KR101623489B1

KR101623489B1 - 성인성 질환의 원인균 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR101623489B1
Application number: KR1020140150512A
Authority: KR
Inventors: 김인영
Original assignee: 주식회사 랩 지노믹스
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2016-05-23
Also published as: KR20160051083A

Abstract

본 발명은 성인성 질환의 원인균을 탐지 및/또는 유전형 분석용 고감도 프로브, 이를 포함하는 마이크로어레이를 사용하여 성인성 질환의 원인균의 탐지키트에 관한 것으로서, 기존 사용하던 프로브 및 이를 이용한 DNA 칩에 비해 특이도 및 민감도가 현저히 우수한 STD 원인균 탐지방법 및 탐지키트를 제공한다.

Description

성인성 질환의 원인균 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트{High Definition Probe for detecting microorganism causing sexually transmitted disease and kit using the same}

본 발명은 성인성 질환의 원인균의 탐지 및/또는 유전형 분석용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 바이오 칩에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 DNA 칩을 사용하여 성인성 질환의 원인균의 분석키트 및 상기 분석키트를 사용하여 성인성 질환을 탐지하는 방법에 관한 것이다.

성인성 질환 또는 성교전파성 질환(sexually transmitted disease: STD)이란 성접촉에 의해 감염될 수 있는 모든 질환을 말한다. 성인성 질환에는 임질, 매독, 연성하감, 성병성 임파육아종, 서혜육아종 등의 5가지 이외에도 비임균성 요도염, 음부포진, 첨규형 콘딜로마, 전염성 연속종, 개선증, 음모슬증, 질트리코모나스증, 캔디다증, 완선, 간염 등을 모두 포함시켜서 말한다. 성인성 질환의 특징으로는 주로 성교에 의하여 전파되는 만큼 생활 습성상 다시 성인병 질환에 노출되는 기회가 많기 때문에 치유된 후에도 다시 재감염되기 쉽다. 증상이 없는 보균자가 적극성 성활동을 지속함으로써 성병 만연의 계기를 제공하여 문제가 되고 있다.

성인성 질환의 원인균으로는 STD 원인균은 100여 종 이상이 밝혀졌으며, 특히 성 전파 질환과 밀접한 관련성이 있는 세균으로는 약 18종이 보고되고 있다. 이들을 성 전파 질환별로 세분화하여 살펴보면 성 전파 질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 (Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasmagenitalium), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi) 및 요도염 원인균(Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Corynebactrium) 등 총 18종 등이 있다.

현재 미국 FDA에서 공인을 받은, 클라마이디아 트라코마티스, 임균, 헤르페스심플렉스바이러스 및 인체 면역결핍바이러스 등을 검색하는 PCR 및 리얼타임(real time) PCR 키트가 시판되고 있다. 그러나 아직까지 상업화된 DNA 칩은 소수이며, 감염질환의 원인균을 신속하고 정확하게 파악할 수 있을 뿐 아니라, 항생제 내성까지 검사하여 임상 진단에 크게 도움을 줄 수 있는 DNA 칩은 더욱 보기 드물다. 특히 본 발명에서와 같은, STD의 주 원인균 및 관련균의 진단과 함께 그 항생제 내성까지 모두 검색할 수 있는 STD 칩은 아직 상업화가 되어 있지 않다.

이외에도 효소면역검사법(enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법(immunofluorescence technique)은 임균감염질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있으며, 배양검사에 비해 신속하게 결과를 얻을 수 있고, 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나, 고비용이라는 단점이 있다.

STD 진단 상품으로는 자사 ㈜랩지노믹스의 STDetect Chip과 ㈜굿젠의 STD DNA Chip이 있다. 이와 관련하여 ㈜랩지노믹스의 STDetect Chip의 스팟 배열은 도 4에 대조군 칩 모식도에 나타냈고, ㈜굿젠의 STD DNA Chip의 스팟 배열은 도 2에 나타내었으며, ㈜굿젠의 STD DNA Chip에서의 NG, CT, MH, UU, MG, TV, HSV1, HSV2, TP 및 Neg DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진을 도 3에 나타냈다. 상기 ㈜랩지노믹스와 ㈜굿젠의 제품은 질 Swab, 소변, 성기궤양 Swab의 인체 유래물에서 추출한 DNA의 검체로부터 비뇨생식기 감염질환 (STD)의 유전형을 검출하는 정성검사로 Chip 기법을 사용하여 ㈜랩지노믹스는 Neisseria Gonorrea(NG), Chlamydia trachomatis(CT), Ureaplasma urealyticum(UU), Mycoplasma genitalium(MG), Mycoplasma hominis(MH), Trichomonas vaginalis(TV), Gardnerella vaginalis(GV), Candida albicans(CA), Klebsiella pneumonia(KP), Enterococcus fecalis(EF), Staphylococcus aureus(SA), HSV1 (Herpes simplex virus-type1), HSV2 (Herpes simplex virus-type2)의 13종의 STD 원인균을 검출할 수 있으며, ㈜굿젠은 Neisseria gonorrhoeae(NG), Chlamydia trachomatis(CT), Mycoplasma hominis(MH), Ureaplasma urealyticum(UU), Mycoplasma genitalium(MG), Trichomonas vaginalis(TV), HSV 1(Herpes simplex virus), HSV 2, Treponema pallidum(TP)와 같은 9종의 STD 원인균을 검출할 수 있다.

그러나, 상기 칩은 각 원인균 당 한 종류의 프로브를 사용하여 칩을 제작하기 때문에 민감도 또는 특이도가 떨어지는 결과가 나타나 검사시 재검 확률이 높기 때문에 검사 결과를 얻는데 시간이 소요되는 문제점이 있다.

한국공개특허공보 2004-0046654에는 임균(N. gonorrhoeae)의 탐지용 STD DNA 칩으로서, 한국공개특허공보 2004-0022800에는 인체 포진 바이러스에 대한 탐지용 프로브 및 STD DNA 칩을, 한국공개특허공보 2004-0022705는 클라미디아 트라코마티스에 대한 탐지용 프로브 및 STD DNA 칩을 개시하고 있다. 이들은 모두 구체적으로 임균(N. gonorrhoeae) 탐지용 프로브의 말단을 아민기로 변형시킨 뒤 글라스 상의 알데히드기와의 시프염기반응에 따라 고정된 것을 개시하고 있다.

또한, 한국공개특허공보 2006-0128797는, 프로브의 말단을 아민기로 변형시킨 뒤 글라스 상의 알데히드기와의 시프염기반응에 따라 고정된 DNA칩의 문제점을 해소하고자, 9개의 구아닌 염기를 포함한 올리고 DNA가 녹아있는 용액을 칩 base위에 도포하면 구아닌 염기가 자발적으로 칩 위에 고정화되는, 즉 다른 작용기가 필요 없는 DNA 칩을 개시하고 있다.

