するものを選択することができる。
蛍光物質の例としては、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＦＡＭ（例、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＪＯＥ、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチル−ローダミン）、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる（いずれの蛍光物質もThermo Fisher Scientificなどから市販品を入手可能）。
クエンチャーの例としては、ＴＡＭＲＡ、ＩＢＲＱ、ＢＨＱ１、ＮＦＱ−ＭＧＢなどが挙げられる。（いずれのクエンチャーもThermo Fisher Scientificなどから入手可能）。
上記蛍光物質は組み合わせによっては、クエンチャーとしても作用し得る。また、上記クエンチャーのうち、蛍光特性を有するものは、蛍光物質としても作用し得る。当業者であれば、ある物質を蛍光物質として採用した場合、その物質に対するクエンチャーを適宜選択することができる。
本発明の1つの好ましい実施形態では、ＦＡＭ（より好ましくは、５−カルボキシフルオレセイン）（蛍光物質）とＮＦＱ−ＭＧＢ（クエンチャー）の組み合わせが標識部分として用いられる。
なお、定量ＰＣＲには、リアルタイムで結果を出すものではないが、アガロースゲル電気泳動法、サザンブロッティング法のように、ＰＣＲ増幅産物に含まれる標識物質に由来するシグナルの強度から、試料中の目的遺伝子のコピー数を定量的に測定しようとする方法もある。本発明の定量ＰＣＲプローブは、そのようなリアルタイムではない定量ＰＣＲ（非リアルタイム定量ＰＣＲ）において使用することも可能である。非リアルタイム定量ＰＣＲに用いる場合、本発明の定量ＰＣＲプローブに含まれる標識部分としては、一般的なアガロース電気泳動法、サザンブロッティング法などで用いられているものと同様の標識部分、例えば蛍光物質（例、リアルタイム定量ＰＣＲ用の本発明の定量ＰＣＲプローブに含まれるものと同様の蛍光物質、蛍光タンパク質等）、発光物質（例、ルテニウム、発光タンパク質等）、酵素（例、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などを含む標識部分が挙げられる。
「非ヒト動物」は、ヒト以外の動物、典型的にはヒト細胞が移植または投与される実験動物（疾患モデル動物を含む）全般を指す。そのような実験動物としては、例えば、非ヒト霊長類（マーモセット、カニクイザル、アカゲザル、フサオオマキザル、チンパンジー等）、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラット等）等が挙げられる。非ヒト霊長類（霊長目）には、チンパンジー（亜族）、ゴリラ（族）、オランウータン（亜科）、テナガザル（科）、オナガザル（上科、科）、クモザル（科）、メガネザル（科）、キツネザル（下目、科）などが挙げられる。オナガザル（オナガザル科のサル）としては、カニクイザル、アカゲザル、ニホンザル等のマカク属のサルが挙げられる。
本発明の好ましい実施形態において、非ヒト動物は、カニクイザルまたはそれよりも分類学上ヒトから遠縁の動物である。非ヒト霊長類（霊長目）のサルうち、クモザル、メガネザル、キツネザル等は「カニクイザルよりも分類学上ヒトから遠縁の動物」に該当する。また、霊長類（霊長目）以外の目に属する動物も「カニクイザルよりも分類学上ヒトから遠縁の動物」である。逆に言えば、狭鼻猿類のうち、カニクイザル等の属するオナガザル上科ではなく、ヒトと同じくヒト上科に属するテナガザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー等は「カニクイザルよりも分類学上ヒトから遠縁の動物」には該当しない。
本発明の他の好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ヒトの塩基配列との相同性が、ヒトとカニクイザルの間の相同性よりも低いもの、具体的には、ヒトLINE-1遺伝子中の本発明の定量ＰＣＲプローブ（ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー）が標的とする部分の塩基配列との相同性が、当該ヒトLINE-1遺伝子中の標的部分の塩基配列とそれに対応するカニクイザルLINE-1遺伝子中の部分の塩基配列の間の相同性よりも低い動物である。
［定量ＰＣＲキット］
本発明の定量ＰＣＲキットは、本発明の定量ＰＣＲプローブ、ヒトLINE-1に由来するフォワードプライマー、およびヒトLINE-1に由来するリバースプライマーを含み、必要に応じてさらに、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（5' to 3' exonuclease activity）を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびその他の定量ＰＣＲ用の試薬（例えば、５０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０倍濃度の標準的なＰＣＲバッファー）、器具、説明書等を含んでいてもよい。
本発明の定量ＰＣＲキットにおいて、定量ＰＣＲプローブは、第１プローブのみを用いてもよいし、第２プローブのみを用いてもよいし、第１プローブと第２プローブの両方を組み合わせて用いてもよい。
「ヒトLINE-1に由来するフォワードプライマー」は、ヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖中の所定の配列にハイブリダイズ可能な配列（本明細書において「フォワードプライマー配列」と呼ぶ。）からなるオリゴヌクレオチドによって形成される。
