CN101177715B - 检测乙型肝炎病毒前c/bcp区基因突变的方法和试剂盒 - Google Patents
检测乙型肝炎病毒前c/bcp区基因突变的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测临床血液样品中乙肝病毒(HBV)基因组前C区及核心启动子区域(BCP)突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测HBV基因前C/BCP区突变的方法及所使用的试剂盒。
Description
所属领域
本发明涉及检测临床血液样品中乙肝病毒(HBV)基因组前C区及核心启动子区域(BCP)突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测HBV基因前C/BCP区突变的方法及所使用的试剂盒。
发明背景
乙型肝炎病毒(HBV)是严重危害人类健康的世界性传染疾病，全世界上大约有20亿人感染过HBV，其中慢性HBV感染患者至少有3.8亿。慢性乙型肝炎病毒感染的自然病程漫长，持续慢性感染可导致急、慢性肝炎、肝硬化甚至原发性肝癌(Funk M，Rosenberg D，LokA.Worldwide epidemiology of HBeAg-negative chronic hepatitis B and associated precore and core promotervariants.J Viral Hepatitis，2002，9：52-61.)。
乙型肝炎病毒基因组由两条长度不一的单链形成部分环状结构，长链L(3.2kb)为负链，而短链S为正链。正链长度约为负链的50％-80％左右，其3’末端随不同来源毒株而有所不同，而且不同亚型的DNA变异约为10％，相同亚型间DNA变异率约为2％，最高可达11.5％。HBV基因组的多态性构成了该病毒高度变异率的分子基础。传统观念认为，若患者血清HbeAg阴性，则表示病毒复制停止，病情趋于稳定。然而，近年来的研究显示，大多数的患者常常由于HBV前C区及BCP区变异而导致血清HBeAg水平下降或缺失，但不影响病毒复制，即此时有时HbeAg阴性并不一定反映病毒复制减少或停止。因此，乙型肝炎病毒前C/BCP区基因突变检测对慢性乙型肝炎的早期辅助诊断及治疗有着重要意义。有研究表明，HBV前C区A1896突变在抗乙肝e抗原阳性HBe(+)的慢性乙型肝炎中的检出率达91％，BCP区nt1762A-T，1764G-A联合突变在抗HBe(+)慢性乙型肝炎中检出率为13％。可见，HBV前C区及BCP区变异的检测可为对深入研究慢性乙型肝炎血清学标志物与病毒突变之间的相互关系、揭示病程进展以及治疗和预后提供科学有效的依据。
目前常用的基因突变检测方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、基因芯片以及DNA序列测定等技术。PCR-SSCP技术用来检测基因突变操作繁琐、检测通量低，而且不能判断特异性位点的突变形式。而RFLP是使用核酸内切酶对扩增后的靶序列进行特异性位点的切割，然后经过电泳检测判断不同的基因型，但是由于HBV基因组分子进化速率较快、变异频繁，因此结果分析准确率较低。近年来，基因芯片技术已经成功应用于核酸分析，对检测HBV基因组多态性具有很大的优势，但因其检测费用昂贵而限制了该技术在临床实验室的推广和应用。因此，本发明人试图结合已知的PCR-斑点印迹杂交技术和过滤杂交方法，建立一种能够在较短的时间内检测和分析HBV基因组前C区和核心启动子区域基因突变的方法。
发明内容
本发明涉及检测个体血液样品中HBV前C区及BCP区突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测HBV基因前C区及BCP区突变的方法及所使用的试剂盒。
本发明的一个目的提供一种使用反向斑点杂交技术HBV基因前C区及BCP区突变的方法，该方法包括：(1)分离提取待检样品中的靶DNA分子；(2)利用小分子标记引物并进行聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(3)使特异性寡核甘酸探针与靶核酸在适当的基质上杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的突变类型。本发明的特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)
探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)
探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)
探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)
探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)
探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)
探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)
探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)
探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：11)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶DNA样品是得自被检者血液中HBV基因组DNA样品。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，恒温水浴、空气浴装置完成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的小分子标记物选自生物素。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质选自尼龙膜、硝酸纤维素膜。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA突变类型包括HBV基因组前C区/BCP区的不同类型的点突变，分别是核心启动子区核甘酸nt1762A/nt1764G--nt1762T/nt1764A双突变，以及前C区nt1896G/nt1896A、nt1899G/nt1899A突变。
本发明的另一个目的是提供用于检测乙肝病毒前C区及BCP区突变的试剂盒，该试剂盒包括：(1)DNA抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂，特征在于聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)
