CN101586170B - 一种检测乙型肝炎病毒基因型的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒基因型的方法及试剂盒，该方法包括以下步骤：(1)从血清或血浆中提取HBV DNA基因组；(2)根据乙型肝炎病毒基因组保守区设计分型引物和探针；(3)使用小分子标记寡核苷酸引物进行PCR反应扩增靶DNA片段；(4)寡核苷酸探针加多聚dC尾链，点在基质上紫外交联后120℃烘烤固定；(5)使用被标记的靶DNA扩增产物与特异性寡核苷酸探针在基质上杂交；(6)检测杂交结合物，判断HBV的不同基因型。本发明设计了不同碱基位置处具有高度保守性的型特异性探针和PCR扩增引物，提高了检测灵敏度，能快速、简便、准确进行HBV基因分型。本发明还提供了HBV基因分型的试剂盒，该试剂盒在临床上用于检测乙型肝炎病毒基因型，能为临床治疗和合理用药提供可靠依据，值得推广使用。

Description

一种检测乙型肝炎病毒基因型的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测乙型肝炎病毒基因的方法，特别涉及一种使用DNA反向线状杂交技术检测临床血液样品中乙型肝炎病毒基因型的方法及其试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界范围广泛流行，全球仅慢性HBV携带者就有近四亿人，其中我国慢性HBV携带者超过1亿，HBV感染是危害人民健康和造成国民经济损失最严重的疾病之一。HBV是一双链DNA病毒，由正负两条链组成。根据HBV核苷酸全序列异质性≥8％或S基因序列核苷酸差异度≥4.1％，将乙肝病毒株分为A-H8种基因型。大量研究表明，不同HBV基因型对肝脏疾病的严重性、预后以及抗病毒治疗的疗效有着密切的关系。

目前检测HBV基因型的方法包括：全基因序列分析法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)法、单克隆抗体酶联免疫测定法和基因芯片法。HBV全基因测序法是基因分型的金标准，也是基因分型的依据，但测序法不能检测多种亚型的混合感染，并且技术复杂，费时费力，不适合流行病学调查和临床的大规模推广使用。PCR-RFLP法可区分A～F6种基因型，酶切图谱简明直观，但目前建立的PCR RFLP分型方法都不能鉴定100％的标本，而且此种分型法所需时间长，步骤多，且遇到混合感染或酶切不完全，就会出现复杂带型，影响分型结果的判断。单克隆抗体酶联免疫测定法为一种针对前S2区基因型特异性表位的单克隆抗体，以ELISA进行基因分型的方法，该方法简单，适用于大规模的流行病学调查，但要筛选一套单克隆抗体相对较为困难，且对不同基因型混合感染或基因型特异性表位点突变的毒株则不能分型。基因芯片法是近几年发展起来的新技术，也能用于乙型肝炎病毒基因分型，但费用较高，检测时需要昂贵的芯片扫描仪。中国专利200710026605.8提供了一种利用反向斑点杂交技术用于检测乙型肝炎病毒基因型的方法，但该方法有些基因型只设计一条探针，由于HBV具有高突变率的特点，一条探针对发生突变的基因型会有一部分的漏检，从而影响了检测的准确性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测灵敏度高、快速、简便、经济、准确的HBV基因分型方法。还提供了用于检测HBV基因分型的试剂盒，以及该试剂盒在临床检测HBV基因分型中的应用。

实现本发明采用的技术方案如下：

一种检测乙型肝炎病毒基因型的方法，包括以下步骤：(1)从血清或血浆中提取HBV DNA基因组；(2)根据乙型肝炎病毒基因组保守区设计分型引物和探针；(3)使用小分子标记寡核苷酸引物进行PCR反应扩增靶DNA片段；(4)寡核苷酸探针加多聚dC尾链，点在基质上紫外交联后120℃烘烤固定；(5)使用被标记的靶DNA扩增产物与特异性寡核苷酸探针在基质上杂交；(6)检测杂交结合物，判断HBV的不同基因型；其中所述步骤(2)设计的引物是：