「ヒトLINE-1に由来するリバースプライマー」は、ヒトLINE-1遺伝子のセンス鎖中の所定の配列にハイブリダイズ可能な配列（本明細書において「リバースプライマー配列」と呼ぶ。）からなるオリゴヌクレオチドによって形成される。
フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が結合する「所定の配列」は、ヒトLINE-1遺伝子の塩基配列上で、本発明の定量ＰＣＲプローブが結合する配列を挟むように位置する。例えば、本発明の第１プローブの実施形態では、ヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖において、フォワードプライマーが結合（ハイブリダイズ）する配列を「ｆ」、本発明の定量ＰＣＲプローブが結合する配列を「ｐ」、リバースプライマーが結合するセンス鎖における配列と相補的な配列を「ｒ」とした場合、ヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖の３’側から５’側に向かって配列ｆ、配列ｐおよび配列ｒが並ぶようにする。本発明の第２のプローブの実施形態でも、本発明の定量ＰＣＲプローブが結合するセンス鎖における配列と相補的な配列を「ｐ’」として、ヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖の３’側から５’側に向かって配列ｆ、配列ｐ’および配列ｒが並ぶようにする。
フォワードプライマーおよびリバースプライマーはいずれも２種類を用いる（２種類のフォワードプライマーを用いる、または２種類のリバースプライマーを用いる）ことができる。２種類のフォワードプライマーがハイブリダイズするアンチセンス鎖における配列の位置関係（間隔や、重複の有無）は定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）の実施形態に応じて適宜設定することができる。２種類のリバースプライマーがハイブリダイズするセンス鎖における配列の位置関係についても同様である。
フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列は、ヒトLINE-1遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、その適切な位置および長さの塩基配列（所定の配列）に結合し、定量ＰＣＲによって増幅産物を生じるよう、設計することができる。特に、フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列はそれぞれ、ヒトのLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖およびセンス鎖に特異的であって、検体を採取する非ヒト動物のLINE-1遺伝子には存在しない塩基配列を標的とするものであることが適切である。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の第１プローブ配列と組み合わせるフォワードプライマーは、標的とする塩基配列にハイブリダイズ可能な、下記（Ｆ１）〜（Ｆ４）のいずれかによって形成されるもの（好ましくは（Ｆ１））である：
（Ｆ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ２）配列番号４の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）中の、配列番号４と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ３）配列番号４の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり第１プローブ配列と組み合わせるフォワードプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｆ４）配列番号４の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の第２プローブ配列と組み合わせるフォワードプライマーは、標的とする塩基配列にハイブリダイズ可能な、下記（Ｆ５）〜（Ｆ８）のいずれかによって形成されるもの（好ましくは（Ｆ５））である：
（Ｆ５）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ６）配列番号８の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）中の、配列番号８と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｆ７）配列番号８の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり第２プローブ配列と組み合わせるフォワードプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のアンチセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｆ８）配列番号８の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の第１プローブ配列と組み合わせるリバースプライマーは、標的とする塩基配列にハイブリダイズ可能な、下記（Ｒ１）〜（Ｒ４）のいずれかによって形成されるもの（好ましくは（Ｒ１））である：
（Ｒ１）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ２）配列番号５の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）中の、配列番号５と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ３）配列番号５の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり第１プローブ配列と組み合わせるリバースプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｒ４）配列番号５の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の第２プローブ配列と組み合わせるリバースプライマーは、標的とする塩基配列にハイブリダイズ可能な、下記（Ｒ５）〜（Ｒ８）のいずれかによって形成されるもの（好ましくは（Ｒ５））である：