그러나 상기 DNA칩은 하나의 원인균에 대해서 하나의 프로브만을 사용하여 탐지하므로 정확도 및 민감도에 문제가 있었으며, 따라서, STD 원인균의 감염 여부를 간단하고, 정확하게 탐지할 수 있을 뿐만 아니라 높은 특이도와 민감도를 갖는 STD 원인균의 탐지 방법 및 키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

또한, 상기 탐지키트, 이에 사용되는 프로브, 및 DNA 칩은 가능한 STD 원인균을 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 STD 원인균의 감염 여부를 더욱 정확하게 탐지할 수 있어야 함과 동시에, 하나의 칩 상에서 검출 가능한 STD 원인균의 프로브 간에 혼성화가 발생하지 않아야 한다.

여러 가지 유형의 원인균을 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 원인균의 감염여부를 더욱 정확하게 탐지하기 위해서는, 프로브의 길이, 교잡반응(Hybridization)이 일어나는 온도, GC함량, 비표적 서열과 서열 유사도 등을 개선한 STD 원인균의 탐지용 프로브의 개발이 절실하다.

본 발명의 목적은 STD 원인균을 높은 특이도 및 민감도로 탐지하기 위해서, STD 원인균의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 STD 원인균의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는, STD 원인균 탐지를 위한 DNA 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 STD 원인균 탐지를 위한 신규한 DNA 칩을 포함하는 STD 원인균 탐지키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, STD 원인균의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 유전형 분석 DNA 프로브 및 상기 프로브를 포함하는, STD 원인균을 탐지하기 위한 DNA 칩 및 분석키트를 제공한다.

본 발명자들은 간단한 방법으로 환자로부터 채취된 시료를 분석하여 STD 원인균을 탐지하고, 탐지된 STD 원인균의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구 노력한 결과, STD 원인균의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브, 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다.

본 발명은 STD 원인균의 DNA의 염기서열, 바람직하게는 13종의 STD 원인균과 시험대조군(IC)의 DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열의 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 서열목록 서열번호 1 내지 42에 기재된 염기서열을 포함한다. 본 발명의 프로브를 이용하여 13종의 STD와 시험대조군(IC)을 짧은 시간에 탐지할 수 있으며, 높은 특이도와 민감도로 인하여 검사 진단 시 재검 확률이 낮다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 STD 원인균을 탐지하고, 탐지된 원인균의 종류를 정확하게 판별할 수 있으며, 비표적 영역과 서열유사도가 낮고, 교차 교잡반응이 일어나지 않으며, 2차 구조형성이 방지되어, 특이도와 민감도가 높은 STD 원인균 탐지용 프로브 서열을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 STD 원인균 탐지용 프로브 서열을 하기 표 1에 나타낸다. 하기 표에는 한 종류의 원인균 유형에 대해서 각각 3가지의 상이한 서열을 갖는 프로브를 제시한다. 또한 본 발명에 따라 STD 원인균의 DNA와 상보적으로 결합 가능한 염기서열을 가지는 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 STD 원인균 각각에 특이적으로 교잡반응(hydridization)이 일어나는 것이 특징이다.

STD	명명	서열 (5'-3')	서열길이 (bp)	서열번호
IC	IC1	TAG GCC CTT TTG CTA ATC ATG TT	23	1
	IC2	CTT TGT TCC CTA AGT CCA ACT A	22	2
	IC3	TGG GAG GTC AGT GCA TTT AAA A	22	3
EF	EF1	AAG AAG TGA CTG GAA AGG AAA TC	23	4
	EF2	TGC CCG AGC AAT TGT TGA AC	20	5
	EF3	AGC GCA TGT TCC AGA AGA AG	20	6
MH	MH1	CGC ATG GTT CCG TTG TGA AA	20	7
	MH2	CCC ACC AAG ACT ATG ATG TTT A	22	8
	MH3	AAG GTC TTC GGA TTG TAA AGT G	22	9
CA	CA1	TTG CAG ATA TTC GTG AAT CAT CG	23	10
	CA2	TGC CTG TTT GAG CGT CGT TT	20	11
	CA3	CTG GGT TTG GTG TTG AGC AA	20	12
GV	GV1	AGT CGC TTG ATC GTT TTG TGA T	22	13
	GV2	AGA GAG TTA AGC GAT AGG CTT T	22	14
	GV3	TTG GAT GCC TTG GTA GAC AG	20	15
CT	CT1	ATC TTA AAA GGG ATT GCA GCT TG	23	16
	CT2	ATT TGC CTT AAC CCC ACC ATT TT	23	17
	CT3	CAA AAC CTC TTC GTT GAC CG	20	18
SA	SA1	GGT TCT GAA GAT CCA ACA GTA TA	23	19
	SA2	AAA GGT GTA GAG AAA TAT GGT CC	23	20
	SA3	ATT GAA GTC GAG TTT GAC AAA GG	23	21
TV	TV1	GTT TTC TGC ATT GAT AAC GAA GC	23	22
	TV2	ATC TTA ACC ACC TTG TTT CCA TG	23	23
	TV3	TTC TTC ATC GTT GGC TTC GC	20	24
MG	MG1	ACT AAA GAT TAC TGG AGA GAA CC	23	25
	MG2	CTG TTG AGA AAT ACC TTG ATG GT	23	26
	MG3	AAG GTA TGA TAA CAA CGG TAG AG	23	27
HSV1	HSV1_1	GCA GTA AGA CCC AAG CAT AG	20	28
	HSV1_2	ACA AAA ACA CAG GCG GGG TG	20	29
	HSV1_3	TTC TTG GAG TAC GTG GGT CA	20	30
NG	NG1	CTC GTT CTT GAC GCT CCA TA	20	31
	NG2	CGT TTA TAT CGG CGG TTA TTT TC	23	32
	NG3	ATG CCT CGT TGA TAT TTT TCC GT	23	33
HSV2	HSV2_1	TTT GTT GTG AGG AGC CAC GA	20	34
	HSV2_2	CGT ATT GGT ATT CGT ATC GGC	21	35
	HSV2_3	TTT TCC AGG GGG TGA TTA GG	20	36
KP	KP1	CGG TCA GCG AAA AAC ACC TT	20	37
	KP2	CGC CAT TAC CAT GAG CGA TA	20	38
	KP3	TTG ACT GCC TTT TTG CGC CA	20	39
UU	UU1	CGA AGA CAA AGA ACG TAA AGT TG	23	40
	UU2	GTA CTG CTA TTC GTT TTG AAC CA	23	41
	UU3	GTT ATT GAT TTA GTC GGA ACA CG	23	42

상기 표에서 STD 원인균의 정식 명칭은 다음과 같다.

