CN104611471B - 用于检测口蹄疫病毒的基因芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测口蹄疫病毒的基因芯片及其检测方法。通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，可检测口蹄疫病毒以及对口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型、口蹄疫病毒O型进行分型。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测口蹄疫病毒及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型、口蹄疫病毒O型的方法。

Description

用于检测口蹄疫病毒的基因芯片及其检测方法

技术领域

本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及口蹄疫病毒基因芯片及检测方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的以口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹为主要症状的急性、烈性、接触性传染病,又称为“口疮”、“辟癀”“5号病”等。FMDV主要侵害猪、牛、羊等主要家畜和其他家养、野生偶蹄动物，宿主范围广泛，易感动物多达70多种。该病传播途径多，速度快。大多数国家都属于“口蹄疫疫区”，非口蹄疫的国家或区域仅占少数。2013年，全球口蹄疫疫情集中在亚、非地区以及与亚洲相邻的欧洲部分地区暴发，全球共有44个国家或地区报告发生口蹄疫疫情或分离到口蹄疫病毒。多次世界范围内的暴发流行，造成巨大的政治、经济损失。

FMDV属于微RNA病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，与所有微RNA病毒一样含有单股正链RNA基因组，其长度约8300nt，其功能如同mRNA，编码病毒聚蛋白。FMDV包括A型、O型、C型、亚洲I(Asia1)型、SATⅠ型、SATⅡ型和SATⅢ型7个血清型，每个血清型又有许多不同的亚型，各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的诊断和防控更加困难。在我国，口蹄疫的流行形势比较严峻，目前仅分离得到A型、O型和Asia 1型。近年来，A型和O型口蹄疫疫情不断发生，给养殖户造成重大的经济损失。不同血清型、不同遗传谱系口蹄疫病毒的混杂存在及周边国家口蹄疫疫情复杂、流行毒株跨境传播的威胁，进一步加大了我国口蹄疫防控的复杂性和难度。因此，建立一种快速检测口蹄疫病毒及区分血清型的方法有助于该病的防控和诊治。在动物及其副产品的进出口检疫中也有着重要意义。

口蹄疫与水疱性口炎、猪水疱病等疾病临床症状相似，需依靠实验室诊断进行确诊。病毒分离技术是诊断口蹄疫的金标准，但该方法操作繁琐，且对实验室级别要求严格。补体结合试验是检测口蹄疫最早的标准化方法，但受到灵敏度的限制。1991年，Meyer等根据编码的FMDVRNA多聚酶基因序列设计合成了一对引物和探针，首次应用PCR技术对口蹄疫进行检测，随后出现大量用于口蹄疫检测的PCR方法。随着分子生物学技术的不断发展，出现了很多新型的诊断技术，例如：免疫层析快速诊断试纸条、核酸杂交技术、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、基因芯片技术等。基因芯片(Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成病菌病毒检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。Baxi MK等基于口蹄疫病毒的不同血清型及亚型建立了cDNA芯片，实现了口蹄疫病毒的高通量检测。寡聚核苷酸芯片比cDNA芯片具有更高的灵敏度和特异性。寡聚核苷酸芯片在口蹄疫病毒的检测中应用较少。

发明内容

为了克服现有检测方法的不足，本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片，用于检测口蹄疫病毒，并同时能够区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型和口蹄疫病毒O型。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于口蹄疫病毒检测的基因芯片检测装置，包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、口蹄疫病毒A型的一条检测探针核苷酸序列、口蹄疫病毒亚洲I型的一条检测探针核苷酸序列、口蹄疫病毒O型的一条检测探针核苷酸序列、口蹄疫病毒通用型的一条检测探针核苷酸序列、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照和杂交盒。

采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO5.；

杂交阳性质控分区P2，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.6；

杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区内包括下述至少一个待测样品探针的分区：

口蹄疫病毒A型探针分区，

口蹄疫病毒亚洲I型探针分区，

口蹄疫病毒通用型探针分区，

口蹄疫病毒O型探针分区。

各个探针序列如下：

口蹄疫病毒A型探针：SEQ ID NO.1；

口蹄疫病毒亚洲I型探针：SEQ ID NO.2；

口蹄疫病毒通用型探针：SEQ ID NO.3

口蹄疫病毒O型探针：SEQ ID NO.4。

利用上述基因芯片检测口蹄疫病毒以及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型及口蹄疫病毒O型的检测方法，具体步骤如下：

(1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备待测样品cDNA，用作待测样品DNA；

(2)PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 6.6μL、待测样品DNA3μL、无核酸酶灭菌水2.9μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.7 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.8 0.2μL，