（Ｒ５）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ６）配列番号７の塩基配列が標的とする塩基配列（ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）中の、配列番号７と相補的な塩基配列）に対して、高ストリンジェンシーの条件（高い厳密性のハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（Ｒ７）配列番号７の塩基配列に対して１〜５塩基が相違する（つまり第２プローブ配列と組み合わせるリバースプライマーがハイブリダイゼーションの標的とするヒトLINE-1遺伝子のセンス鎖に対して１〜５塩基のミスマッチを有する）オリゴヌクレオチド；
（Ｒ８）配列番号７の塩基配列に対して７０％以上１００％未満の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
本発明の定量ＰＣＲキットが、定量ＰＣＲとしてＴａｑＭａｎ法を採用する実施形態におけるものである場合、当該キットは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Thermo Fisher Scientific、タカラバイオ株式会社、TOYOBO LIFE SCIENCE、NEW ENGLAND BioLabs等から入手可能）をさらに含むことができる。ＴａｑＭａｎ法では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、代表的にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーからＤＮＡ鎖を５’→３’方向に伸長させるとともに、その下流側に先に結合しているＴａｑＭａｎプローブ（本発明の定量ＰＣＲプローブに対応する）のヌクレオチドを５’→３’（5' to 3'）方向に分解し、それによって蛍光物質と（当該蛍光物質に対応する）クエンチャーとを解離させ、ＦＲＥＴによって抑制されていた蛍光を発するようにして、増幅産物が生成したことのシグナルとする。
［ヒト細胞の検出方法］
本発明のヒト細胞の検出方法は、ヒト細胞を移植または投与された非ヒト動物におけるヒト細胞を検出するための方法であって、本発明の定量ＰＣＲキット（定量ＰＣＲ用プローブ、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を使用して実施されるものである。すなわち、本発明のヒト細胞の検出方法は、ヒト細胞を移植または投与された非ヒト動物から採取された検体を用い、その検体から調製された試料を本発明の定量ＰＣＲキット（定量ＰＣＲ用プローブ、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）で処理する工程、より具体的には試料中のヒト細胞由来のゲノムＤＮＡまたはその増幅産物と、定量ＰＣＲ用プローブとのハイブリダイゼーション、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーとのアニーリングを行う工程を含む。本発明のヒト細胞の検出方法はさらに、定量ＰＣＲの増幅曲線および検量線から、試料中のヒト細胞の細胞数を定量する工程を含んでいてもよい。
本発明のヒト細胞の検出方法は、一般的な定量ＰＣＲに準じた実施形態とすることができる。例えば、検体の採取、検体からの試料の調製（ＤＮＡの抽出等）、定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）の各工程（熱変性、プライマーのアニーリングおよびプローブのハイブリダイゼーション等）の実施、増幅曲線および検量線の作成などのための手順やその際に用いる装置、試薬等は、基本的に従来の定量ＰＣＲと同様のものを適用することができる。
ヒト細胞の検出は、具体的には、ＰＣＲの反応生成物の量が所定の水準を超える、典型的には定量ＰＣＲにおける増幅曲線が所定の閾値（threshold）と交差することをもって確認することができる。定量ＰＣＲの増幅曲線が閾値に達しない場合、すなわちＰＣＲの反応生成物の量が不十分であれば、ヒト細胞は検出されないとみなすことができる。増幅曲線を、ヒト細胞数が既知の標準試料を用いて作成された検量線と対比すれば、試料中のヒト細胞数を定量する（定量的に検出する）ことができる。言い換えれば、閾値は、標準試料の増幅曲線との交点（Ｃｔ値）に基づき、ヒト細胞の検出（および好ましくは定量）が可能である検量線を作成できるよう、ＰＣＲ反応生成物量（それを反映する蛍光強度ΔRn等）の適切な値とすることができる。例えば、ヒト細胞を添加していない標準試料（ブランク試料）のＣｔ値と、定量下限（Lower Limit of Quantification: LLOQ）に相当する数のヒト細胞（例えば、使用するｑＰＣＲキットや機器によっても異なりうるが、１０個／５０μＬ（体液）または１５ｍｇ（組織））を添加した標準試料のＣｔ値との間隔が、１以上、２以上、または３以上となるよう、閾値を設定することができる。なお、ブランク試料、すなわちヒト細胞を全く含まない非ヒト動物由来の検体から調製した試料は、本発明の定量ＰＣＲプローブ（ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー）によって実質的にＰＣＲ反応生成物が増幅せず、閾値と交差しなくともよい。本発明の定量ＰＣＲプローブ（ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー）は、ヒトのLINE-1遺伝子の塩基配列を標的としそれに特異的なものとして設計することができるが、非ヒト動物のLINE-1遺伝子の塩基配列に対して非特異的にハイブリダイズし、ＰＣＲ反応生成物中に非ヒト動物由来のものが混在するとしても、その混在量が上述したように適切な検量線の作成にとって支障のない範囲であれば、そのような実施形態も本発明に包含することができる。