IC: Internal Control (Homo sapiens isolate HbC-Dgn83 beta globin gene)

EF: Enterococcus Fecalis

MH: Mycoplasma hominis

CA: Candida albicans

GV: Gardnerella vaginalis

CT: Chlamydia trachomatis

SA: Staphylococcus aureus

TV: Trichomonas vaginalis

MG: Mycoplasma genitalium

HSV1: Herpes simplex virus Type Ⅰ

NG: Neisseria gonorrhoeae

HSV2: Herpes simplex virus Type Ⅱ

KP: Klebsiella pneumoniae

UU: Ureaplasma urealyticum

상기 13종의 STD와 시험대조군(IC) 탐지의 특이도와 민감도를 높이기 위해 고려되어야 할 사항으로서는 i) 프로브의 적절한 길이를 선정하고, ii) 비교적 좁은 범위의 교잡반응이 일어나는 온도(melting temperature range)을 가지며, iii) 가급적 2차 구조를 형성하지 않도록 제작하며, iv) 적절한 신호강도를 갖는 40 내지 60%의 GC 함량을 설정하고, v) 교차 교잡반응(cross hybridization)을 방지하기 위해 서열의 반복을 최소화하고, vi) 탐지대상서열 (target 서열)의 선택성을 높이고자 비표적 서열과 서열 상동성(nucleotide sequence identity)이 높지 않아야 하며, 예를 들면 염기서열의 서열동일성이 약 75% 이하인 것이 바람직하다. 표적서열과 비표적 서열에 대한 프로브의 염기서열 동일성을 낮추기 위하여, 예를 들면 Cluster W program 사용으로 비표적 서열과의 유사도를 측정하여 75% 이하의 염기서열 동일성을 가지도록 프로브를 설계할 수 있다.

본 발명에 따른 프로브는 높은 특이도와 민감도로 STD 원인균 탐지가 가능하다. 본 발명에 따른 프로브는 바람직하게는 5'-말단에 아민-TTTTTTTTTT를 추가로 포함하여 마이크로 어레이 고정화에 용이하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 프로브는 STD 원인균 각각에 대해, 상이한 염기서열을 갖는 3가지 종류의 프로브를 제공하며, 구체적으로 서열번호 1 내지 42의 염기서열을 갖는 프로브들 중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 프로브로 탐지 가능한 STD 원인균은 상기 표 1에 기재하였다.

본 발명에 따른 프로브들 중에서, STD 원인균 각각에 대해 상이한 3가지 종류의 프로브가 제공되며, 한 종류의 STD에 대해 하나의 프로브를 사용하여 탐지할 수도 있으나, 2종 이상을 혼합하여 하나의 스팟에 포함시킨 경우 특이도와 민감도를 더욱 높일 수 있으며, 바람직하게는 한 종류의 STD에 대해 3가지 종류의 프로브를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 프로브로 탐지 가능한 STD 원인균은 Neisseria Gonorrea(NG), Chlamydia trachomatis(CT), Ureaplasma urealyticum(UU), Mycoplasma genitalium(MG), Mycoplasma hominis(MH), Trichomonas vaginalis(TV), Gardnerella vaginalis(GV), Candida albicans(CA), Klebsiella pneumonia(KP), Enterococcus fecalis(EF), Staphylococcus aureus(SA), HSV1 (Herpes simplex virus-type1), HSV2 (Herpes simplex virus-type2)와 IC(Internal control)을 포함한다.

표 1에는 서열번호 1 내지 42의 42개 프로브가 제시되며, Neisseria Gonorrea(NG), Chlamydia trachomatis(CT), Ureaplasma urealyticum(UU), Mycoplasma genitalium(MG), Mycoplasma hominis(MH), Trichomonas vaginalis(TV), Gardnerella vaginalis(GV), Candida albicans(CA), Klebsiella pneumonia(KP), Enterococcus fecalis(EF), Staphylococcus aureus(SA), HSV1 (Herpes simplex virus-type1), HSV2 (Herpes simplex virus-type2)와 IC(Internal control)와 관련하여 각각의 STD에 대해 상이한 3가지의 프로브가 제시된다. 예를 들면 서열번호 1 내지 3은 IC(Internal Control)의 탐지용 프로브이며, 이들 프로브는 각각 단독으로 사용하거나, 2종 이상 혼합한 세트로 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 프로브들로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 DNA 칩 및 STD 원인균 탐지키트를 제공한다. 본 발명의 STD 원인균 탐지용 DNA 칩 또는 키트는 서열번호 1 내지 42에 기재된 염기서열을 갖는 프로브 중에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 일예에서, 상기 DNA 칩은 서로 다른 STD 원인균를 검출할 수 있는 2이상의 스팟을 포함하며, 상기 스팟은 한 종류의 STD 유형에 대해 프로브를 1종 이상, 예를 들면 2종 또는 3종의 프로브 세트를 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 칩은 하나의 STD 유형당 상이한 서열을 갖는 탐지 프로브를 2개이상, 바람직하게는 3개를 혼합하여 사용함으로써 특이도와 정확도를 높이고 교차 혼성화의 오류를 더욱 줄일 수 있는 장점이 있다.

더욱 자세하게는, 상기 DNA 칩은 프로브를 함유하는 하나 이상의 스팟을 포함할 수 있으며, 상기 스팟은 동일한 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는 스팟을 반복하여 다수 개로 설치되어, 동일한 반복실험을 하나의 DNA 칩으로 용이하고 간편하게 수행가능 하도록 하거나, 상기 스팟은 상이한 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는 스팟이 다수 개 설치되어 다양한 종류의 STD를 하나의 DNA 칩으로 간편하게 탐지 및 분석가능 하도록 한다.

상기 DNA 칩에 포함된 스팟은 1종 이상의 프로브, 예컨대 2종 이상의 프로브 세트를 포함할 수 있다. 2종 이상의 프로브를 하나의 스팟에 포함하는 경우, 이들 프로브 간에 상호 혼성화가 일어나거나 한종의 STD의 프로브가 다른 종의 STD의 시료와 상호 혼성화가 일어나지 않아야 한다. 본 발명에 따른 프로브 서열은 모두 상이한 염기서열을 갖는 것으로서, 상기 바람직하지 않은 교잡반응을 최소화하고자 하였다.

