KR101338292B1

KR101338292B1 - Ａ형 간염 바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응 효소면역 측정법

Info

Publication number: KR101338292B1
Application number: KR1020090109462A
Authority: KR
Inventors: 최창순
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2013-12-09
Also published as: KR20110052794A

Abstract

본 발명은 (a) 검출하고자 하는 미생물의 프라이머를 제작하는 단계 ; (b) 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 산물 내에 위치한 특정 염기 서열을 중심으로 프루브(probe)를 제작하는 단계; 및 (d) 상기 PCR 산물과 상기 프루브(probe)를 이용하여 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 수행하는 단계를 포함하는 미생물 검출 방법과 검출 키트에 관한 것으로, 민감도와 특이도가 높고, 다수의 미생물 샘플을 빠르고 간단하게 검출할 수 있다.

프라이머, 프루브, 중합효소 연쇄반응, 효소면역 검출법

Description

Ａ형 간염 바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응 효소면역 측정법{Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction - Enzyme-Linked Immunosorbent assay (RT-PCR-ELISA) for Hepatitis A virus}

본 발명은 민감도와 특이도가 높고, 다수의 미생물 샘플을 빠르고 간단하게 검출하기 위한 프라이머 및 프루브의 개발, 그리고 이를 이용한 미생물 검출방법 및 키트의 개발에 관한 것이다.

전통적으로 미생물을 검출하는 방법은 배양법과 생화학적 분석법(biochemical method)등의 전통적인 동정 방법을 이용하였으나, 이는 소요되는 기간이 매우 길고 분석이 까다로우며 번거로운 조작을 요구한다. 이에 최근 10년 동안 미생물의 검출을 위한 기술은 상당히 발전하여 항체(antibody)와 형광(fluorescence)을 이용한 방법, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 등 여러 가지 방법이 있으나 이는 미량의 세균인 경우는 검출이 어렵고, 많은 비용과 시간, 숙련된 노동력을 필요로 하는 단점이 있다.

병원성 미생물을 진단하는 가장 진보된 기술은 병원성 미생물만이 갖는 특정 유전자를 증폭한 후 이 유전자의 존재 여부를 확인하여 진단하는 PCR(polymerase chain reaction)방법이다. PCR에는 일련의 세 개의 단계가 있고 30~40회 정도 반복된다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것이다. 두 가닥의 DNA는 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. 변성 온도는 DNA 내에 있는 G+C의 양과 길이에 따라 달라진다. PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)이다. 이 단계에서는 프라이머(Primer)들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. PCR의 세 번째 단계는 신장(Elongation)단계이다. 이 단계에서 열에 강한 DNA 중합 효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다. PCR은 DNA, RNA 그리고 단백질 수준의 PCR로 나뉠 수 있다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적이다. 하지만 일부 미생물의 경우 유전자로 RNA를 가지는 경우도 있으며, DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고, 진핵 생물의 경우 비발현부위(인트론; Intron)가 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 프라이머를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA나 단백질 수준에서 하는 역전사-PCR(RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 있다. 이러한 PCR 방법들은 모든 생물체가 공통적으로 가지는 DNA 혹은 RNA 유전체를 이용하여 특정 유전자를 증폭하는 것이므로, PCR은 아주 적은 양의 DNA로 특정 영역을 기하급수적으로 증폭시키는 효율적 인 방법으로, 검출효율이 높아서 미량의 미생물의 분자생물학적 검출에 광범위하게 적용될 수 있고, 이러한 특정 유전자에 대한 정보만 있다면 생물체의 크기, 형태, 밀도 여부와 무관하게 모든 생물체에 대하여 진단이 가능하다.

그러나, 상기 PCR 방법은 매우 정밀하고 정확한 진단을 가능하게 하지만 반드시 유전자 증폭과정을 거쳐야 하기 때문에 여러 가지 요인에 의해서 크게 영향을 받는데, 유전물질을 정제하는 과정에서 남아 있는 불순물들이 증폭을 저해하거나 프라이머가 적절하지 않을 경우, 비특이적 증폭을 유발할 수 있다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 미생물의 특정유전자를 증폭하기 위하여 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많으며, 다른 검출대상에서 제외되는 미생물의 핵산에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합하다.