非ヒト動物から採取される検体は、定量ＰＣＲ用の試料を調製できるものであれば特に限定されるものではなく、様々な臓器、組織または細胞集団を検体とすることができる。検体を採取することのできる臓器としては、例えば、脳（例：嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質等の部位、全脳等）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例：大腸、小腸等）、血管、心臓、胸腺、牌臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節および骨格筋が挙げられ、それらの臓器に含まれる組織および細胞集団も検体とすることができる。検体は、癌化した組織または細胞集団であってもよい。
非ヒト動物に移植または投与されるヒト細胞は、上記のような非ヒト動物の臓器等に移植または投与され、定量ＰＣＲ用の試料の調製の際にヒトゲノムＤＮＡを抽出することができるものであれば特に限定されるものではない。そのようなヒト細胞としては、例えば、それぞれヒト由来の、牌細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞（例：骨格筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、筋衛星細胞）、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、巨核球）、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、間質細胞、卵細胞および精細胞、ならびにこれらの細胞に分化誘導可能な幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む）、前駆細胞、血球系細胞、卵母細胞、受精卵が挙げられる。さらに、ヒト細胞は、上記幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む）等をin vitroで分誘誘導して作製した上記ヒト由来細胞も含む。
下記の実施例１および２では、ヒトLINE-1遺伝子に対して設計した本発明の第１プローブとして、5'-FAM-(配列番号３)-NFQ-MGB-3'で示される構造を有するもの、すなわち配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、レポーター蛍光色素としてのFAM（５−カルボキシフルオレセイン、Thermo Fisher Scientific）およびそれに対応する非蛍光クエンチャーNFQ（Thermo Fisher Scientific）、ならびにMGB（Minor Groove Binder、Thermo Fisher Scientific）分子によって構成される、TaqManプローブを用いた。
配列番号３：5'-CACTAATGTGTCATCTAGCAT-3'
また、ヒトLINE-1遺伝子に対して設計したフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列番号４および配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号４：5'-CATGTGCCATGCTGGTGC-3'
配列番号５：5'-CCATTACTGGGTATATACCCAAATGAG-3'
［実施例１］カニクイザル脳サンプル中のヒト細胞由来ＤＮＡの増幅
15 mgのカニクイザルの大脳皮質を検体とし、そこに、それぞれ、10、100、1,000、10,000、および100,000細胞に相当するヒト細胞（末梢血Ｔ細胞、Cryo-T8: Human CD8+ Negatively Selected (5-8M cells)、Precision Bioservices社）を溶解したＡＴＬ溶液（70μＬ、DNeasy Blood & Tissue Kits、QIAGEN）を添加したサンプルと、ヒト細胞を添加していないＡＴＬ溶液（70μＬ）のみのサンプルを調製した。これらのサンプルのそれぞれから、市販のＤＮＡ抽出試薬（DNeasy Blood & Tissue Kits、QIAGEN）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した後、TaqPath ProAmp Master Mixes（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む（Thermo Fisher Scientific））、上記配列番号３のプローブ（5 pmol／ウェル）、上記配列番号４のフォワードプライマー（3 pmol／ウェル）および上記配列番号５のリバースプライマー（3 pmol／ウェル）を用いてｑＰＣＲ定量を行った。ｑＰＣＲは、7900HT Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いて、５０℃にて２分／９５℃にて５分／（９５℃にて１５秒および６０℃にて１分）を１サイクルとする条件で、４５サイクル行った。
実施例１の増幅曲線を図１Ａに示す。ヒト細胞を添加していないサンプルではカニクイザルゲノムＤＮＡの実質的な（有意な）ＰＣＲ増幅は認められなかった（図１Ｃ）。一方、ヒト細胞を添加したサンプルではその細胞数に応じて概ね等間隔にヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅が認められた。すなわち、カニクイザルのゲノムＤＮＡは増幅されず、ヒトのゲノムＤＮＡのみが特異的に増幅された。