또한, 하나의 스팟에 포함되는 프로브는 한 종류의 STD에 대해 프로브를 1종 이상 포함하여 한 종류의 STD를 탐지할 수도 있고, 상이한 종류의 STD에 대한 프로브들을 혼합하여 2종 이상의 STD를 탐지할 수도 있으며, 바람직하게는 하나의 스팟은 한 종류의 STD에 대한 1종 이상의 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 하나의 스팟은 한 종류의 STD에 대한 2종 이상의 프로브 세트를 포함하여 민감도와 특이도를 증가시킬 수 있다.

구체적으로, 상기 DNA 칩은 하기 스팟들로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 스팟을 포함하는 것일 수 있다:

서열번호 1 내지 3에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 스팟,

서열번호 4 내지 6에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 스팟,

서열번호 7 내지 9에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 스팟,

서열번호 10 내지 12에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 13 내지 15에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 16 내지 18에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 19 내지 21에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 22 내지 24에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 25 내지 27에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 28 내지 30에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 31 내지 33에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 34 내지 36에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟,

서열번호 37 내지 39에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟, 및

서열번호 40 내지 42에 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 하나의 스팟.

본 발명의 일례에서, 상기 DNA 칩 또는 탐지용 분석키트는 본 기술분야 전문가가 용이하게 조합 가능한 모든 프로브 서열 세트를 포함하는 DNA 칩도 포함된다. 본 발명에 따른 DNA에 사용되는 STD 원인균 탐지용 프로브는 서로간에 서열이 모두 상이하며, 적정 GC함량, Secondary structures가 없음, 반복서열의 최소화, 비표적 서열과 75% 이하의 염기서열 동일성을 갖는 특성이 있어 이를 이용한 DNA 칩은 특이도와 정확도를 높이고 교차 교잡반응의 오류를 더욱 줄일 수 있는 장점이 있다.

한편, 상기 STD 원인균 탐지용 키트에 포함된 DNA 칩의 제조방법은 STD 원인균의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 3'말단 또는 5'말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제작하는 공정; 전기 제작된 DNA 프로브를 기능기가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및, 전기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 기능기를 환원시키는 공정을 포함한다.

상기 기능기는 알데하이드기, 아민기, 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있으며, 바람직하게는 알데하이드기일 수 있다.

이하, 본 발명의 DNA 칩 및 그의 제조방법을 공정 별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 프로브의 제작

13종의 STD와 시험대조군(IC) DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제작한다. 이때, 프로브는 13종의 STD와 시험대조군(IC) DNA의 염기서열과 상보적으로 결합하는 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되고, 합성된 염기서열이 고체의 표면에 결합될 수 있도록 염기서열의 5'말단에 아민기 또는 아민기에 티미딘(T)이 2 내지 10개 결합 화합물을 결합시켜서 프로브를 제작한다.

제 2공정: 프로브의 점적 및 고정화

전기 제작된 DNA 프로브를 알데하이드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다. 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의 알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5'말단에 결합된 아민기 또는 아민기와 티미딘이 2 내지 10개 결합한 화합물과 30 내지 40℃의 온도 조건 그리고 60 내지 70%의 습도조건에서, 시프염기반응(Schiffs base reaction)을 수행하여 고체표면에 프로브를 결합시킨다. 이때, 프로브의 농도는 10 내지 100 pmol/uL가 가능하고, 가장 바람직하게는 50 pmol/uL이다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 교잡반응에 대한 대조군 역할을 하는 위치표식자(Position Marker)를 부착하며, 상기 위치표식자는 서열번호 71로 이루어진 것 일 수 있다. 상기 위치표식자는 스팟의 위치표시 역할 및 교잡반응이 잘 일어 났는지 확인하는 역할을 한다.

제 3공정: 후처리 과정

전기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 완성한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH₄ 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.

본 발명은 시료로부터 채취한 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시키고, 증폭 된 산물과 상기 DNA 칩이 교잡반응으로 인하여 STD 균을 탐지하는 STD 원인균 탐지방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

i) 상기 STD 원인균의 탐지키트의 프라이머, 서열번호 43 내지 70의 프라이머를 사용하여, 검사할 시료로부터 채취한 DNA를 증폭시키는 단계,

ii) 전기 증폭된 DNA를 상기 탐지키트의 DNA칩에 적용하여 증폭된 DNA와 프로브를 교잡반응 하는 단계,

iii) 상기 프로브와 교잡반응 된 DNA를 상기 탐지키트의 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일례에서, 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2종 이상의 프라이머를 사용하여 동시에 증폭하는 다중 PCR(Mulitiplex PCR) 증폭법으로 수행할 수 있다.

본 발명에서, STD 프라이머를 3개 그룹으로 나누어 PCR을 진행할 수 있으며, 시험대조군(IC)은 모든 그룹에 포함하여 상기와 같이 다중(Multiplex PCR) 반응을 수행할 수 있다. 또한, 상기 13종의 STD와 시험대조군(IC)의 프라이머는 하기 표 2에 기재된 프라이머를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 STD 13종 프라이머 및 시험대조군(IC) 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 Taq 폴리머라제를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 기 기에 넣고, 94℃에서 5분간 전변성(Pre-denaturation)후, 94℃에서 50초간 변성(denaturation), 57℃에서 45초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 50초간 연장(extension) 과정을 38회 반복 후 72℃에서 10분간 더 연장(extension) 반응을 하여, 표지분자가 결합된 증폭된 DNA 시료를 수득할 수 있다.

이하, 본 발명의 13종의 STD의 탐지키트를 이용한 STD 탐지방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 시료의 수득 및 증폭

검사할 시료를 증폭시켜서 Cy3(Cyanine 3)을 포함하는 증폭시료를 수득한다: 이때, 증폭된 시료가 Cy3을 함유하기 위하여 5'말단에 Cy3가 결합된 프라이머를 이용하여 증폭시료를 수득한다. 증폭을 위한 프라이머 28개를 다음의 표 2에 나타내며, 이들 프라이머는 각각의 13종 STD 원인균과 시험대조군(IC)의 DNA 를 증폭하는 데 사용될 수 있다.