때문에, 이러한 비특이적 증폭을 억제하기 위한 기술개발은 무엇보다 시급하며, 모든 PCR에 있어 당연히 중요하며, 특히 유전자 검사, 질환 검사 등을 실시하는 진단(diagnosis) 분야에서 활용되는 PCR에 있어서는 더욱 중요하다 할 것이다.

본 발명에서는 특정 미생물의 검출을 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 방법과, 추가로 상기 검출방법의 특이성과 민감도를 높이기 위해 ELISA 기법을 접목시키는 검출방법 및 검출키트를 제공하고자 한다.

또한, A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 검출에 특이적인 신규한 프라이머와 프루브(probe)를 제공하며, 상기 검출방법 및 검출키트에 이를 적용한 A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 검출방법 및 검출키트를 제공하고자 한다.

본 발명은 병원성 미생물을 검출하는데 있어서 일반적으로 사용되고 있는 PCR 기법이 민감도가 떨어지고, 많은 양의 시료를 검사하기에 부적합 하다는 단점을 감안하여 PCR 기법에 효소 면역 측정법(ELISA)을 접목시키면 민감도와 특이도가 높고 한 번에 많은 양의 시료를 검사할 수 있으며 질병의 원인이 되는 미생물를 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였고, 또한 A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 검출에 특이적인 프라이머와 프루브를 개발하므로 A형간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)검출에 있어 상기 검출방법의 효과가 뛰어남을 확인하 고 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 검출하고자 하는 미생물의 프라이머를 제작하는 단계미생물의 프라이머를 제작하는 단계 ; (b) 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 산물 내에 위치한 특정 염기 서열을 중심으로 프루브(probe)를 제작하는 단계; 및 (d) 상기 (b)의 PCR 산물과 (c)의 프루브(probe)를 이용하여 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 수행하는 단계를 포함하는 미생물 검출 방법 및 검출 키트를 제공하고자 한다.

또한, A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 검출에 특이적인 프라이머와 프루브를 제공하고자 한다.

본 발명에 있어서, ‘미생물(microorganism)’이란, 바이러스, 세균, 방선균, 원생동물, 효모, 곰팡이, 버섯, 조류, 리케차, 동식물의 분화되지 않은 세포 및 조직 배양물 등을 포함하며, 일반적으로 육안의 가시한계를 넘어선 0.1 mm 이하의 크기인 미세한 생물 즉, 인간의 눈으로 확인할 수 없는 크기의 생물을 말하기도 한다.

본 발명에 있어서, ‘A형 간염(hepatitis A)바이러스’란 Picornavirdae과에 속하는 27nm 크기의 RNA 바이러스로서, 평균 28일의 잠복기 후에 고열, 권태감, 식 욕부진, 오심, 복통, 암뇨, 황달등의 임상증상 특징으로 하는 급성 간질환을 일으키는 질환이다. A형 간염바이러스는 로타바이러스와 마찬가지로 피막이 없으며 직경 27 nm의 정20면체 형태로 7.5 kb의 쇠사슬모양의 단일가닥 RNA 게놈을 가지고 있으며 한 개의 긴 ORF(P1∼3)를 가지고 있는 것이 특징이다. A형 간염의 주된 전파경로는 로타바이러스와 같이 분변-경구 통로이며, 오염된 음식물이나 식수에 의하여 전염되고 있는 실정이다.

본 발명에 있어서, ‘프라이머’란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다

본 발명에서 있어서, '프로브'란 미생물의 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 말한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 두 가닥 중 어느 하나와 혼성화되어야 하므로 상기 서열번호들의 센스(sense), 안티센스(antisense), 그리고 상보적(complement) 염기서열을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 RNA, DNA, PNA, LNA, HNA 및 이노신과 같은 변형된 뉴클레오티드와 같이 그들의 혼성화 특징을 본질적으로 변화시키지 않는 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

(a) 검출하고자 하는 미생물의 프라이머를 제작하는 단계

본 발명의 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있으며, 각각의 검출하고자 하는 미생물에 대해서 종 특이적으로 PCR산물, 바람직하게는 Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 산물, 보다 바람직하게는 RT-PCR 산물이 합성되도록 하기 위하여 제작한다. 본 발명에서 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 PCR산물, 바람직하게는 Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 산물, 보다 바람직하게는 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 특정 미생물의 종 내의 모든 계통에 대하여 공통적으로 작용하여야 하고, 다른 유사 종의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다.