探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)
探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)
探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)
探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)
探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)
探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)
探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)
探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：11)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA抽提试剂是用3％～8％的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂由含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂由杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV(3％的过氧化氢溶液)、杂交用膜条以及标准对照品组成。
众所周知，通常使用的点印迹杂交方法是将靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，使标记的探针与待检靶DNA接触并杂交，显色后判断结果。但这种方法每次杂交反应只能用于判断一种突变型，如果某些基因座位有多个等位基因(如HLA-DRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法检测就很繁杂，甚至很难完成。而反向斑点杂交方法则是先将针对各等位基因特异性的探针点到硝酸纤维素膜或载玻片上，然后再将待测DNA样品(一般是使用5’-端标记有生物素等分子的引物PCR扩增目的片段后的产物)与之杂交，这样待测样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤除去未结合的DNA后，即可直接或间接地显示出并检测到代表杂交信号的生物素等标记物。因此，使用该方法可一次同时检测某一基因座位的大部分或全部等位基因。
简单地说，为了完成本发明的方法，首先常规制备待检者血液中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA。经DNA提取液处理后离心收集上清液，并将该上清液用于PCR扩增反应。以如上得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA为模板，并使用合成的正向和反向寡核苷酸引物进行PCR扩增。变性处理所得到的DNA扩增产物后，使之分别与足以揭示不同的乙型肝炎病毒(HBV)前C/BCP区基因突变的寡核苷酸探针杂交。最后，根据杂交产物染色后的颜色变化判断乙型肝炎病毒(HBV)前C/BCP区基因突变位点。现针对本发明方法的几个主要步骤，分别详细描述如下。
1、引物的设计和合成
为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的乙型肝炎病毒(HBV)基因，我们从Gene Bank中调出乙型肝炎病毒(HBV)基因DNA序列，针对包含编码乙型肝炎病毒(HBV)基因第1762位、1764位、1896位和1899位核甘酸的多态性位点序列，按照引物设计的一般性原则，并采用PrimerExpress2.0、primer premier5.0等软件分别设计并合成正向和反向引物：5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQID NO：2)，反向引物的5’端标记生物素。通过美国NIH网站上Blast程序进行同源性比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)，以确保引物设计的特异性。
2、探针的合成和标记
针对影响HBV e抗原表达的基因第1762、1764和1896、1899位核甘酸相对应的多态性位点，采用计算机辅助软件设计并合成8条探针分别命名为探针1，探针2，探针4、探针5、探针7和探针8。探针序列的长度在10～50个核甘酸左右，并覆盖HBV基因组nt1762、nt1764和nt1896、nt1899位核甘酸相对应的多态性位点，经过优选设计结合实验验证，将探针的长度调整在15～25个核甘酸左右。此外，设计三条探针分别为探针3、6、9，探针3为阴性对照探针，用以控制杂交显色的背景；探针6为阳性对照探针，为HBV基因组一段保守序列，用以检测HBV DNA；探针9为显色控制探针，借以作为控制显色反应的对照。为了保证各探针均能在同一温度下与特定的靶DNA成功地杂交，须将探针的Tm值和GC含量严格控制在特定范围内。合成的探针经20％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化后，分别进行NH2基团在探针的5’端标记以用于继后的杂交反应；其中显色探针9的5’端标记生物素基团，3’端标记氨基基团。各种探针的序列如下：
探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)
探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)
探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)
探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)
探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)
探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)
探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)
探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)
