CN108018333B - 一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。该试剂盒含有42条探针，所述的探针为SEQ ID NO.1～42所示的核苷酸序列。本发明通过特异性引物、探针设计，采用基因芯片方法，可实现多达6种实验动物重要病原体、42种特异性探针的一次性高通量快速检测，为后续病原控制和政府决策提供依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法。
背景技术
医学实验动物是生物医学研究不可缺少的组成部分。实验动物源性的烈性传染病、人畜共患病病原体不仅影响动物的正常生存和科学实验的结果，还对科研人员的健康乃至生命带来重大威胁，随着转基因动物的推广使用，我省近几年已多次发生实验动物来源的重要病原体感染事件，对社会生物安全的威胁日趋增大。2008年，浙江省杭州市某实验动物繁育机构突发疑似大鼠种群污染汉坦病毒事件，由于缺乏多病原的快速鉴别诊断技术等原因，导致病原确诊过程长达数周，该事件在浙江省科研、卫生系统内一度引起恐慌，最终导致大批大鼠被扑杀。2009年某实验豚鼠和实验兔养殖基地发生沙门氏菌感染，因病原鉴别诊断滞后导致大批动物死亡。2011年杭州市某高校实验动物中心暴发疑似鼠痘病毒感染事件，由于发病症状复杂(部分症状不符合典型Ect感染特征)、检测手段单一、缺乏系统完善的鉴别诊断技术等，虽然血清病毒抗体ELISA阳性诊断经多省权威机构验证，但因抗体验证长达数月、缺乏其他病原体排除方法等验证手段，严重延误了病原确诊和应急处置，这些事件无不警示我们建立实验动物重要病原体快检技术的必要性和迫切性。
近年来，普通PCR技术和核酸杂交技术的应用大大的促进了病原微生物检测的发展。鉴于实验动物公共安全的重要性，仙台病毒、小鼠肝炎病毒、弓形虫、支原体、沙门氏菌和鼠痘病毒这六种病原体在国内外已有PCR检测方法的报道，项目组也已建立具备独立知识产权的PCR检测技术，如用于弓形虫抗原检测的保守基因主要是B1基因、P30基因和核糖体DNA等，其中又以高度特异的35拷贝Bl基因应用最为广泛。汉坦病毒为单股负链RNA病毒，基因组S段与L段相对保守，但在不同毒株间也有较高多样性，因此采用常规的RT-PCR法检测较困难，需根据不同毒株序列单独设计引物和探针进行独立检测和分型，朱进等根据该特点研究建立了针对汉坦病毒的微阵列芯片检测技术。袁文等针对小鼠肝炎病毒核衣壳蛋白基因序列设计了6条特异性引物，建立的逆转录环介导等温扩增检测技术可检测0 .1pg/μL RNA。有文献根据仙台病毒F蛋白基因建立RT-PCR的检测方法。泰泽病原体是一种专营细胞内寄生的革兰阴性杆菌，其分子生物学检测主要针对196bp DNA和16S rRNA等。
上述方法有效填补了病原体在国家标准中缺乏分子诊断技术的空白，但是：①近年发生的多起感染事件，其病理变化和流行特点往往疑似多种病原或呈混合感染，均需进行鉴别诊断和多病原排除；②现有PCR技术均以检测一种或少数几种细菌或病毒为主，且多针对某一保守基因设计单独引物、探针等。应用现有PCR方法多次甚至反复针对不同病原的检测可能都无法精确定位到病原体，现有检验方式难以满足快速、高通量的多病原筛查要求，微阵列芯片恰恰具有高通量、集成化、微型化、自动化并且快速、特异性强等特点，该方法已应用于细菌耐药性监测与药物筛选、基因多态性和基因突变分析、转基因食品检测等领域。目前国内外仅实验动物全球最大供应商—Charles River建立了病原体PRIA微阵列芯片检测法，此芯片一次检测二十多种病原，已广泛用于该公司内部的实验动物健康检查和质量控制，但该方法根据北美特点检测了支原体、沙门氏菌、支气管鲍特杆菌、鼠棒状杆菌等人畜共患病病原，其他二十多种均是国内SPF等级以上需排除病原，我国国家标准中清洁级动物(该等级啮齿动物在国内使用范围最广)明确需要排除的汉坦病毒、LCMV、仙台病毒、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒以及弓形虫、泰泽病原体均未列入芯片检测中，因此该芯片并不适用于我国目前的现状。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法的技术方案。
所述的一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒，其特征在于含有42条探针，所述的探针为SEQ ID NO .1～42所示的核苷酸序列。
所述的试剂盒在同时检测六种实验动物病原体中的应用，所述的六种实验动物病原体为仙台病毒、小鼠肝炎病毒、弓形虫、支原体、沙门氏菌和鼠痘病毒。
所述的利用试剂盒同时进行六种实验动物病原体检测的方法，其特征在于包括以下步骤：以检测样品的DNA/cDNA为模板，以引物组进行平板PCR扩增，随后用带荧光素标记的随机引物进行标记，扩展产物与基因芯片杂交，当扫描结果出现荧光信号时，判断样本中含有该病原，上述的方法用于非疾病的诊断与治疗。
所述的方法，其特征在于所述的引物组包括7对引物，所述的引物组中的上下游引物为SEQ ID NO .43～56所示的核苷酸序列。
所述的方法，其特征在于所述的平板PCR体系中含有检测样品的DNA/cDNA10μL、引物组1μL、Taq酶2μL、BSA 1μL、Glycerol 5μL、ddH2O补足100μL。
所述的方法，其特征在于所述的平板PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环40次，最后72℃总延伸10min。
所述的方法，其特征在于所述的荧光标记中荧光标记体系含有PCR产物5μL、荧光素标记的随机引物(9N)3μL、5×Klenow Buffer 2 .5μL、klenow酶1μL、ddH2O补足25μL。
所述的方法，其特征在于所述的荧光标记的反应条件：37℃ 1.5h，70℃，10min。
本发明的有益效果：本发明通过特异性引物、探针设计，采用基因芯片方法，可实现多达6种实验动物重要病原体、42种特异性探针的一次性高通量快速检测，为后续病原控制和政府决策提供依据。
附图说明
图1-7分别为仙台病毒、小鼠肝炎病毒、弓形虫、支原体、沙门氏菌、鼠痘病毒及阴性对照基因芯片检测结果。
具体实施方式
为了使本发明更容易理解，下面结合具体的步骤，进一步阐述本发明。应理解，这些实验方法仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围，下列步骤中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例
1 .点制芯片：
1 .1芯片中含有42条微生物检测探针，HEX为点样质控探针；NC为杂交阴性质控探针；PC为杂交阳性质控探针。芯片点制采用了博奥基因芯片微量点样技术，芯片中每个点的直径为150μm，点间距为300μm，点阵布局请见下表。