図１Ａの増幅曲線から作成された検量線を図１Ｂに示す。ヒト細胞数が10（1.0E+1）から100000（1.0E+5）の範囲において、検量線の直線性が認められた。このように、濃度（細胞数）が未知のサンプルの増幅曲線（Thresholdと交差するときのCt値）と、濃度（細胞数）が既知のサンプルから作成された検量線とによって、その未知であった濃度（細胞数）を推定することができる。
［実施例２］マウス血液サンプル中のヒト細胞由来ＤＮＡの増幅
「15 mgのカニクイザルの脳」に代えて「50 μLのマウスの血液」を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ヒト細胞の溶解液を添加したサンプルおよびヒト細胞溶解液を添加していないサンプルを調製し、それぞれから抽出したゲノムＤＮＡに対しｑＰＣＲ定量を行った。
実施例２の増幅曲線および検量線を、それぞれ図２Ａおよび図２Ｂに示す。実施例１（図１Ａおよび図１Ｂ）と同様の事項が増幅曲線および検量線のそれぞれで認められた。またヒト細胞を添加していないサンプルでは、マウスゲノムＤＮＡの実質的な（有意な）ＰＣＲ増幅は認められなかった（図２Ｃ）
上記の実施例１および２の結果から、本発明のプローブ（ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いることによって、カニクイザルの組織（大脳皮質）、マウスの組織（血液）いずれにおいても、そのサンプル中にヒト細胞が少量でも存在すれば、ｑＰＣＲのヒトゲノムＤＮＡ増幅曲線および検量線からサンプル中のヒト細胞数を定量的に測定できることが明らかとなった。
下記の実施例３では、ヒトLINE-1遺伝子に対して設計した本発明の第２プローブとして、5'-FAM-(配列番号６)-NFQ-MGB-3'で示される構造を有するもの、すなわち配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、レポーター蛍光色素としてのFAM（５−カルボキシフルオレセイン、Thermo Fisher Scientific）およびそれに対応する非蛍光クエンチャーNFQ（Thermo Fisher Scientific）、ならびにMGB（Minor Groove Binder、Thermo Fisher Scientific）分子によって構成される、TaqManプローブを用いた。
配列番号６：5'-TGAGTTCATATCCTTTGTAGGGA-3'
また、ヒトLINE-1遺伝子に対して設計したリバースプライマーおよびフォワードプライマーとして、それぞれ配列番号７および配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号７：5'-CCATTACTGGGTATATACCCAAATGAG-3'
配列番号８：5'-GCGCTGCACCCACTAATGT-3'
［実施例３］カニクイザル肝臓サンプル中のヒト細胞由来ＤＮＡの増幅
カニクイザル肝臓サンプルから抽出したサルゲノムＤＮＡ（400 ng/reaction（ng/ウェル）に相当）に市販のヒトゲノムＤＮＡ（Promega社）をそれぞれ80、8、0.8、0.08、0.008、0 ng/reaction（ng/ウェル）となるように添加したサンプルを調製した。上記配列番号６のプローブ（10 pmol/ウェル）、上記配列番号７のリバースプライマー（10 pmol/ウェル）および上記配列番号８のフォワードプライマー（10 pmol/ウェル）を用いてqPCR定量を行った。qPCRは、QuantStudio 7（Thermo Fisher Scientific）を用いて、95℃にて10分/（95℃にて15秒および60℃にて1分）を１サイクルとする条件で、40サイクル行った。
実施例３の増幅曲線を図３Ａに示す。ヒトゲノムＤＮＡを添加していないサンプルではＰＣＲ増幅は認められなかった一方、ヒトゲノムＤＮＡを添加したサンプルではその添加濃度に応じて概ね等間隔にＰＣＲ増幅が認められた。すなわち、カニクイザルのゲノムＤＮＡは増幅されず、ヒトのゲノムＤＮＡのみが特異的に増幅された。
図３Ａの増幅曲線から作成された検量線を図３Ｂに示す。ヒトゲノムＤＮＡ濃度が0.008から80 ng/reaction（ng/ウェル）の範囲において、検量線の直線性が認められた。このように、濃度が未知のサンプルの増幅曲線（Thresholdと交差するときのCt値）と、濃度が既知のサンプルから作成された検量線とによって、その未知であった濃度を推定することができる。
本発明のｑＰＣＲ用のプローブは、ヒト細胞を移植または投与されたヒト以外の動物から採取されたサンプル中のヒト細胞を、ＰＣＲを用いて経時的に定量し検出するための試薬やキットなどとして有用であり得る。
本出願は、日本で出願された特願2018-110951を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
配列番号１：ヒトLINE-1遺伝子（アンチセンス鎖）における本発明の定量ＰＣＲプローブの標的範囲。
配列番号２：ヒトLINE-1遺伝子（センス鎖）における本発明の定量ＰＣＲプローブの標的範囲。
配列番号３：実施例１および２で用いられている、ヒトLINE-1遺伝子に対する本発明の定量ＰＣＲのプローブ（本発明の第１プローブ）。
配列番号４：実施例１および２で用いられている、ヒトLINE-1遺伝子に対する本発明の定量ＰＣＲのフォワードプライマー。
配列番号５：実施例１および２で用いられている、ヒトLINE-1遺伝子に対する本発明の定量ＰＣＲのリバースプライマー。
配列番号６：実施例３で用いられている、ヒトLINE-1遺伝子に対する本発明の定量ＰＣＲのプローブ（本発明の第２プローブ）。
配列番号７：実施例３で用いられている、ヒトLINE-1遺伝子に対する本発明の定量ＰＣＲのリバースプライマー。
配列番号８：実施例３で用いられている、ヒトLINE-1遺伝子に対する本発明の定量ＰＣＲのフォワードプライマー。