20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.9 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.10 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫通用型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫通用型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.14 0.2μL,

20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.15 4μL，

20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.16 1μL；

按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃10min；

(3)杂交:首先配制杂交液：杂交缓冲液7.8μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.2μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后采用15μL杂交液进行杂交；

(4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

本发明根据我国常见的口蹄疫病毒A型、O型及亚洲Ⅰ型的基因序列，选择保守区域设计探针用于口蹄疫病毒的检测。另外，根据三种血清型的差异序列设计探针用于区分不同血清型。从而可以区分出三种不同的血清型。该检测为口蹄疫疫病的“早发现、早隔离、早处理”提供了有效保证。

(1)成功地构建了FMDV检测基因芯片：本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。

(2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、灵敏度高，可达10²拷贝/μL、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。

(3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物和其副产品的检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫工作的需要，控制口蹄疫病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。

附图说明

图1芯片探针分布示意图；

图2口蹄疫病毒A型杂交结果示意图；

图3口蹄疫病毒亚洲I型杂交结果示意图；

图4口蹄疫病毒O型杂交结果示意图；

图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；1-口蹄疫病毒A型探针分区；2-口蹄疫病毒亚洲I型探针分区；3-口蹄疫病毒通用型探针分区；4-口蹄疫病毒O型探针分区；5-水疱性口炎病毒探针分区；6-猪水疱病病毒探针分区；7-蓝舌病病毒探针分区；8-小反刍兽疫病毒探针分区；N-杂交阴性质控分区；

杂交说明：P1：探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；

P2：杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；

N：杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；

口蹄疫A型病毒c DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，1号、3号探针亮；

口蹄疫亚洲I型病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，2号、3号探针亮；

口蹄疫O型病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，3号、4号探针亮。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。

实施例1，本发明是基于对口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型及口蹄疫病毒O型的细胞增殖，提取病毒基因组。选取不同的特异保守序列设计了4条寡核苷酸探针，可与相应的病毒cDNA的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，通用上游引物5′端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在50℃下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来鉴定口蹄疫病毒及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型及口蹄疫病毒O型。根据Genbank网站上公布的口蹄疫病毒不同型的基因序列利用Primer Premier 5.0生物软件设计PCR引物SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16克隆基因序列，并进行测序、比对分析，选取差异性序列在利用Primer Premier生物软件设计所述6条特异性寡核苷酸探针，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6。通过上述引物和探针，可快速、特异、敏感的鉴别区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型和口蹄疫病毒O型。

每条探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列如下：

口蹄疫病毒A型探针SEQ ID NO.1为：

5'-NH₂-T₁₅-ATGACAGTGGCTCGAATCGCACCGAAGTTGAAAGAAG；

口蹄疫病毒亚洲I型探针SEQ ID NO.2为：

5'-NH₂-T₁₅-GTAAGGGAGTGCCAGGCGGGTAATGGGTTG；

口蹄疫病毒通用型探针SEQ ID NO.3为：

5'-NH₂-T₁₅-AAGACACTTCCACATGGACTATGGAACTGGG；

口蹄疫病毒O型探针SEQ ID NO.4为：

5'-NH₂-T₁₅-CCGGGACGTACTGTCCTCGGCCCCTCTTGGCTGTTCA；

点样位置质控探针SEQ ID NO.5为：

5'-NH₂-T₁₅-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-TAMRA；

杂交阳性质控探针SEQ ID NO.6为：

5'-NH₂-T₁₅-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATT。

实施例2，参见图1，用于检测口蹄疫病毒及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型和口蹄疫病毒O型的基因芯片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成7行×8列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为：点样位置质控分区P1：1行×8点，杂交阳性质控分区P2：1行×4点，口蹄疫病毒A型检测探针分区1：1行×4点，口蹄疫病毒亚洲型检测探针分区2：1行×4点，口蹄疫病毒通用型检测探针分区3：1行×4点，口蹄疫病毒O型检测探针区分4：1行×4点，水疱性口炎病毒检测探针分区5：1行×4点，猪水疱病病毒检测探针分区6：1行×4点，蓝舌病病毒检测探针分区7：1行×4点，小反刍兽疫病毒检测探针分区8：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×4点，点样位置质控分区P1：1行×6点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。还可以将微阵列的待测样品探针区设置为含有口蹄疫病毒A型探针，口蹄疫病毒亚洲I型探针，口蹄疫病毒通用型探针，口蹄疫病毒O型探针，或任意组合的方式。

杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为博奥生有限公司生产的市售产品。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。

图2～4为采用本发明的基因芯片的检测方法进行检测的结果，说明其具有很好的特异性。

实施例3、试剂准备

1)芯片洗液

根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ。

洗液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2％。如500mL洗液Ⅰ＝440mL蒸馏水+50mL20×SSC+10mL 10％SDS，或根据需要按比例配制。

洗液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。如500mL洗液Ⅱ＝495mL蒸馏水+5mL 20×SSC，或根据需要按比例配制。

若10％SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液。

2)无水乙醇。

3)冰水混合物。

实施例4、病毒基因组RNA提取

按照相应商品化RNA提取试剂盒使用说明书,提取待测组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA，进行反转录制备样品的cDNA，作为待测样品DNA。

实施例5、PCR扩增病毒基因组cDNA

1、PCR反应体系：在PCR配液区内，在冰上融化引物Mix及基因组cDNA，按如下体系配制反应液。25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix6.6μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水2.9μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.7 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.8 0.2μL，

20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.9 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.10 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫通用型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫通用型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.14 0.2μL,

20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.15 4μL，

20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.16 1μL。

口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.7：

5′-AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC-3′；

口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.8：

5′-GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT-3′；

口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.9：

5′-AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC-3′；

口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.10：

5′-GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC-3′；

口蹄疫通用型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11：

5′-AGGTGACACTATAGAATAGACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC-3′

口蹄疫通用型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12：

5′-GTACGACTCACTATAGGGACAACGCAGGTAAAGTATCTG-3′

口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13：

5′-AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGCTTTACCGCAT-3′；

口蹄疫O型病毒特异下游引物SEQ ID NO.14：

5′-GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCATCTG-3′；

PCR通用上游引物SEQ ID NO.15：5′-cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3′，

PCR通用下游引物SEQ ID NO.16：5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′

2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行PCR反应。

表1PCR反应程序

PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。

实施例6、判读

1、洗片：杂交缓冲液在42℃融化，按下面体系配制杂交液，杂交体系混合液95℃变性8分钟，冰浴5分钟，备用。配制15μL杂交液：杂交缓冲液7.8μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.2μL。

打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约200μL灭菌水。将芯片正面朝上(围栏面朝上，标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入50℃恒温水浴中，静置，杂交3小时。

杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液Ⅰ中，42℃震荡清洗5分钟，再用42℃预热好的洗液Ⅱ，42℃震荡清洗5分钟，最后用42℃预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片2000rpm离心2分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。

2、扫描及结果判读

洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯LuxScanTM10K-A微阵列芯片扫描仪下进行扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

实施例7、弃物处理

按照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

Claims (5)

1.用于检测口蹄疫病毒的基因芯片，包括：检测芯片、芯片盖片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列，其特征是：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区(P1)，包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.5；

杂交阳性质控分区(P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.6；

杂交阴性质控分区(N)，包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区内包括下述至少一个待测样品探针的分区：

口蹄疫病毒A型探针分区(1)，

口蹄疫病毒亚洲I型探针分区(2)，

口蹄疫病毒通用型探针分区(3)，

口蹄疫病毒O型探针分区(4)，

各个探针DNA序列如下：

口蹄疫病毒A型探针：SEQ ID NO.1；

口蹄疫病毒亚洲I型探针：SEQ ID NO.2；

口蹄疫病毒通用型探针：SEQ ID NO.3

口蹄疫病毒O型探针：SEQ ID NO.4。

2.根据权利要求1所述用于检测口蹄疫病毒的基因芯片，其特征是：每张所述检测芯片上包括至少一个微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。

3.根据权利要求1所述用于用于检测口蹄疫病毒的基因芯片，其特征是：所述每条质控探针和待测样品探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。

4.利用权利要求1所述基因芯片检测口蹄疫病毒以及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型、口蹄疫病毒O型的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：

(1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备用于检测的cDNA，用作待测样品DNA；

(2)PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 6.6μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水2.9μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.7 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.8 0.2μL，

20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.9 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.10 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫通用型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫通用型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13 0.2μL,

20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.14 0.2μL,

20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.15 4μL，

20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.16 1μL；

按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃10min；

(3)杂交:首先配制杂交液：杂交缓冲液7.8μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.2μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间，放上芯片盖片，再用移液器缓慢注入15μL变性后的杂交液，杂交3小时；

(4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征是：所述杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC500μL、10％SDS 10μL及无核酸酶灭菌水490μL。