上游引物：SEQ ID NO：1，在其5’端用地高辛标记；

下游引物1：SEQ ID NO：2

下游引物2：SEQ ID NO：3

步骤(2)设计的探针是：

通用探针1条：SEQ ID NO：4

B1：SEQ ID NO：5

B2：SEQ ID NO：6

B3：SEQ ID NO：7

C1：SEQ ID NO：8

C2：SEQ ID NO：9

C3：SEQ ID NO：10

D1：SEQ ID NO：11

D2：SEQ ID NO：12

D3：SEQ ID NO：13

其中步骤(3)所述小分子可以选自生物素、地高辛，最好是地高辛。

其中所述步骤(3)采用巢式PCR，外扩增没有阳性条带的，再进行内扩增，PCR扩增的退火温度是外扩增56℃、内扩增46℃、使用的引物浓度是20pmol/μl、Mg²⁺浓度是2mmol/L，在此优化条件下，能有效提高核酸扩增的特异性和灵敏度。

其中步骤(4)寡核苷酸探针加尾是用末端转移酶在其5’端加多聚dC尾链。

其中步骤(5)杂交的各种技术参数最好是：杂交温度为38℃，杂交时间1小时，地高辛抗体稀释倍数为1∶10000，各探针的浓度为10pmol/μl(是指点到膜上的探针的浓度)。

其中步骤(4)所述基质选自带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维素膜等，最好是带正电荷的尼龙膜。

本发明利用上述方法，提供了一种检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括：(1)聚合酶链反应所用的引物：聚合酶链反应中用的上游引物是SEQ ID NO：1，下游引物是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。(2)杂交反应试剂：包括：杂交液(氯化四乙胺TEACL和0.5％SDS)、洗脱液1(2xSSC、0.1％SDS)、洗脱液2(0.5xSSC、0.1％SDS)洗脱液3(washing buffer马来酸和氯化钠)、封闭液(0.2％脱脂奶粉和0.1％SDS)、地高辛抗体(偶联碱性磷酸酶AP：购自Roche)、显色缓冲液(detection buffer，0.1MTris、0.1M NaCl，pH9.5)、显色液(NBT/BCIP stock solution：购自Roche)，杂交用膜条和标准对照品。(3)用于杂交反应的载体尼龙膜条，模条上点有SEQ ID NO 4～13所述的探针。

本发明所述乙型肝炎病毒基因型的试剂盒在临床上用于检测乙型肝炎病毒基因型，能为临床治疗和合理用药提供可靠的依据。

本发明HBV基因分型检测采用反向线性杂交技术，其原理是将寡核苷酸探针分别点到基质上，根据基因型对每个探针进行编号，同时对待测的DNA样本通过生物素标记的引物进行特异性扩增，将PCR产物与膜上的探针进行杂交，经洗涤去除未结合的DNA样本，最后与偶联有碱性磷酸酶的地高辛抗体作用，酶底物显色反应检测判断出相应的基因型。用该方法可检测混合基因型感染。

本发明通过对已报道的近千条HBV全长序列进行了基因型分类，对各型全长序列进行了型内保守性分析(95％以上为保守序列，小于95％为简并序列)，根据各型型内序列分析结果，对所有型序列进行型间比较分析，根据型间分析结果，探针选择在型内保守，而型间特异的位置，所有探针和引物选取的区段被包括在Pre-S1，Pre-S2和S区。引物选择在所有型都保守的区域，设计出一条上游引物和2条下游引物。探针选择在型内保守，型间特异的位置，设计出1条通用探针，3条B型探针，3条C型探针，3条D型探针；每型3条探针的设计，只有基因型特异的二条及以上探针同时显色，才能判断为某种基因型，避免了漏检及非特异的产生。我国大陆地区流行的HBV基因型有A、B、C、D四种，所占比例分别为1.2％、39.3％、50.2％、8.1％，由于A型较为少见，本发明只针对B、C、D三型，每型分别设计了三条探针，序列如前所述，膜条上探针排列如图1所示：由上自下第一条是显色反应控制线(带标记的PCR产物，指示显色过程)；第二条是通用探针1条，接下来是B、C、D型分别各三条探针。