表1基因芯片点阵布局表
表2六种实验动物病原微生物引物信息表
表3探针序列信息表
1 .2点制完芯片后，固定，方法如下：
a)65℃水浴锅熏两次，各10s，正面朝下，间隔要等蒸汽干后；
b)置于紫外交联仪250UV；
c)置于42-45℃ 0.5％SDS中，在水平摇床上洗摇10min；
d)置于42-45℃超纯水中，在水平摇床上洗摇1min；
e)在清洗仪上甩干。
2 .平板PCR扩增
2 .1PCR扩增芯片芯片清洗
A .清洗：拿出要洗的片子，先用无菌水冲洗两到三次，后用95％的无水乙醇清洗槽孔再次用无菌水冲洗30～60s无味即可；
B .离心：常温离心机1000转，离心3min；
C .烘干：微波炉(型号:P7D20L-DE(WO))小火，烘干3min。注：槽孔朝上；
D .存放：将洗好的干燥片子收集在自封袋里，放在体系间干燥的柜子里备用。
2 .2点片子:配好点样液后，平板上先标记好引物名称，然后点1μl点样液于槽孔中间位置，55℃烘干，然后封膜。
注：除汉坦病毒的混合引物是100μM，其他都用10μM。
注：总体积是100μl，根据需求可减少体系中水的量，增加模板量。
2 .3压膜:压膜机在95℃膜朝上压制4次，膜压制到凹陷于槽孔为最好，将压好膜的多余部分用剪刀裁剪掉，平板做好备用。
2 .4加样:取出先前配好的体系，加入相应模板(90ul体系+10ul模板)震荡离心后，打入90ul的扩增样于平板通道，将通道口用抽纸擦拭干净后用封口膜封好，离心(规格型号:X-22R生产厂家：BECKMAN)离心要求转速：3000转子：2096时间：3min使通道液体全部被甩入反应孔中。
2 .5上机:平板pcr仪机器型号：eppendorf，热循环程序如下：
2 .6平板取液检测:平板扩增结束后下机，离心，使试剂从反应孔甩到通道取液，在体系分析区掀下平板封口膜，然后将平板液体吸到小试管中，备用。3 .标记
a)取5μL混合的PCR产物至无菌洁净的0 .2ml离心管中，作为待标记的模板；
b)向每个样品管加入浓度为100μM的带有荧光素(cy5/cy3/tamra等)标记的随机引物(9N)溶液3μL，并补水至19μL，震荡混匀，瞬时离心；
c)将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3min，立即放置冰上3min；
d)荧光标记反应体系Mix：5×Klenow Buffer，2.5μL；klenow酶1μL；dNTP(2.5mM)，2 .5μL；
e)将步骤c)样品管瞬时离心，并向各管中加入6μL荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，瞬时离心；
)将离心管放入PCR仪，37℃1 .5h，70℃10min；
g)程序结束后，将样品置于冰上，然后进行下一步芯片杂交。
4 .杂交
a)将4×杂交buffer在60℃融化，配制杂交体系：4×杂交缓冲液5μL，荧光标记产物15μL，95℃变性3min，立即放置冰上，备用；
b)打开基因芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交和底部凹槽内加入约200μL灭菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发；
c)将芯片正面朝上(标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；
d)放上芯片盖片(有凸台的一面朝向芯片)，上端先接触芯片，再缓缓盖下；
e)将a)步骤样品管瞬时离心，用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜；
f)将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中，扣上盖板后，分别将两个金属夹完全卡进两侧，避免杂交盒震动；
g)将杂交盒60℃水浴2h，杂交更长时间或过夜不影响检测结果。
5 .芯片清洗
5 .1使用晶芯®SlibeWasherTM8芯片清洗仪对芯片进行清洗。
a)将已经配制好的洗液I(2×SSC，0 .2％SDS)，洗液II(0 .2×SSC)各500ml分别倒入与芯片清洗仪相连的洗液I，洗液II试剂瓶内。
b)打开晶芯®SlibeWasherTM8芯片清洗仪，设置清洗程序：60℃，洗液I清洗2次，每次120秒，60℃，洗液II清洗3次，每次80秒，离心甩干。选择开始按钮，清洗程序开始运行。
c)当清洗仪内洗液I注满，按仪器提示，将杂交结束的芯片从芯片盒中取出，快速将盖玻片在芯片清洗仪的盖片收集槽中去掉，然后把芯片标签朝下放入清洗仪内的芯片架里。选择确认按钮，芯片开始清洗。
d)芯片清洗完成后，清洗仪提示将芯片架放入干燥室进行离心干燥，按照提示说明操作后，点击确认按钮，开始离心(约1500rpm离心1min)。
e)离心结束后，取出芯片，此时的芯片可以进行扫描。
5 .2手洗：洗液I和洗液II加热至60℃，先后置于摇床清洗4min，清洗仪甩干。
6 .扫描和分析
使用博奥LuxScan10K扫描仪完成芯片扫描和读片，其中阴性、阳性质控均需成立。图1-7分别为仙台病毒、小鼠肝炎病毒、弓形虫、支原体、沙门氏菌、鼠痘病毒及阴性对照基因芯片检测结果。
部分样品的特异性探针在检测中未显示阳性结果，是由于在探针设计时，根据同种致病菌不同亚型的序列信息，设计了针对不同亚型的特异性探针。特异性探针中，只要有一个阳性信号，就表明样品中含有该致病菌。
另外，使用该方法检测了17个病原分离株和12个病原阳性株，结果与PCR检测结果一致。同时检测15个动物粪便临床核酸样本，在阴性、阳性质控均成立的条件下，所有样本检测结果为阴性，结果与PCR检测结果一致。
病原样品标准株和分离株收集信息
序列表
<110> 杭州师范大学,浙江省医学科学院
<120> 一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 1
ctcataggtt aaaagacacg gcaacccaga tgaagttctc 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 2
cataggttaa aagacacggc aacccagatg aagttctcca 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 3
tgagatatcg tggatggaag ctgccctcat agcccagaca 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 4
agatatcgtg gatggaagct gccctcatag cccagacaag 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 5