구체적으로 본 발명의 프라이머는 다음과 같은 방법으로 개발(디자인)되었다. i) 대상 미생물의 유전자(게놈) 중 대상이 되는 게놈을 선정, ii) 현재까지 알려진 대상 미생물의 계통 및 분리주의 게놈 서열에서 공통 염기서열을 탐색, iii) 유사미생물의 게놈과 동일, 유사한 서열을 배제, iv) 프라이머로 기능이 가능한 염기서열만을 선정하는 방법에 의해 프라이머를 디자인을 하였으며, 디자인된 프라이머 중 PCR, 바람직하게는 Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR, 보다 바람직하게는 RT-PCR에 의해 종 특이적인 증폭이 수행될 수 있으며, 비특이적인 반응이 일어나지 않는 프라이머쌍을 선정하였다.

본 발명의 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있으며, 바람직하게는 상기의 변형된 PCR용 프라이머일 수 있으며, 보다 바람직하게는 RT-PCR용 프라이머일 수 있고, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머쌍일 수 있다.

상기의 미생물은 그 종류를 가리지 않으나, 바람직하게는 병원성 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 A형 간염바이러스인 것이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 A형 간염바이러스(도1)를 검출하기 위한 프라이머로 A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 VP1 유전자에 특이적인 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 (L)형 프라이머와 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 (R)형 프라이머의 쌍, 또는 A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 5‘ NCR(noncoding region) 유전자에 특이직인 서열번호 6 및 서열번호 7으로 이루어진 군으로부터 선택된 (L)형 프라이머와 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된 (R)형 프라이머의 쌍을 제공하고자 한다.

(b) 상기 프라이머를 이용하여 RT - PCR 을 수행하는 단계

본 발명의 검출방법에 사용되는 게놈은 미생물 샘플의 게놈, 바람직하게는 RNA 게놈, 더욱 바람직하게는 A형 간염바이러스 게놈일 수 있으며, 본 발명의 검출방법은 당업계에 공지된 일반적 PCR 기법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응, 더욱 바람직하게는 RT-PCR을 수행할 수 있다.

본 발명의 게놈의 추출 방법은 통상적으로 당업계에서 사용하는 어떤 방법이여도 무관하며, 일례로 본 발명에서 사용한 Trisol을 이용한 RNA분리 방법을 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있으며, RT-PCR일 경우 게놈 RNA를 주형으로 하여 역전사 반응을 수행한 후 PCR 반응을 수행한다.

상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 DNA 주형(RT-PCR일 경우만 해당)과 본 발명의 프라이머 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다. 이 때 MgCl₂농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1 내지 3mM의 범위로 사용될 수 있다.일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다.

본 발명은, 상기 (a) 단계의 프라이머를 가지고 PCR, 바람직하게는 상기 변형된 PCR, 더욱 바람직하게는 RT-PCR을 수행하는 미생물 검출방법일 수 있으며, 또한 검출의 민감도와 특이도를 높이기 위해 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)에 추가로 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 접목하여 시행할 수 있다.

상기 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 접목할 경우, PCR 수행시 dNTP에 검출가능한 표지를 포함하도록 추가로 변형하여 효소면역 측정법 수행시 검출의 용이성을 높일 수 있으며, 이러한 표지는 당업계에서 일반적으로 사용하는 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 DIG를 사용하였으나 이에 한정하는 것은 아니다.

(c) 상기 PCR 산물 내에 위치한 특정 염기 서열을 중심으로 프루브(probe)를 제작하는 단계

본 발명에서는, (a)단계에서 제작된 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 생성하고 이를 PCR 산물 내에 위치한 특정 염기 서열 중 일부인 프루브(probe)와 결합시켜, 결합이 이루어지지 않은 PCR 증폭산물은 제거시킴으로 검출하고자 하는 미생물에 특이적인 염기서열만 선별할 수 있으며, 상기 프루브(probe)에는 효소면역 측정법(ELISA 기법)의 수행을 용이하도록 하기 위해 특정 표지, 바람직하게는 비오틴 등을 붙이나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 프루브(probe)는 검출하고자 하는 미생물의 특정 염기서열에 특이적으로 제공되며, 본 발명은 검출하고자 하는 미생물의 염기서열, 바람직하게는 병 원성 미생물의 염기서열, 더욱 바람직하게는 A형 간염바이러스의 염기서열에 적합한 프루브(probe)이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 A형 간염바이러스를 검출하기 위한 프루브(probe)로는, A형 간염바이러스의 VP1 유전자에 특이적인 서열10과, A형 간염바이러스의 5‘ NCR 유전자에 특이적인 서열11을 제공하고자 한다.