结果判读

(1)、显色反应控制线这条线作为显色对照，指示显色过程的有效性，在同一个检测中，应该总是阳性的。

(2)、通用探针线杂交反应中对扩增产物的附加控制。如果乙型肝炎病毒存在于标本中，标本处理正确并得到了扩增产物，那么目标扩增物将与这条“通用探针线”杂交显色。

(3)、由图1所示可以看出，如果显色反应控制线、通用探针线和B型的二条及以上探针同时显色，判定为HBV基因型B；如果显色反应控制线、通用探针线和C型的二条及以上探针同时显色，判定为HBV基因型C；如果显色反应控制线、通用探针线和D型的二条及以上探针同时显色，判定为HBV基因型D。

如果检测结果出现不同的基因型探针线显色，那么应报告为一个混合基因型。如B型的二条及以上探针与C型的二条及以上探针同时显色，就报告为一个B/C混合感染标本。

如果一个基因型的二条及以上探针，与另一个基因型的一条探针线同时出现阳性结果，这种情况应报告为一个单独的基因型。基因型的报告应该依据至少两条基因型特有探针的同时阳性。

为了证实本发明的检测准确性，做了下述临床分析，方法及结果如下：使用本发明的方法和试剂盒，对30份来自慢性乙型肝炎患者的DNA样品进行HBV基因分型检测，其中29例样本得以正确的分型，B型21例(占72.41％)，C型6例(占20.68％)，D型2例(占6.89％)，没有检测到混合感染。为了进一步证实本发明方法的准确性，对30例样本进行测序分析，测序结果与我们的方法检测结果基本一致，特异性达96.67％。同时对样本进行定量拷贝数分析，其中有7例为10³拷贝/ml，均能准确分型，说明检测灵敏度可以达到10³拷贝/ml。

本发明的有益效果是：

(1)设计了不同碱基位置处具有高度保守性的型特异性探针，每型设计三条。由于乙型肝炎病毒具有高突变率，通过NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)查找的HBV序列并进行比对，我们每型选择三条探针，与一条探针相比，可以避免因异质性带来的漏检，也可以提高检测的准确性，因为只有两条或以上的探针同时显色，才能判断为某种基因型。

(2)通过在寡核苷酸探针两端加多聚dC尾链的方式，结合紫外交联和高温烘烤，提高了探针与膜的结合效率；

(3)用地高辛标记引物，其检测灵敏度可达到同位素的水平，具有灵敏、安全、简便、实用等优点，与生物素标记相比，它还具有背景低的优点。此外，采用多重地高辛标记引物的方式，可提高信号强度，增强了检测灵敏度。

(4)采用的是线性反向杂交，相比于斑点杂交而言，结果更直观，显色更均一，较为简便、经济，更为标准化。

附图说明

图1膜条探针的排列示意图

图2靶DNA外扩增片段经1％的琼脂糖凝胶电泳图

图3靶DNA内扩增片段经1％的琼脂糖凝胶电泳图

图4B、C、D三型的显色结果示意图

具体实施例

实施例1从血清中提取HBV基因组DNA

取200ul病毒血清+200ul 2x裂解缓冲液(0.02mol/L的TrisHCl，0.01mol/L的EDTA，1％SDS)+10ul蛋白酶K(20mg/ml)，置40℃消化1.5小时.用酚和酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，混匀后，12000gx3min，回收水相，即上层。加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠和2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，12000gx10分钟，回收DNA，再用75％乙醇洗涤DNA一次，弃上清，干燥后，加入20μl纯水溶解DNA，取5μl作为PCR反应模板，余下的于-20℃保存。