探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：11)。
3、杂交载体的制备
用作杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料制成的，大小约为2.5cm×2.5cm的多孔条。膜条使用前需用10％的EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺，Sigama公司)溶液充分浸泡活化处理。新合成的探针(100pm/μl)经稀释成10pm/μl后，按每孔1μl的体积在膜条的适当位置上以固定格式点加。点样后用NaOH溶液处理膜条并用蒸馏水充分洗涤，然后保存于—20℃备用。
4、核酸的提取
采用常规DNA提取液提取人个体血液样品中的乙型肝炎病毒DNA。例如，用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60分钟或离心后析出血清。吸取上层血清100μl，转移至1.5ml灭菌离心管，并加入等量的浓缩液(3％～10％的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠)充分混匀，12000rpm离心10分钟后，收集管底沉淀。向沉淀中加入50μl的DNA提取液，充分混匀，沸水浴10分钟并以12000rpm离心10分钟，取2μl上清液作为PCR反应模板。
5、核酸扩增体系的优化
在PCR扩增中，首先摸索最佳退火温度，借以提高核酸扩增的特异性和高效性。同时，使用dUTP-UNG酶处理待检核酸，以有效地消除PCR产物的污染。特别是，我们对PCR扩增中使用的引物和其浓度、以及Mg2+、模板等其他反应物的浓度均作了适当的调整和最佳化。6、反向斑点杂交体系的优化
反向斑点杂交的操作过程包括：首先将如前制备的HBV前C/BCP区基因突变膜条固定在杂交仪上，然后在膜条的适当加样点加载经变性处理的扩增的样品DNA。杂交反应完成后，经洗膜和显色步骤以显示杂交斑点的存在，并根据所显色的探针类型来判断各个体的突变类型。
由图3所示的检测实例可以看出，如果探针1(SEQ ID NO：3)、探针4(SEQ ID NO：6)、探针6(SEQ ID NO：8)和显色反应控制探针9(SEQ ID NO：11)显色，可判定HBV基因型为nt1762A/nt1764G，nt1896G/nt1899G；如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针8(SEQ ID NO：10)、探针6(SEQ ID NO：8)和显色反应控制探针9(SEQ ID NOＰ：11)显色，可判定HBV基因型为nt1762T/nt1764A，nt1896A/nt1899A；如果探针1(SEQ ID NO：3)、探针7(SEQ ID NO：9)、探针6(SEQ ID NO：8)和显色反应控制探针9(SEQ ID NO：11)显色，可判定HBV基因型为nt1762A/nt1764G，nt1896A/nt1899G；如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针5(SEQ ID NO：7)、探针6(SEQ ID NO：8)和显色反应控制探针9(SEQ ID NO：11)显色，可判定HBV基因型为nt1762T/nt1764A，nt1896G/nt1899A；如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针4(SEQ ID NO：6)、探针6(SEQ ID NO：8)和显色反应控制探针9(SEQ ID NO：11)显色，可判定HBV基因型为nt1762T/nt1764A，nt1896G/nt1899G；如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针7(SEQ ID NO：9)、探针6(SEQ ID NO：8)和显色反应控制探针9(SEQ ID NO：11)显色，可判定HBV基因型为nt1762T/nt1764A，nt1896A/nt1899G；如果有显色反应控制探针6(SEQ ID NO：8)显色，说明检测的病原体为HBV；如果只有显色反应控制探针9(SEQ ID NO：11)显色，其它探针不显色则说明PCR扩增失败；探针3(SEQ ID NO：5)为阴性对照探针，用以控制显色的背景；如果有探针1、2、4、5、7、8中的一种或几种同时显色，则判断为混合感染。(参见图3)。在显色反应中，所标记生物素和偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素特异性结合，使底物四甲基链苯胺生成蓝紫色的沉淀，通过计算机图像分析软件或肉眼判读结果；在本发明杂交显色过程中若使用链酶亲和素偶联碱性磷酸酶同样可以和生物素结合，并使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐(BCIP)生成深蓝色沉淀而完成本发明中的显色过程。
另外，本发明通过摸索不同的杂交温度和探针浓度(例如，将杂交温度设定在42℃，探针浓度定为5pmol/L)，可使检测的结果更为准确可靠，并具有更好的检测稳定性(可重复性)。
本发明中，由于发明人对靶DNA片段的扩增体系和杂交体系进行了优化，设计并合成了特异性强的探针和引物，同时检测中使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，从而保证了方法的快捷和检测结果的可靠性。
如前所述，由于反向斑点杂交方法能够同时检测目的基因内多个碱基的突变或多态性，所以在病原体及复杂遗传性疾病的检测中有着更为简便的优越性。在乙肝的诊疗中，一些慢性乙型肝炎患者，尤其是某些HbeAg阴性、HbeAb阳性病人，其前C区和BCP区的突变与HbeAg的血清学转换密切相关，因此HBV前C/BCP区突变检测成为临床医务工作者研究的热点。本发明的HBV基因前C/BCP区突变检测方法显然可以为乙型肝炎的诊断提供一种快速、简便、特异性和准确性均较高的实验室检验手段。
本发明的另一个目的是提供用于检测乙型肝炎病毒(HBV)前C/BCP区突变基因的试剂盒，该试剂盒包括：(1)DNA抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂；和(3)杂交反应试剂，特征在于所说的聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)
探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)
探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)
探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)