gaaaatctaa agctgctgac tcctgtttct acatcaacta 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 6
tagtgttgca ctggagaact tcatctgggt tgccgtgtct 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 7
cccgtaaaca tgattcgtgc tgttcgcata cggatagatt 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 8
ttaacatttg tcaagctgtt tccgccaatg tatgctcgct 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 9
ctcgcggtgt tcctgtagtt ataggcacca cgaagttcta 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 10
tagattctat cgtcttgcga acgagtgcgc ccaagttttg 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 11
tcctgtagtt ataggcacca cgaagttcta tggcggttgg 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 12
aacatatcat cccaaccgcc atagaacttc gtggtgccta 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 13
aagggttgcg ctcgttgcag gacttaaccg aacatctcac 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 14
ggataagggt tgcgctcgtt gcaggactta accgaacatc 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 15
cctcccgatt actcgggcag tctccttaga gtgctcaact 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 16
gacagatggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 17
aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccatc 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 18
ggataagggt tgcgctcgtt gcaggactta accgaacatc 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 19
atgctgagaa gtagaatagc cacaatggga ctgagacacg 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 20
tgctggcaca tagttagtcg tcacttattc aaaatggtac 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 21
tctagccatt acctgctaaa gtcattcttc ccaaataaaa 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 22
tacagtcaaa ctctagccat tacctgctaa agtcattctt 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 23
tattcaaaat ggtacagtca aactctagcc attacctgct 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 24
ttaccgcgac tgctggcaca tagttagtcg tcacttattc 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 25
tgaggattct gtcaatgtag aacgacccca taaacaccaa 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 26
tacgatattc agtgcgatca ggaaatcaac cagataggta 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 27
atcaaccaga taggtaggta atggaatgac gaacatagaa 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 28
caaccagata ggtaggtaat ggaatgacga acatagaaat 40
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 29
tgcgatcagg aaatcaacca gataggtagg taatggaatg 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 30
tcatttctat gttcgtcatt ccattaccta cctatctggt 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 31
tccgccatca ccacgaggaa agcgtcgtct cgtctggatc 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 32
ctcctcctcc cttcgtccaa gcctccgact ctgtctccct 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 33
ctacccctcc tcctcccttc gtccaagcct ccgactctgt 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 34