(d) 상기 상기 PCR 산물과 상기 프루브(probe)를 이용하여 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 수행하는 단계 (도 2)

본 발명은 상기 PCR 기법에 효소면역측정법을 접목하여 미생물을 검출하는 것을 특징으로 하는 것이며, 또한, 특정 미생물을 검출하는데 특이적인 프루브를 개발하고 이를 이용하여 상기의 효소면역측정법에 적용하는 미생물의 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 검출하고자 하는 미생물의 특정 영역의 염기 서열에 특이하게 고안된 프라이머를 이용하여 증폭한 후에 증폭 산물을 마이크로플레이트 웰 (microplate well) 내에서 특이하게 고안된 프로브와 교잡반응을 수행하고, 반응의 결과물을 효소가 표지된 항체와 결합시켜 부착된 효소 작용에 의해 나타난 발색량(흡광도) 또는 발광량(발광의 세기)으로 검출하고자 하는 미생물 핵산의 존재여부와 양을 측정한다.

일례로, A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 검출을 위해, 비오틴이 부착된 프루브(probe)의 증폭 산물은 스트렙타비딘(streptavidin)과 결합하여 마이크로웰에 부착하는데, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 (L)형 프라이머와 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 (R)형 프라이머의 쌍, 또는 서열번호 6 및 서열번호 7으로 이루어진 군으로부터 선택된 (L)형 프라이머와 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된 (R)형 프라이머의 쌍을 사용한 DIG가 부착된 PCR 증폭 산물은, 비오틴이 부착된 서열번호 10 또는 서열번호 11로 이루어진 프루브(probe)의 증폭 산물의 염기서열에 상보적이다. 상기 PCR 증폭 산물의 DiG 표지에 페록시다이제(POD)와 결합된 항 DIG 항체가 부착되고, 항체와 결합된 부착 POD의 작용에 의해 기질을 분해하고 발색제를 발색시킨다. 발색의 강도를 흡광도측정기(ELISA reader)로 측정하고, 흡광도의 강도는 A형 간염바이러스-DNA의 양과 비례한다.

본 발명의 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 특정 미생물을 검출할 수 있으며, 추가로 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 접목시키면 검출시 민감도와 특이도가 뛰어나며 및 다수의 미생물 샘플을 빠르고 간단하게 검출할 수 있었다. 본 발명에서는 상기 발명을 적용하여 A형 간염 바이러스 검출 효과가 뛰어남을 확인하였는데, 본 발명은 A형 간염 바이러스뿐만 아니라, 최근 바이러스성 식중독으로 심각하게 문제되고 있는 E형 간염 바이러스, 노로바이러스 등에 적용될 수 있으므로 다양한 미생물 관련 산업에 활용 가치가 높을 것으로 기대된다. 나아가 새로운 thermal cycler 기계의 제조, tube 제작 등 실험 기기나 비품 개발에도 영향을 미칠 것으로 기대된다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되거나 제한되는 것은 아니다

실시예

실시예 1. RNA 분리

RNA 분리 방법은 Trisol을 이용한 방법을 사용하였다. 1.5 ml 튜브에 1 ml의 A형 간염 바이러스가 감염된 세포를 넣고 2,500 rpm, 4℃에서 5분 간 원심분리 한 후 상층액 500 ul와 Trisol LS 500ul를 vortex 한 후 10분 동안 정체 시켰다. 10분 후 300 ul의 chloroform을 첨가하고 vortex 한 후 10분 동안 정체 시켰다. 10분 후 7,500 rpm, 4℃에서 15분 간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮겨 cold isopropanol 500 ml와 함께 vortex하고 -20℃에서 overnight 시켰다. 다음 날 14,000 rpm, 4℃에서 30분 간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 cold 75% DEPC ETOH 500 ul를 넣고 약하게 vortex 하였다. 다시 14,000 rpm, 4℃에서 30분 간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 건조시킨 후 20 ul의 DEPC 3차 멸균증류수를 첨가하였으며, 사용 전 까지는 -20℃에서 저장하였다.