명명	서열 (5'->3')	서열번호
정방향 프라이머(EF)	CCA CAA GTA CCA TTC GTG CC	43
역방향 프라이머(EF)	CCA GGC ATG GTG TTC AAT TC	44
정방향 프라이머(MH)	CAA TGG CTA ATG CCG GAT ACG C	45
역방향 프라이머(MH)	GGT ACC GTC AGT CTG CAA T	46
정방향 프라이머(CA)	GCC GCC AGA GGT CTA AAC T	47
역방향 프라이머(CA)	CGC CTT ACC ACT ACC GTC TT	48
정방향 프라이머(GV)	TCA ATT TCA ACC GGC TCC A	49
역방향 프라이머(GV)	CCA CAA AAA CTG TGG TGT ACC AC	50
정방향 프라이머(CT)	CTA GGC GTT TGT ACT CCG TCA	51
역방향 프라이머(CT)	TCC TCA GAA GTT TAT GCA CT	52
정방향 프라이머(SA)	CTC AGC AAA TGC ATC ACA AA	53
역방향 프라이머(SA)	CCA AGC CTT GAC GAA CTA AA	54
정방향 프라이머(TV)	AGT TGA TGA AAC CTT AAC CCC TTG G	55
역방향 프라이머(TV)	CCG TTG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C	56
정방향 프라이머(MG)	ATC CTC GCT TTA GGA ACA ACT	57
역방향 프라이머(MG)	CCA ACT GCC CCC TTA TCT A	58
정방향 프라이머(HSV1)	TCT CCA AAG GTT TCT GAT ACA GT	59
역방향 프라이머(HSV1)	GTG AGC TCT GGG ACT GTA AGA	60
정방향 프라이머(NG)	GCT ACG CAT ACC CGC GTT	61
역방향 프라이머(NG)	CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA	62
정방향 프라이머(HSV2)	CAA GTT GGA TCA CAT TTC CA	63
역방향 프라이머(HSV2)	GCC GTT TAC ACC TCA AAC TT	64
정방향 프라이머(KP)	AAG ATC CAC TAT CGC CAG CAG G	65
역방향 프라이머(KP)	ATT CAG TTC CGT TTC CCA GCG G	66
정방향 프라이머(UU)	CCA TGC ACG TAA AAC ACG	67
역방향 프라이머(UU)	GTG TGC CGT TTT TCG AGT	68
정방향 프라이머(IC)	TGG GTT AAG GCA ATA GCA A	69
역방향 프라이머(IC)	TGT ATT TTC CCA AGG TTT GAA	70

제 2공정: 교잡반응 ( Hybridization )

상기 증폭시료를 DNA 칩에 적용하여, 프로브와 교잡반응을 수행한다.

제 3공정: 검출

프로브와 교잡된 DNA를 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하여 STD 원인균을 탐지한다.

표지수단은 Cy5, 비오틴 결합 화합물, Cy3, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드(Texas red) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 Cy3이다. 표지물질의 검출수단으로 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)로 스캐닝하여 읽는다.

따라서, 본 발명의 DNA 칩을 이용한 13종의 STD의 탐지키트를 사용하여, STD를 탐지할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 STD를 탐지할 수 있으므로, STD의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.

본 발명은 13종의 STD 를 탐지하는 상기 고민감도 프로브 및 이를 포함하는 마이크로어레이를 제공하여 민감하게 STD를 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 탐지된 STD의 종류를 판별할 수 있으므로, STD의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예 3에 따른 STD 시료를 이용한 검증과정을 나타내는 공정도이다.
도 2는 ㈜굿젠의 STD DNA Chip의 스팟 배열을 나타낸 그림이다.
도 3은 ㈜굿젠의 STD DNA Chip에서의 NG, CT, MH, UU, MG, TV, HSV1, HSV2, TP 및 Neg DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예의 대조군과 실시예(3개 프로브 믹스 칩)의 칩 모식도를 비교한 그림이다.
도 5은 본 발명의 실시예 3 따른 DNA 칩으로 Neisseria Gonorrea(NG) DNA를 이용한 STD 유형 검정결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3 따른 DNA 칩으로 Mycoplasma genitalium(MG) DNA를 이용한 STD 유형 검정결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4의 DNA 칩에서의 시료 검정결과 CT, GV, UU, HSV2가 양성임을 나타낸 사진이다.
도 8는 본 발명의 실시예 4의 DNA 칩에서의 시료 검정결과 CA, EF, HSV2가 양성임을 나타낸 사진이다.
도 9은 본 발명의 실시예 4의 DNA 칩에서의 시료 검정결과 MH, MG, UU가 양성임을 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4의 DNA 칩에서의 시료 검정결과 CA, CT, GV, UU가 양성임을 나타낸 사진이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 DNA 칩과 대조군 칩을 임상 검체를 이용하여 비교한 사진으로, 대조군 칩은 GV, MH, TV, UU 양성이며, 실시예의 DNA 칩은 GV, MH, TV, UU, CT 양성임을 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 DNA 칩과 대조군 칩을 임상 검체를 이용하여 비교한 사진으로, 대조군 칩은 EF 양성이며, 실시예의 DNA 칩은 EF, SA, HSV2 양성임을 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 DNA 칩과 대조군 칩을 임상 검체를 이용하여 비교한 사진으로, GV, UU 양성임을 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 DNA 칩과 대조군 칩을 임상 검체를 이용하여 비교한 사진으로, NG 양성임을 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 DNA 칩과 대조군 칩을 임상 검체를 이용하여 비교한 사진으로, GV, NG 양성임을 나타난 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 프로브의 제조 및 특성확인

1-1: 프로브의 제조

STD 감염 진단을 위하여 사용된 각 STD 13종과 시험대조군(IC)의 특이적인 프로브는 5' 말단에 Amine-TTTTTTTTTT가 포함, 위치표식자(Position Marker)는 5' 말단에 Amine-TTTTTTTTTTTTTTT가 포함 되도록 제작하였다. 각 프로브의 염기서열은 표 3과 서열목록에 나타냈다.

1-2: 프로브 특성분석

하기 표 3에 나타낸 프로브에 대해서, melting temperature 및 GC함량을 분석하여 표시하였다. 본 실시예에서 제공하는 프로브는 i) 비교적 좁은 범위의 교잡반응이 일어나는 온도(melting temperature range)을 가지며, ii) 2차 구조를 형성하지 않으며, iii) 적절한 신호강도를 갖는 40 내지 60%의 GC 함량을 가지고, iv) 교차 혼성화(cross hybridization)를 방지하기 위해 서열의 반복을 최소화하였고, v) 비표적 서열과의 염기서열의 서열동일성이 약 75% 이하임을 확인하였다.