探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)
探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)
探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)
探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)
探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：11)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂包括由3％～10％聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成的提取待检样品DNA的抽提液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂是由dNTPs(含dUTP)、耐热Taq酶、UDG酶等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV(3％的过氧化氢溶液)、杂交用膜条以及标准对照品。
如前所说，为简单快速地检测个体血液样品中乙型肝炎病毒(HBV)前C/BCP区基因突变，本发明提供了相应的乙型肝炎病毒(HBV)前C/BCP区基因突变反向斑点杂交检测试剂盒。具体地说，本发明的试剂盒提供：(1)包括由聚乙二醇和氯化钠组成的浓缩液(2ml/管)和DNA提取液(500μl/管)的血液样品HBV DNA抽提试剂；(2)包括PCR反应混合液(共10管，每管含PCR反应缓冲液、Mgcl2(2.5mmol/L)、dNTPs(0.2mmol/L)、正反向引物(0.2umol/L)，以及Taq酶(3u/μl，1管)、UDG酶(1U/μl，1管)的聚合酶链反应试剂，；(3)由常规的20×SSC、十二烷基磺酸钠(SDS)、链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物(POD)组成的杂交检测试剂，另外还包括用作杂交反应载体的膜条10张。
本发明的试剂盒除提供了各位点所对应的特异性探针外，还配有显色反应控制探针和标准对照品。由于本发明结合使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，其导流杂交的特性大大提高了核酸分子的扩散率、局部反应的浓度和核酸杂交效率。一般说来，使用本发明的方法和试剂盒，从样本的处理到判读基因型检测结果仅需要约6小时的时间。因此，本发明的方法和试剂盒特别适用于临床标本的快速检测和大样本的普查。
附图说明
图1显示所使用的探针在膜条上的排列图。1号探针具有SEQ ID NO：3所示的序列，2号探针具有SEQ ID NO：4所示的序列，3号阴性控制探针有SEQ ID NO：5所示的序列，4号探针具有SEQ ID NO：6所示的序列，5号探针具有SEQ ID NO：7所示的序列，6号阳性控制探针具有SEQID NO：8所示的序列，7号探针具有SEQ ID NO：9所示的序列，8号探针具有SEQ ID NO：10所示的序列，9号显色控制探针具有SEQ ID NO：11所示的序列。
图2显示靶DNA扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳图，其中第1-6泳道为特异性靶DNA片段(240bp)，M泳道为标准分子量标志。
图3显示六种不同基因型样品的反向斑点杂交检测结果。其中④号探针为阴性对照探针，用以控制反应的显色背景；⑥号探针为阳性对照探针，如果显色，则代表所检测的生物样本为HBV；⑨号探针为显色控制探针，用于控制显色反应的整个过程。①、④、⑥和⑨探针显色判定HBV基因组有nt1762A/nt1764G和nt1896G/nt1899G位点突变；②、⑧、⑥和⑨号探针显色判定HBV DNA具有nt1762T/nt1764A和nt1896A/nt1899A位点突变；①、⑦、⑥和⑨号探针显色判定HBV DNA具有nt1762A/nt1764G和nt1896A/nt1899G位点突变；②、⑤、⑥和⑨号探针显色可判定具有HBV DNAnt1762T/nt1764A和nt1896G/nt1899A位点突变；②、④、⑥和⑨号探针显色可判定HBV DNA具有nt1762T/nt1764A和nt1896G/nt1899G位点突变；②、⑦、⑥和⑨号探针显色判定HBV DNA有nt1762T/nt1764A和nt1896A/nt1899G位点突变(参见下列表1和图3)。
表1
| 样品号 | 探针显色情况 | 核苷酸位点 |
| 1 | ①、④、⑥和⑨号探针显色 | nt1762A/nt1764G，nt1896G/nt1899G |
| 2 | ②、⑧、⑥和⑨号探针显色 | nt1762T/nt1764A，nt1896A/nt1899A |
| 3 | ①、⑦、⑥和⑨号探针显色 | nt1762A/nt1764G，nt1896A/nt1899G |
| 4 | ②、⑤、⑥和⑨号探针显色 | nt1762T/nt1764A，nt1896G/nt1899A |
| 5 | ②、④、⑥和⑨号探针显色 | nt1762T/nt1764A，nt1896G/nt1899G |
| 6 | ②、⑦、⑥和⑨号探针显色 | nt1762T/nt1764A，nt1896A/nt1899G |
发明的具体实施方式
实施例1：样品靶核酸的制备
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5分钟；吸取上层100μl血清，转移至1.5ml灭菌离心管。然后向离心管内加入等体积的DNA浓缩液并混匀，12000rpm离心10分钟后，收集管底沉淀。向沉淀中加入常规的DNA提取液50μl，充分混匀，沸水浴10分钟并以12000rpm离心10分钟。取2μl上清液作为PCR反应模板。在浓缩液的配方中，我们采用了不同浓度聚乙二醇(3％～10％)和氯化钠组合，3％～10％的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠均能有效的对血清中HBV的浓缩。
实施例2：靶核酸的PCR扩增
取单管单人份PCR反应液若干管，直接加入2μl模板(或阴阳性标准品)，充分混匀，瞬时(3秒)离心后，将各反应管放入PCR仪。50℃预处理3分钟后，按下列条件扩增：93℃30秒，55℃45秒，72℃30秒，40个循环，最后72℃延伸7分钟。扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图2)。