실시예 2. 역전사 중합효소 연쇄반응 ( Revers transcription - polymerase chain reaction , RT - PCR )

Revers transcription 과정에서 사용된 시약과 조건은표 1에 나타난 바와 같다. HAV의 RT-PCR중 RT 과정 후 PCR에서 사용된 시약과 조건은 표2에 나타난 바와 같다.

HAV-specific primer set을 개발하여 사용하였으며, 본 발명에서 개발한 primer set은 표 3에 나타난 바와 같다. 표4에 나타난 바와 같이, RT-PCR product 내에 위치한 특정 염기 서열을 중심으로 probe를 디자인 하되 20-30bp 내외 길이를 가지며 Biotin으로 표지하여 제작하였다.

상기 Probe 제작에 사용되는 프로그램으로는 Clone Manager Professional Suite (Scientific & Educational Software), Oligo (MedProbe), Primer Premier (Premier Biosoft), NTI software (Invitrogen Inc.)을 사용하였다.

Revers transcription 과정에서 사용된 시약

HAV Revers transcription
DEPC water	5.5 ul	42℃ 94℃ 4℃	15 min 5 min 5 min
10X PCR buffer	1 ul
dNTP	1 ul
Oligo d(T)	0.5 ul
Rnase inhibitor	0.5 ul
MULV Revers transcroptase	0.5 ul
Total 9 ul + RNA 1 ul

HAV의 RT-PCR중 RT 과정 후 PCR에서 사용된 시약

* Conventional PCR		* DIG - Labeled PCR		PCR 조건
3^rdD.W.	12ul	D.W.	12.8ul
10X PCR buffer	2ul	DIG labeling mix(dNTP)	2ul	94℃	5min
dNTP	2ul	10X reaction buffer	2ul	94℃	30sec	┐
Primer (L)	1ul	Taq polymerase	(1U)0.2ul	55℃	30sec	40cycles
(R)	1ul	Primer (L)	0.5ul	72℃	30sec	┘
Top DNA polymerase	1ul	(R)	0.5ul	72℃	5min
cDNA	1ul	cDNA	2ul	4℃	∞
Total	20 ul	Total	20 ul

HAV-specific primer set

Primer set		Sequence
HAV VP1	L 77(서열번호1) L 116(서열번호2) L 485(서열번호3) R 669(서열번호4) R 719(서열번호5)	5'-ATC CCC AAG TTG GCA TAA CA-3' 5'-GGA AAG CCA ATA GGG GAA AA-3' 5'-TGG CCT GGT TCA CTC CAG TA-3' 5'-ACC ATC CAG TGC TCC AGA CA-3' 5'-GCA ATC TGA ATA GAA ACC AAT CC-3'
HAV 5' NCR	L 334(서열번호6) L 350(서열번호7) R 522(서열번호8) R 545(서열번호9)	5'-TTG GGG ACA CAG ATG TTT GG-3' 5'-TTG GAA CGT CAC CTT GCA GT-3' 5'-GGC GTT GAA TGG TTT TTG TC-3' 5'-CAC TGG ATG AGA GCC AGT CC-3'

Probe design

Probe		Sequence
HAV VP1	L 220 (B) (서열번호10)	5'-TTT CCT GAA TTG AAG CCT GG-3'
HAV 5'NCR	481 (B) (서열번호11)	5'-CCG CTG TTA CCC TAT CCA AA-3'