实施例2PCR反应扩增靶DNA片段

外扩增50μlPCR体系如下：

10×Taq扩增缓冲液(TaKaRa)        5μl

MgCl₂(25mM)                      4μl

dNTP Mixture(各2.5mM)            4μl

上游引物(20um)                   1μl

下游引物1(20um)                  1μl

Taq DNA聚合酶5U/μl(TaKaRa)      0.25μl

高压灭菌蒸馏水                   29.75μl

模板        5μl纯化的HBV DNA，或5μl的蒸馏水(阴性对照)

将各反应管放入已校准设定后的PCR仪中。开始执行如下外扩增程序：94℃预变性4分钟，然后按94℃30秒，56℃40秒，72℃50秒扩增40个循环，最后72℃延伸10分钟。

完成上述程序后，应立即使用样本进行电泳，没有阳性条带的进行内扩增，余下放-20℃保存或立即进行反向杂交。

内扩增

50μlPCR体系如下：

10×Taq扩增缓冲液(TaKaRa)            5μl

MgCl₂(25mM)                          4μl

dNTP Mixture(各2.5mM)                4μl

上游引物(20um)                       1μl

下游引物2(20um)                      1μl

Taq DNA聚合酶5U/μl(TaKaRa)          0.25μl

高压灭菌蒸馏水                       33.75μl

模板            1μl外扩增产物，或1μl的蒸馏水(阴性对照)

将反应管放入已校准设定后的PCR仪中，进行如下的内扩增程序：94℃预变性4分钟，然后按94℃30秒，46℃40秒，72℃50秒扩增35个循环，最后72℃延伸10分钟.

扩增结果：取2.5μl的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，外扩增结果应显示出一条600bp左右的条带(见图2)，图2所示靶DNA外扩增片段经1％的琼脂糖凝胶电泳图，M泳道为标准分子量Marker.；其中第1-5泳道为特异性靶DNA外扩增片段，1、3、5泳道有特异性靶DNA外扩增片段，2、4泳道外扩增没有或有一很弱的阳性条带，须进行内扩增。

内扩增结果应显示出一条400bp左右的条带(见图3)，图3所示靶DNA内扩增片段经1％的琼脂糖凝胶电泳图，其中第1、2泳道为特异性靶DNA内扩增片段，M泳道为标准分子量Marker.。

实施例3杂交载体尼龙膜条的制备

将人工合成的每条探针稀释成终浓度为10pmol/μl，固定在膜条的适当位置，膜条的制备如下：

(1)将带DIG标记的PCR产物和10条探针每次两个样品分别加入自动喷膜机的1号泵、2号泵，喷完后，将两条管道用蒸馏水清洗干净，再换另两条探针喷膜。

(2)设定工作参数：喷液量2μl/cm、导轨速度6.0cm/s、喷嘴间隔5mm。

(3)固定探针：喷完后，待膜室温自然干燥后，紫外交联，然后再120℃烘烤30min。

(4)裁切：固定好后，沿标记线用切条机将膜裁成3mmX7cm的膜条。

(5)预杂交：加2ml预热的预杂交液(含6XSSC、0.5％SDS和鲑精DNA)于杂交槽，将制作好的尼龙膜条放入杂交槽里(浸泡)，再置于42℃恒温摇床培养箱(71rpm/min)，孵育30min。

膜条可立即用于杂交，也可以在蒸馏水中漂洗，晾干后室温保存。

实施例4三个已知基因型样品线性反向杂交检测

检测由4个主要步骤组成：标本变性，杂交，冲洗条带及显色。

(1)标本变性：将待检样本PCR产物10μl(每杂交槽)100℃煮沸变性5min，然后迅速置冰上冷却5分钟。同时为每个膜条准备2ml杂交液，在水浴箱中预热至37℃；