STD	명명	서열 (5'-3')	길이 (bp)	Tm (℃)	GC 함량 (%)	서열 번호
IC	IC1	TAG GCC CTT TTG CTA ATC ATG TT	23	51.7	39	1
	IC2	CTT TGT TCC CTA AGT CCA ACT A	22	51.1	41	2
	IC3	TGG GAG GTC AGT GCA TTT AAA A	22	51.1	41	3
EF	EF1	AAG AAG TGA CTG GAA AGG AAA TC	23	51.7	39	4
	EF2	TGC CCG AGC AAT TGT TGA AC	20	51.8	50	5
	EF3	AGC GCA TGT TCC AGA AGA AG	20	51.8	50	6
MH	MH1	CGC ATG GTT CCG TTG TGA AA	20	51.8	50	7
	MH2	CCC ACC AAG ACT ATG ATG TTT A	22	51.1	41	8
	MH3	AAG GTC TTC GGA TTG TAA AGT G	22	51.1	41	9
CA	CA1	TTG CAG ATA TTC GTG AAT CAT CG	23	51.7	39	10
	CA2	TGC CTG TTT GAG CGT CGT TT	20	51.8	50	11
	CA3	CTG GGT TTG GTG TTG AGC AA	20	51.8	50	12
GV	GV1	AGT CGC TTG ATC GTT TTG TGA T	22	51.1	41	13
	GV2	AGA GAG TTA AGC GAT AGG CTT T	22	51.1	41	14
	GV3	TTG GAT GCC TTG GTA GAC AG	20	51.8	50	15
CT	CT1	ATC TTA AAA GGG ATT GCA GCT TG	23	51.7	39	16
	CT2	ATT TGC CTT AAC CCC ACC ATT TT	23	51.7	39	17
	CT3	CAA AAC CTC TTC GTT GAC CG	20	51.8	50	18
SA	SA1	GGT TCT GAA GAT CCA ACA GTA TA	23	51.7	39	19
	SA2	AAA GGT GTA GAG AAA TAT GGT CC	23	51.7	39	20
	SA3	ATT GAA GTC GAG TTT GAC AAA GG	23	51.7	39	21
TV	TV1	GTT TTC TGC ATT GAT AAC GAA GC	23	51.7	39	22
	TV2	ATC TTA ACC ACC TTG TTT CCA TG	23	51.7	39	23
	TV3	TTC TTC ATC GTT GGC TTC GC	20	51.8	50	24
MG	MG1	ACT AAA GAT TAC TGG AGA GAA CC	23	51.7	39	25
	MG2	CTG TTG AGA AAT ACC TTG ATG GT	23	51.7	39	26
	MG3	AAG GTA TGA TAA CAA CGG TAG AG	23	51.7	39	27
HSV1	HSV1_1	GCA GTA AGA CCC AAG CAT AG	20	51.8	50	28
	HSV1_2	ACA AAA ACA CAG GCG GGG TG	20	53.8	55	29
	HSV1_3	TTC TTG GAG TAC GTG GGT CA	20	51.8	50	30
NG	NG1	CTC GTT CTT GAC GCT CCA TA	20	51.8	50	31
	NG2	CGT TTA TAT CGG CGG TTA TTT TC	23	51.7	39	32
	NG3	ATG CCT CGT TGA TAT TTT TCC GT	23	51.7	39	33
HSV2	HSV2_1	TTT GTT GTG AGG AGC CAC GA	20	51.8	50	34
	HSV2_2	CGT ATT GGT ATT CGT ATC GGC	21	52.4	48	35
	HSV2_3	TTT TCC AGG GGG TGA TTA GG	20	51.8	50	36
KP	KP1	CGG TCA GCG AAA AAC ACC TT	20	51.8	50	37
	KP2	CGC CAT TAC CAT GAG CGA TA	20	51.8	50	38
	KP3	TTG ACT GCC TTT TTG CGC CA	20	51.8	50	39
UU	UU1	CGA AGA CAA AGA ACG TAA AGT TG	23	51.7	39	40
	UU2	GTA CTG CTA TTC GTT TTG AAC CA	23	51.7	39	41
	UU3	GTT ATT GAT TTA GTC GGA ACA CG	23	51.7	39	42
PM		TCA CGG TTA TCG CTG AAC TCG G	22	56.7	55	71

실시예 2: DNA 칩의 제조

표 3에 나타낸 STD 탐지용 프로브를 각각의 STD에 대해서 상이한 서열을 갖는 3개의 프로브를 혼합하여 하나의 스팟으로 DNA 칩을 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 각각의 프로브를 3X SSC(0.05 M 소디움 시트레이트, 0.45 M NaCl, pH 7.0)에 50 pmol/uL가 되도록 용해시키고, 알데히드기가 결합된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어(OmniGrid 100, Digilab, 미국)를 이용하여 크기 160 um, 간격 300 um으로 스파팅(spotting)한 다음 37℃, 습도 60 내지 70%이상의 조건에서 12시간 동안 시프염기반응(Schiff base reaction)을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액으로 슬라이드를 세척하고, 3차 증류수로 세척한 다음, NaBH4 용액(0.65 g NaBH₄, 187.5 mL phosphate buffered saline(PBS), 62.5 mL ethanol)에 7분 동안 침지하여 아민이 결합되지 않은 알데히드를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고, 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 교잡반응에 대한 대조군 역할을 하는 위치표식자(Position Marker)를 부착하였다.

실시예 3: STD 시료를 이용한 검증

3-1: STD 시료의 수득

13종의 STD EF, MH, CA, GV, CT, SA, TV, MG, HSV1, NG, HSV2, KP, UU 플라스미드 DNA와 시험대조군 IC 플라스미드 DNA를 검색시료로서 사용하였으며, 플라스미드 DNA를 검색시료의 대조군으로 사용하였다.

아울러, 표준 균주는 CCARM(EF, SA, NG), KCTC(CA, GV), ATCC(CT, MH, MG, TV, UU), KNRRC(HSV1, HSV2)에서 구입하였고, 그 외 KP는 감염이 확인 된 임상검체를 사용하여 균주별 배양 조건에 따라 배양한 후 게놈 DNA를 추출하였다. 당사에서 관리 및 배양이 불가능한 NG, MH, MG, TV, UU, HSV1, HSV2는 병원성 바이러스 은행(KBPV)에 의뢰하여 DNA를 확보하여 양성 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.

전기 선별된 DNA를 주형으로 사용하고, STD를 각각 1 그룹은 EF, MH, CA, GV, CT 및 IC, 2 그룹은 SA, TV, MG, HSV1 및 IC, 3 그룹은 NG, HSV2, KP, UU 및 IC의 총 3그룹으로 나누어, 서열번호 43 내지 70의 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR를 수행하여 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 각각의 STD의 플라스미드 DNA를 주형으로 Cy3가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

실시예 2에서 제조한 DNA 칩에 상기 수득한 증폭된 DNA시료를 적용하여, 교잡반응을 다음과 같이 수행하였다. 이때, 교잡반응실(Hybridization reaction chamber)로 70 μL 용량의 커버슬립(cover slip, GRACE Bio-Labs, USA, PC4L-1.0)을 사용하였다.