Claims (5)

  1. ヒトLINE-1遺伝子に由来する配列番号１で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、または
    ヒトLINE-1遺伝子に由来する配列番号２で示される塩基配列中の連続する１０〜３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、
    および標識部分を含む、定量ＰＣＲプローブ。
  2. 前記標識部分が、蛍光物質と該蛍光物質に対応するクエンチャーの組み合わせである、請求項１に記載の定量ＰＣＲプローブ。
  3. 請求項１に記載の定量ＰＣＲプローブ；
    ヒトLINE-1に由来するフォワードプライマー；および
    ヒトLINE-1に由来するリバースプライマー；
    を含み、ヒトLINE-1遺伝子の塩基配列上で、該定量ＰＣＲプローブ配列を挟むように該フォワードプライマーの配列と該リバースプライマーの配列が選択される、定量ＰＣＲキット。
  4. ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項３に記載のキット。
  5. 請求項３に記載の定量ＰＣＲキットを使用する、ヒト細胞を移植または投与された非ヒト動物におけるヒト細胞の検出方法。
JP2020525550A 2018-06-11 2019-06-10 定量ｐｃｒプローブ Active JP7410023B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018110951 2018-06-11
JP2018110951 2018-06-11
PCT/JP2019/022906 WO2019240073A1 (ja) 2018-06-11 2019-06-10 定量ｐｃｒプローブ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019240073A1 true JPWO2019240073A1 (ja) 2021-08-12
JP7410023B2 JP7410023B2 (ja) 2024-01-09