实施例3：六种已知基因型的样品反向斑点杂交检测
杂交前，取杂交液I(2×SSC-0.15％SDS)与杂交液II混合并预热至42℃备用。根据待检样品的数目取相应个数的1.5ml离心管，各管分别加入0.5ml杂交液I并预加热至42℃。将PCR扩增产物98℃变性处理8分钟后，置于冰水混合物中放置8-10分钟。然后取1000μl杂交液I+2μl溶液I(1000：2)混合溶液作为结合液4℃保存备用，并取溶液II：溶液III：溶液IV(1900：200：1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液III+10μl溶液IV)作为显色液避光备用。
杂交前用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板，打开水泵以排出多孔板上的水份。设定杂交仪温度为42℃，首先将塑料垫片置于金属多孔板上并将乙型肝炎病毒(HBV)前C/BCP区基因突变膜条置于塑料垫片上，盖好硅胶分隔室和压扣盖。每个分隔室加入杂交液I(1ml)预杂交，再将变性后的PCR扩增产物加入到盛有42℃保温的0.7ml杂交液I的EP管中，混匀后加入杂交槽中温育10分钟，并开泵进行杂交导流。加入预热的杂交液II清洗膜条(每孔1ml，重复洗3次)。在设定的杂交仪温度(25℃或室温)下加入结合液(每孔1ml)。静置2分钟后泵出结合液，再加入室温杂交液I清洗膜条(每孔1ml，各重复洗3次)。随后加入溶液II静置2分钟后泵干，最后加入新鲜配制的显色液(每孔1ml)，显色大约7分钟后开泵抽干显色液观察结果(参见附图3)。
由图3所示的结果可以看出，发生特异性杂交的各探针的显色情况均清晰可见。可根据附图一所示的排列格式判读出这六种不同的突变位点。实施例4：不同的恒温装置进行反向斑点杂交检测。
采用恒温水浴锅和空气浴杂交炉对上述六种不同基因型的样本进行了检测，检测结果同导流杂交仪的检测结果一致，说明恒温水浴和空气浴装置同样可以用来对样品进行检测。
实施例5：不同基因型样品的反向斑点杂交基因分型检测结果判定
使用本发明的方法和试剂盒，对150份采自慢性乙型肝炎患者的DNA样品进行HBV前C/BCP区突变位点检测，其中145例样本得以正确的分型。为了进一步证实本发明方法的准确性，对所有上述145例样本进行了序列测定。结果表明，使用本发明的试剂盒检测的结果和测序结果基本吻合，特异性达95.3％。
序列表
<110>中山大学安达基因股份有限公司
<120>检测乙型肝炎病毒前C/BCP区基因突变的方法和试剂盒
<140>
<141>
<160>11
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>3
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>4
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>5
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>6
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>7
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>8
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>9
<210>10
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>10
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>11
Claims (4)
1.用于检测乙肝病毒前C区及BCP区突变的试剂盒，该试剂盒包括：(1)DNA抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂，特征在于聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是：5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)
探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)
探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)
探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)
探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)
探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)
探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)
探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)
探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：11)。
2.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的DNA抽提试剂是用3％～10％聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成。
3.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的聚合酶链反应试剂由含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成。
4.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的杂交反应试剂由杂交液Ⅰ和Ⅱ、溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ、杂交用膜条以及标准对照品组成，杂交液Ⅰ为2×SSC-0.1％SDS，杂交液Ⅱ为0.5×SSC-0.1％SDS，溶液Ⅰ为250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液，溶液Ⅱ为0.1mol/L的柠檬酸钠溶液，溶液Ⅲ为2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，溶液Ⅳ为3％的过氧化氢溶液。
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