3-2: DNA 칩을 이용한 시료검정

STD의 경우는 3개 그룹의 증폭된 산물을 10 μL씩 혼합하여 반응시료로서 사용하였다. 95℃에서 5분간 변성시키고 (PCR기기 또는 Heat block 이용), 혼성화용액을 사용하여 47℃에서 실릴화된 슬라이드(silylated slide)에 고정된 프로브와 90분간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 세척용기에 세척액 Ⅰ(2X SSC와 1% SDS)을 슬라이드가 잠길 정도로 붓고 위 아래로 30회 흔들어주고 세척액에 잠긴 상태로 50℃에서 5분간 두고, 새로운 세척용기에 세척액 Ⅱ (2X SSC)을 슬라이드가 잠길 정도로 붓고 위 아래로 30회 흔든 후 상온에 1분간 두었다. 사용한 세척액을 버리고 세척액 Ⅱ를 슬라이드가 잠길 정도로 붓고 위 아래로 30회 흔든 후 상온에 1분간 두었다. 세척이 끝나면 스핀 건조기(spin dryer)를 사용하여 건조하였다.

대조군으로 자사(㈜랩지노믹스) 제품인 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA 칩(STDetect Chip)을 사용하였으며, 상기 실험방법과 동일하게 진행하였다. 대조군과 실시예(3개 프로브 믹스 칩)의 칩 모식도 비교사진을 도 4에 나타냈다.

이를 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GenePix 4000B, Axon, 미국)를 이용하여 형광신호를 분석하였다 (excitation 532 nm), 본 실시예에서 얻어진 결과 중에서, STD 13종 중 Neisseria Gonorrea(NG) 및 Mycoplasma genitalium(MG)에 대해서 표 1에 나타낸 각 유형에 대한 3가지 프로브의 혼합물을 하나의 스팟에 포함되도록 하고, 동일한 스팟을 각 유형별로 3개씩 제조한 DNA 칩을 활용한 STD 유형 검정결과를 도 5 내지 도 6에 나타냈다.

또한 표준물질로 상기 3-1에서와 동일한 표준물질을 사용하였으며, 민감도 부분 확인하고자 표준물질의 농도를 점증적으로 증가시키면서, 각각에 대해 실험하였다. 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 표준물질의 농도가 낮을 때 시그널이 강하게 나오면 민감도가 더욱 우수하다고 할 수 있으며, 대조군인 STDetect Chip에 비해서, 본원 발명에 따른 프로브를 사용한 DNA 칩이 더욱 우수한 민감도를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4: 임상 시료를 이용한 검증

4-1: 임상 시료의 수득

환자가 STD에 감염되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 먼저 환자의 소변 또는 여성환자 질 Swab을 이용하여 전기 조직에서 DNA를 추출하고, 정제하였다. 전기 정제된 DNA를 주형으로 하고, STD를 각각 1 그룹은 EF, MH, CA, GV, CT 및 IC, 2 그룹은 SA, TV, MG, HSV1 및 IC, 3 그룹은 NG, HSV2, KP, UU 및 IC의 총 3그룹으로 나누어, 하기 표 7에 서열번호 43 내지 70을 이용하여 PCR을 수행함으로써 Cy3가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

추출된 DNA를 i-StarMax^TMⅡ DNA Polymerase (5U/μL) 2.5 U, dNTPs 2.5 mM each, PCR Reaction Buffer 1x, Gel Loading Buffer 1x 를 구성하는 2X PCR Master mix Solution(intron, Korea)를 이용하여 20 μL 의 반응혼합물을 PCR 기기(VERITI, Applied Biosystems)에 넣고, 94℃에서 5분간 전변성(Pre-denaturation)후, 94℃에서 50초간 변성(denaturation), 57℃에서 45초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 50초간 연장(extension) 과정을 38회 반복 후 72℃에서 10분간 더 연장(extension) 반응을 하여, Cy3 표지분자가 결합된 증폭된 DNA 시료를 수득하였다.

4-2: DNA 칩을 이용한 시료검정

상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GenePix 4000B, Axon, 미국)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation 532 nm). 그 결과를 도 7 내지 10에 나타내었으며, 대조군으로 ㈜랩지노믹스의 STDetect Chip을 사용하여 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 비교한 결과를 도 11 내지 15에 나타내었다.

도 11 내지 15는 동일 임상검체를 이용하여 대조군과 실시예(3개 프로브 믹스)를 비교한 결과이다. 도 11은 대조군은 GV, MH, TV, UU만 양성이나, 실시예는 GV, MH, TV, UU와 함께 CT도 양성 결과가 나타났다. 도 12는 대조군은 EF만 양성이나 실시예는 EF와 함께 SA 및 HSV2도 양성 결과가 나타났다. 도 13은 대조군과 실시예 모두 GV, UU가 양성 결과가 나타났으나, 대조군에 비해 실시예에서 UU 시그널이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 도 14는 대조군과 실시예 모두 NG가 양성 결과가 나타났으나, 대조군에 비해 실시예에서 NG 시그널이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 도 15는 대조군과 실시예 모두 GV, NG가 양성 결과가 나타났으나, 대조군에 비해 실시예에서 GV, NG 시그널이 현저히 높은 것을 확인 할 수 있었다.

본원발명 실시예의 DNA 칩에서는 대조군 칩에서 검출해내지 못한 원인균을 검출해내는 결과를 보였으며(도 11 및 12), 대조군 칩에서 시그널이 낮은 원인균에 대해 현저히 높은 시그널을 나타내는 결과를 보였다 (도 13 내지 15). 즉, 도 11 내지 15에서 확인할 수 있듯이 본원발명 실시예의 DNA 칩의 민감도와 특이도가 대조군 칩에 비해 현저히 우수함을 확인하였다.