실시예 3. Hybridization and detection reaction

1X TAE(Tris-Acetate-EDTA) buffer에 1% gel agarose와 0.1% Ethidium bromide를 첨가하여 젤을 만들고 100v에서 50분 간 전기영동을 실시하여 증폭 된 RT-PCR product를 확인한 후 94℃에서 5분 간 pre-denaturation시켰다. PCR tube에 10 ul의 denaturing solution을 분주한 뒤 5 ul의 Dig-labeled PCR-amplified product를 분주하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 각 tube에 각 target region(VP1 & 5'NCR)에 적합한 biotinylated type-specific probe를 2 ul(1 pmol/ul)씩 넣고 188 ul의 hybridization buffer를 첨가한 후 37℃에서 10분간 반응시켰으며 이때 negative control은 DIG-labeled PCR product만을 제외하였다. 반응 후 200 ul을 streptavidin-coated plate well에 옮긴 후 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. plate의 각 well의 시약을 vacuum pump를 이용하여 제거한 후 상온에서 각 well 당 200 ul의 washing buffer를 이용하여 4회 washing하였다. 200 ul의 anti-Dig peroxidase-conjugated solution을 각 well에 넣고 상온에서 30분간 암반응시켰다(* anti-dioxigenin-POD conjugate (peroxidase conjugated anti-DIG antibody) : conjugate buffer = 1 : 500). Plate의 각 well의 시약을 vacuum pump를 이용하여 제거한 후 상온에서 각 well 당 200 ul의 washing buffer를 이용하여 4회 washing하였다. 200 ul의 ABTS substrate solution을 상온에서 암반응 시킨 후 30분, 60분, 90분에서 반응

을 확인하였다. Microplate reader를 이용하여 OD 405nm에서 흡광도를 측정하였으며(reference 492nm) 결과가 60분에서 0.1 이상이면 양성으로 판정하였다.

실시예 4. RT - PCR ELISA 의 판독

VP1, 5'NCR region에서 각각 primer set을 하나씩 선정하여 2pM/ul, 4pM/ul, 8pM/ul의 세가지 농도의 각 region에 해당하는 probe를 37℃와 55℃에서 hybridization하여 190분까지 10분 단위로 signal을 비교 후 positive 판정에 적합한 probe농도, 시간 그리고 측정값을 선택한다.

상기 도3, 도4, 도5에서 나타난 바와 같이, A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)가 존재하는 시료의 발색여부와 발색의 진함에 따라 A형 간염바이러스(hepatitis A virus, HAV)의 감염여부와 정도를 확인할 수 있었다.

도 1은 A형 간염 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.

도 2는 RT-PCR ELISA를 수행할 때 적용가능 한 kit 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 RT-PCR ELISA 실시 모형으로 항원/항체를 검출하는 ELISA kit와 같이 다량의 PCR/RT-PCR products를 plate 상에서 판독한 실시 예이다.

도 4는 미생물의 검출을 실시예이다.

도 5는 식품에 오염된 A형 간염 바이러스를 검출한 실시예이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction - Enzyme-Linked Immunosorbent assay (RT-PCR-ELISA) for Hepatitis A virus <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (L 77) <400> 1 atccccaagt tggcataaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (L 116) <400> 2 ggaaagccaa taggggaaaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (L 485) <400> 3 tggcctggtt cactccagta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (R 669) <400> 4 accatccagt gctccagaca 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (R 719) <400> 5 gcaatctgaa tagaaaccaa tcc 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (L 334) <400> 6 ttggggacac agatgtttgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (L 350) <400> 7 ttggaacgtc accttgcagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (R 522) <400> 8 ggcgttgaat ggtttttgtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (R 545) <400> 9 cactggatga gagccagtcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe (L 220(B)) <400> 10 tttcctgaat tgaagcctgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe (481(B)) <400> 11 ccgctgttac cctatccaaa 20

Claims

(a) 서열번호 6 및 서열번호 9의 핵산서열로 이루어진 A형 간염 바이러스의 프라이머를 제작하는 단계; (b) 상기 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 산물 내에 위치한 염기 서열에 대한 서열번호 11의 핵산서열로 이루어진 프로브(probe)를 제작하는 단계; 및 (d) 상기 (b)의 PCR 산물과 (c)의 프로브(probe)를 이용하여 효소면역 측정법(ELISA 기법)을 수행하는 단계를 포함하는 A형 간염 바이러스의 검출 방법.
제1항에 있어서,

상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 A형 간염 바이러스의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, A형 간염 바이러스의 검출 방법.
서열번호 6 및 서열번호 9의 핵산서열로 이루어진 A형 간염 바이러스의 프라이머, DNA 중합효소, DIG가 부착된 dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함하고, 서열번호 11의 핵산 서열로 이루어진 비오틴이 부착된 프로브(probe), 지지체에 부착하며 상기 프로브와 결합력이 있는 스트렙타비딘 및 페록시다이제 (POD)가 부착된 항 DIG 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 검출용 키트.
제 3항에 있어서, 상기 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 서열번호 7 및 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 A형 간염 바리어스의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 A형 간염 바이러스 검출용 키트.
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