(2)标本杂交：加入2毫升杂交液到每个杂交槽，再加入10微升变性标本到每个杂交槽中，轻摇混匀，在杂交槽内放入探针面向上的检测条带，将杂交槽放在38℃的恒温振荡器中，让恒温振荡器每分钟转数约为71，盖上盖子，杂交孵育60分钟。

(3)冲洗条带：倒掉杂交槽里的杂交液，加入2毫升洗脱液1到每个杂交槽中，并在室温下轻摇杂交槽30至60秒钟冲洗检测条带，重复一次；加入2毫升洗脱液2到每个杂交槽中，将杂交槽放在温度为38℃的恒温振荡器中，让恒温振荡器每分钟转数约为71，盖好盖子并孵育15分钟。

(4)显色：加入2毫升洗脱液3到每个杂交槽中，并在室温下轻摇，浸泡检测条带2-5分钟；抗体结合液(地高辛抗体0.2μl+封闭液2毫升)，每个杂交槽加2毫升抗体结合液，放在恒温振荡器中让恒温振荡器每分钟转数约为71，室温25℃孵育30分钟。加入2毫升洗脱液3到每个杂交槽中，并在室温下轻摇，清洗检测条带1分钟。吸出杂交槽内的液体。重复此步骤一次，第二次洗5分钟。显色工作液配置：每毫升显色缓冲液加20μl NBT/BCIP Stock Solution，每个杂交槽加2毫升显色液，避光显色30min。显色完成后，吸出每个杂交槽中的液体，然后加入2毫升蒸馏水到每个反应槽中，终止显色，用镊子从杂交槽中夹出检测条带，并将其放在吸水纸上，标记面向上，等条带完全干燥后阅读结果(结果见附图4)。

由图4的结果可看出，发生特异性杂交的各种探针的显色情况均清晰可见，可根据前面的结果判读所述可判读出单一或混合感染。

序列表

<160>13

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作PCR扩增的引物

<400>1

5’-GGGTCACCAT ATTCTTGGG-3’19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作PCR扩增的引物

<400>2

5’-AGTCCACCAC GAGTCTAGA-3’19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作PCR扩增的引物

<400>3

5’-AACTGGAGCC ACCAGCAG-3’18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>兼并碱基R可以是A或G，根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>4

5’-TTGARGTCCC AATCTGGATT-3’20

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>兼并碱基Y可以是C或T，根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>5

5’-AGTTGGCTTT  GAAYGCAGG-3’19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>6

5’-TCCGGCCAGT TGTCCTTGT-3’19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>7

5’-TGCTCCCACT  CCCACCTTG-3’19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>8

5’-TCTAGCAGAG  CTTGGTGGA-3’19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>9

5’-GATCCTTGTT  GGGGTTGAA-3’19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>10

5’-ATCCCAGAGGATTGGGAAC-3’19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>11

5’-GTGTTTGCTC TGAAGGCTG-3’19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>12

5’-CAGGTGTCCT TGTTGGGAT-3’19

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>兼并碱基Y可以是C或T，根据HBV基因组特定序列设计，用作杂交探针

<400>13

5’-YTCTCAAAGG TGGAGACAG-3’19

Claims (1)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，其特征是含有根据乙型肝炎病毒基因组保守区设计的分型引物和探针：

上游引物：SEQ ID NO：1，在其5’端用小分子标记

下游引物1：SEQ ID NO：2

下游引物2：SEQ ID NO：3

所设计的探针是：

通用探针1条：SEQ ID NO：4

B1：SEQ ID NO：5

B2：SEQ ID NO：6

B3：SEQ ID NO：7

C1：SEQ ID NO：8

C2：SEQ ID NO：9

C3：SEQ ID NO：10

D1：SEQ ID NO：11

D2：SEQ ID NO：12

D3：SEQ ID NO：13。

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