<110> Labgenomics <120> High Definition Probe for detecting microorganism causing sexually transmitted disease and kit using the same <130> DPP20145539KR <160> 71 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC1 <400> 1 taggcccttt tgctaatcat gtt 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC2 <400> 2 ctttgttccc taagtccaac ta 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC3 <400> 3 tgggaggtca gtgcatttaa aa 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1 <400> 4 aagaagtgac tggaaaggaa atc 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF2 <400> 5 tgcccgagca attgttgaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF3 <400> 6 agcgcatgtt ccagaagaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH1 <400> 7 cgcatggttc cgttgtgaaa 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH2 <400> 8 cccaccaaga ctatgatgtt ta 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH3 <400> 9 aaggtcttcg gattgtaaag tg 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA1 <400> 10 ttgcagatat tcgtgaatca tcg 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA2 <400> 11 tgcctgtttg agcgtcgttt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA3 <400> 12 ctgggtttgg tgttgagcaa 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GV1 <400> 13 agtcgcttga tcgttttgtg at 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GV2 <400> 14 agagagttaa gcgataggct tt 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GV3 <400> 15 ttggatgcct tggtagacag 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT1 <400> 16 atcttaaaag ggattgcagc ttg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT2 <400> 17 atttgcctta accccaccat ttt 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT3 <400> 18 caaaacctct tcgttgaccg 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA1 <400> 19 ggttctgaag atccaacagt ata 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA2 <400> 20 aaaggtgtag agaaatatgg tcc 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3 <400> 21 attgaagtcg agtttgacaa agg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV1 <400> 22 gttttctgca ttgataacga agc 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV2 <400> 23 atcttaacca ccttgtttcc atg 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV3 <400> 24 ttcttcatcg ttggcttcgc 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG1 <400> 25 actaaagatt actggagaga acc 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG2 <400> 26 ctgttgagaa ataccttgat ggt 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG3 <400> 27 aaggtatgat aacaacggta gag 23 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV1_1 <400> 28 gcagtaagac ccaagcatag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV1_2 <400> 29 acaaaaacac aggcggggtg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV1_3 <400> 30 ttcttggagt acgtgggtca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG1 <400> 31 ctcgttcttg acgctccata 20 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG2 <400> 32 cgtttatatc ggcggttatt ttc 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG3 <400> 33 atgcctcgtt gatatttttc cgt 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2_1 <400> 34 tttgttgtga ggagccacga 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2_2 <400> 35 cgtattggta ttcgtatcgg c 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2_3 <400> 36 ttttccaggg ggtgattagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KP1 <400> 37 cggtcagcga aaaacacctt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KP2 <400> 38 cgccattacc atgagcgata 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KP3 <400> 39 ttgactgcct ttttgcgcca 20 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU1 <400> 40 cgaagacaaa gaacgtaaag ttg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU2 <400> 41 gtactgctat tcgttttgaa cca 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU3 <400> 42 gttattgatt tagtcggaac acg 23 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer (EF) <400> 43 ccacaagtac cattcgtgcc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (EF) <400> 44 ccaggcatgg tgttcaattc 20 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer (MH) <400> 45 caatggctaa tgccggatac gc 22 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (MH) <400> 46 ggtaccgtca gtctgcaat 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (CA) <400> 47 gccgccagag gtctaaact 19 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (CA) <400> 48 cgccttacca ctaccgtctt 20 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (GV) <400> 49 tcaatttcaa ccggctcca 19 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (GV) <400> 50 ccacaaaaac tgtggtgtac cac 23 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (CT) <400> 51 ctaggcgttt gtactccgtc a 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (CT) <400> 52 tcctcagaag tttatgcact 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (SA) <400> 53 ctcagcaaat gcatcacaaa 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (SA) <400> 54 ccaagccttg acgaactaaa 20 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (TV) <400> 55 agttgatgaa accttaaccc cttgg 25 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (TV) <400> 56 ccgttgaggg gttttccatt tttgc 25 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (MG) <400> 57 atcctcgctt taggaacaac t 21 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (MG) <400> 58 ccaactgccc ccttatcta 19 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (HSV1) <400> 59 tctccaaagg tttctgatac agt 23 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (HSV1) <400> 60 gtgagctctg ggactgtaag a 21 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (NG) <400> 61 gctacgcata cccgcgtt 18 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (NG) <400> 62 cgaagacctt cgagcagaca 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (HSV2) <400> 63 caagttggat cacatttcca 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (HSV2) <400> 64 gccgtttaca cctcaaactt 20 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (KP) <400> 65 aagatccact atcgccagca gg 22 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (KP) <400> 66 attcagttcc gtttcccagc gg 22 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (UU) <400> 67 ccatgcacgt aaaacacg 18 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (UU) <400> 68 gtgtgccgtt tttcgagt 18 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer (IC) <400> 69 tgggttaagg caatagcaa 19 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer (IC) <400> 70 tgtattttcc caaggtttga a 21 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Position marker (PM) <400> 71 tcacggttat cgctgaactc gg 22

Claims

서열번호 1 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 2 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 3 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 4 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 5 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 6 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 7 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 8 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 10 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 11 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 12 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 13 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 14 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 15 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 16 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 17 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 18 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 19 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 20 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 21 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 22 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 23 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 24 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 25 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 26 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 27 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 28 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 29 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 30 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 31 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 32 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 33 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 34 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 35 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 36 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
서열번호 37 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 38 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 39 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟, 및
서열번호 40 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 41 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 42 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 스팟,
을 포함하는 성인성 질병(sexually transmitted disease, STD) 원인균 탐지용 DNA 칩.
제1항에 있어서, 상기 성인성 질병 원인균은 Neisseria Gonorrea(NG), Chlamydia trachomatis(CT), Ureaplasma urealyticum(UU), Mycoplasma genitalium(MG), Mycoplasma hominis(MH), Trichomonas vaginalis(TV), Gardnerella vaginalis(GV), Candida albicans(CA), Klebsiella pneumonia(KP), Enterococcus fecalis(EF), Staphylococcus aureus(SA), HSV1 (Herpes simplex virus-type1), 및 HSV2 (Herpes simplex virus-type2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, STD 원인균 탐지용 DNA 칩.
제1항에 있어서, 상기 프로브의 3'말단 또는 5'말단에, 아민기, 또는 아민기에 티미딘(T)이 2 내지 10개 결합된 화합물이 추가로 결합된 것인, STD 원인균 탐지용 DNA 칩.
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제1항에 있어서, 상기 DNA 칩은 프로브의 위치와 혼성화 반응의 여부를 알려주는 서열번호 71의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 위치표식자(Position Marker, PM)를 추가로 포함하는, STD 원인균 탐지용 DNA 칩.
제1항 내지 제3항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 STD 원인균 탐지용 DNA 칩,
시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 서열번호 43 내지 70으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머, 및
상기 DNA 칩과 교잡되는 증폭된 시료 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 STD 원인균 탐지키트.
제11항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy3, Cy5, 비오틴-결합물질, EDANS(5'-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, STD 원인균 탐지키트.
제11항에 있어서, 상기 시료 DNA의 PCR 증폭은,
94 내지 95℃에서 50초 내지 2분간 변성(denaturation),
50 내지 60℃에서 30초 내지 50초간 프라이머 결합(annealing), 및
72℃에서 50초 내지 1분간 연장(extension),
으로 이루어진 과정이 38사이클 수행되는 것인, STD 원인균 탐지키트.