cctccgactc tgtctccctc gccctcttct ccactcttca 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 35
cgtccaagcc tccgactctg tctccctcgc cctcttctcc 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 36
tcccttcgtc caagcctccg actctgtctc cctcgccctc 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 37
actcggaagt tgatatggta ctgctgcttc ctatactcga 40
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 38
taactcggaa gttgatatgg tactgctgct tcctatactc 40
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 39
tgcactgcgt tgtgaggtct tgatgtactt tatcgtttgt 40
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 40
cttgcactgc gttgtgaggt cttgatgtac tttatcgttt 40
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 41
cgttgataaa ctagcaactt caggtttctt tacaaacgat 40
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> probe
<400> 42
gtcgttgata aactagcaac ttcaggtttc tttacaaacg 40
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 43
gcytacggga chgatgagrt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 44
attgttatga accgacttgc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 45
aggcattatc atttgaggag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 46
cttcaatttt gtgtccattg 20
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> primer
<400> 47
cgctgcaggg aggaagacga aagttg 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> primer
<400> 48
cgctgcagac acagtgcatc tggatt 26
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<400> 49
cgtagaacct tacccactct tg 22
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 50
tttgctccat gtcaccactt 20
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> primer
<400> 51
aagggttcgt tatttgatga g 21
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> primer
<400> 52
tcgccttcgc cactg 15
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> primer
<400> 53
grgtcatccc caccgaa 17
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 54
aacagtgctc gtttacgacc 20
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> primer
<400> 55
ctgcgaattt gaaggatc 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> primer
<400> 56
cgtcgtgggt gttagttg 18
Claims (5)
1.一种探针在制备同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒中的应用，该探针含有42条探针，所述的探针为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，所述的六种实验动物病原体为仙台病毒、小鼠肝炎病毒、弓形虫、支原体、沙门氏菌和鼠痘病毒；
所述基因芯片试剂盒同时检测六种实验动物病原体包括以下步骤：以检测样品的DNA/cDNA为模板，以引物组进行平板PCR扩增，随后用带荧光素标记的随机引物进行标记，标记产物与基因芯片杂交；
所述的引物组包括7对引物，所述的引物组中的上下游引物为SEQ ID NO.43 ~SEQ IDNO.56所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的平板PCR体系中含有检测样品的DNA/cDNA 10μL、引物组1μL、Taq酶2μL、BSA 1μL、Glycerol 5μL、ddH2O补足100μL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的平板PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸150s，循环40次，最后72℃总延伸10min。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述标记步骤中的荧光标记体系含有PCR产物5μL、荧光素标记的随机引物9N 3μL、5×Klenow Buffer 2.5μL、klenow酶1μL、ddH2O补足25μL。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述标记步骤中的反应条件：37℃ 1.5h，70℃10min。
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