Family

ID=68843368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020525550A Active JP7410023B2 (ja) 2018-06-11 2019-06-10 定量ｐｃｒプローブ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210262044A1 (ja)
EP (1) EP3805409B1 (ja)
JP (1) JP7410023B2 (ja)
KR (1) KR20210027364A (ja)
CN (1) CN112449652A (ja)
WO (1) WO2019240073A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023054501A1 (ja) 2021-09-29 2023-04-06 武田薬品工業株式会社 細胞濃度の測定方法
WO2024005105A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 積水メディカル株式会社 ヒト細胞を測定する方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011017404A2 (en) * 2009-08-05 2011-02-10 The Salk Institute For Biological Studies Retroelements and mental disorders and methods of measuring l1 retrotransposition

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030121063A1 (en) * 1995-11-16 2003-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of use of mammalian retrotransposons
GB9805918D0 (en) * 1998-03-19 1998-05-13 Nycomed Amersham Plc Sequencing by hybridisation
EP2339022A3 (en) * 2007-04-25 2011-10-26 John Wayne Cancer Institute Use of methylated or unmethylated line-1 DNA as a cancer marker
JP5602355B2 (ja) * 2008-10-11 2014-10-08 和之 川上 癌患者の外科的手術後の治療選択方法及び予後診断
US11180807B2 (en) * 2011-11-04 2021-11-23 Population Bio, Inc. Methods for detecting a genetic variation in attractin-like 1 (ATRNL1) gene in subject with Parkinson's disease
JP6468555B2 (ja) * 2015-07-07 2019-02-13 株式会社新日本科学 検出キット，及び検出方法
JP6556902B2 (ja) 2018-04-19 2019-08-07 株式会社ニューギン 遊技機
CN111876411A (zh) * 2019-09-06 2020-11-03 深圳微伴生物有限公司 获得cfDNA标准品的引物组、PCR扩增阳性标准品及其制备方法、试剂盒及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011017404A2 (en) * 2009-08-05 2011-02-10 The Salk Institute For Biological Studies Retroelements and mental disorders and methods of measuring l1 retrotransposition

Also Published As

Publication number Publication date
JP7410023B2 (ja) 2024-01-09
EP3805409A1 (en) 2021-04-14
US20210262044A1 (en) 2021-08-26
KR20210027364A (ko) 2021-03-10
CN112449652A (zh) 2021-03-05
EP3805409B1 (en) 2024-05-15
EP3805409A4 (en) 2022-03-09
WO2019240073A1 (ja) 2019-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11597974B2 (en) Transposition of native chromatin for personal epigenomics
JP2000502260A (ja) 多型遺伝子配列の評価方法およびｈｌａ型の同定におけるその使用
JP7410023B2 (ja) 定量ｐｃｒプローブ
CN108048565A (zh) 一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用
CN105779644B (zh) 人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
Verma et al. Direct quantitative monitoring of homology-directed DNA repair of damaged telomeres
KR101236197B1 (ko) 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단
EP2843047B1 (en) Nucleic acid detection method
KR101338292B1 (ko) Ａ형 간염 바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응 효소면역 측정법
JP2013051909A (ja) サイトカイン遺伝子を利用したマルチプレックスｒｔ−ｐｃｒによる魚類健康診断法
JP6694318B2 (ja) ヒト細胞の定量的検出方法
Nadin-Davis Genetic Characterization of Rabies Viruses by In Situ Hybridization

Legal Events

Date Code Title Description
AA64 Notification of invalidation of claim of internal priority (with term)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764

Effective date: 20210330

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210420

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210421

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220526

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230516

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230714

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230829

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231025

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231128

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231221

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7410023

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150