KR20100116954A - 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｂｖ 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유전자의 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 HBV 유전자와 상보적으로 결합 가능한 프라이머 쌍, 상기 프라이머 쌍 및 HBV 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는 HBV 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 HBV 검출 키트, 및 HBV 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
HBV, 검출, 프라이머, 프로브, 경쟁적 저해, S 단백질, pre-Core, 내부 대조군, 실시간 중합효소 연쇄반응

Description

실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ＨＢＶ 검출 방법{A METHOD FOR DETECTING HBV USING REAL TIME PCR}
본 발명은 B형 간염 바이러스 유전자의 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 HBV 유전자와 상보적으로 결합 가능한 프라이머 쌍, 상기 프라이머 쌍 및 HBV 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는 HBV 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 HBV 검출 키트, 및 HBV 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (Hepatitis B Virus, 이하 HBV)는 바이러스성 간염의 주요 원인 바이러스로 잘 알려져 있는데, 전 세계적으로 HBV로 인한 간염 환자는 약 20억명 정도로 추정되고 있다. 또한 이들 중 약 3억5천만명 정도가 만성 간염환자로 파악되고, 상당수가 간경화 또는 간암으로 진행되는 것으로 알려져 있다. B형 간염바이러스의 외피유전자는 preS1과 preS2로 이루어지는 preS 및 S 부위로 구성되고, 외피유전자 전체가 전사(transcription)된 후, 3개의 다른 위치에서 번역(translation)이 일어나는 교호번역(alternate translation)에 의하여 3개의 외 피단백질(L 단백질, M 단백질 및 S 단백질)이 생산된다. L 단백질은 preS1 에서 번역이 시작되어 preS1 도메인, preS2 도메인 및 S 도메인을 모두 포함하는 약 400 아미노산으로 구성된다. M 단백질은 preS2 에서 번역이 시작되어 preS2 도메인 및 S 도메인을 포함하는 약 281개의 아미노산으로 구성된다. S 단백질은 S 도메인만을 포함하는 약 226 아미노산으로 구성되며 가장 많은 양이 생산되어 바이러스 파티클의 주 구성성분을 이룬다. 이들 외피단백질의 S 도메인 부위가 서로 결합하여 파티클을 형성하며 S 항원을 이룬다. M 단백질과 L 단백질에 포함된 preS1 및 preS2 도메인은 파티클의 바깥쪽에 위치하며, 높은 면역반응을 유도하는 preS 항원으로 작용한다.
HBV 감염의 진단법으로서는, 검체 중에 존재하는 HBV에 대한 항체를 검출하는 항체검출법, HBV의 항원을 검출하는 항원검출법, 또는 HBV의 유전자를 검출하는 방법이 있다.
HBV 항원검출법은 흔히 HBV 표면항원 (HBV Surface Antigen, HBsAg)이나 HBV e 항원 (HBeAg) 등을 진단마커로 활용하여 혈액 내 존재 유무를 판별하는 방법을 사용하고 있다. 하지만 바이러스의 라이프사이클에 따라 조기진단을 하지 못하거나 HBV 감염환자임에도 혈액내 HBsAg나 HBeAg 등이 줄어들거나 존재하지 않아 HBV 치료를 받고 있는 환자에 대한 정확한 진단을 하지 못할 가능성이 있다.
HBV 유전자의 검출방법에는, 핵산증폭법(Nucleic acid amplification technique, NPT)이나 DNA 프로브법이 있고, 현재 광범위하게 임상현장에서 이용되 고 있다. 특히, PCR 은 핵산증폭법의 한 방법으로 검출할 수 있는 수준에서 원하는 표적이 낮은 농도로 존재할 때 그것을 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로 널리 이용되고 있다. 그러나, 이 핵산을 추출하는 과정에서 핵산의 손실이 생기는 것을 피하기가 어려운 문제가 있다. 예를 들어, 시료 중에 증폭하기 위한 주형으로서 필요한 양의 표적 핵산이 포함되어 있었다고 해도, 핵산 추출과정의 손실에 의해 주형으로서 필요한 양이 회수되지 않은 경우에는 증폭 효율이 저하되기 때문에 표적 핵산을 충분히 증폭할 수 없고, 시료 중의 표적핵산을 검출할 수 없는 경우가 생길 수 있다. 이러한 경우는, 위음성이 되어 정확한 결과가 얻어지지 않는다. 또 동일한 시료를 이용한 경우라도, 핵산 추출과정의 손실 정도에 따라 다른 결과가 얻어질 가능성이 있고, 재현성이 부족하게 된다. 즉, 핵산의 추출을 필요로 하는 핵산 증폭방법에 있어서, 시료 중에 포함되는 표적의 핵산이 매우 미량인 경우에, 핵산 추출과정의 핵산의 손실에 의해 증폭효율의 저하에 따라 검출감도의 저하를 초래한다는 문제점이 있다. 또한, 증폭반응을 저해하는 물질 (예를 들면, 헤파린, 계면 활성제, 단백질 변성제, 유기 용매 등)이 시료 용액 내에 포함되어 있는 경우가 있고, 상기와 마찬가지로 증폭효율의 저하에 기인하는 검출감도의 저하를 초래한다는 문제도 있다.
뿐만 아니라 일반적인 PCR을 이용한 HBV 검출방법에 있어 그 유전자의 변형이 심하지 않은 특정 부위, 즉 S 단백질 부위 및 pre-Core 부위, 또는 외피단백질 부위 등이 활용되고 있다. 하지만 이들 부위 역시 돌연변이 등의 변형이 낮은 확률로 일어날 가능성이 있는 부위로써 유전자 염기서열의 변형이 일어날 경우 PCR 프 라이머 및/또는 프로브를 이용한 증폭 과정이 실패하여 위음성의 결과를 도출하거나 증폭효율의 저하에 기인하는 검출감도의 저하를 초래하여 정확한 정량이 되지 않는 문제도 있다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 시료 중에 포함되어 있는 표적핵산인 미량의 HBV를 이용하여 정확하고 신속하게 HBV 핵산을 검출 및 정량하고, 돌연변이 등의 유전자 변형이 극히 적은 두 부위의 HBV 유전자를 동시에 검출 및 정량하는 방법을 개발하였으며, 이에 의할 경우 행여 한 부위의 유전자가 돌연변이 등을 통해 변형이 되더라도 다른 한 부위의 유전자가 안정적으로 검출되므로, HBV 감염 의심 개체에 대한 감염 여부를 높은 민감도와 특이도를 가지고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 HBV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 또는 서열번호 3과 4 로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재된 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 HBV 유전자 검출용 조성물을 포함하는 HBV 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 HBV 유전자 검출용 조성물을 이용하는 HBV 유전자 검출 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 HBV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 프라이머 쌍에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1과 2, 또는 서열번호 3과 4 로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍이다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)" 란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형 성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 목적상 프라이머는, HBV S 단백질 부위 또는 HBV pre-Core 부위를 특이적으로 증폭하는 프라이머이다. 따라서, 본 발명의 프라이머는 상기 유전자에 상보적으로 결합 가능한 7 내지 50, 보다 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍으로 이루어져 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 의하여 HBV S 유전자 영역이 특이적으로 증폭될 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 의하여 HBV pre-Core 부위가 특이적으로 증폭될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유 할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 제공하는 서열번호 1 과 2, 및 서열번호 3과 4의 염기서열을 가지는 프라이머로 PCR을 수행한 경우, 각각의 HBV 유전형을 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있다. 상기에서, '민감도(sensitivity)'는 질병이 있는 사람을 양성으로 검출하는 비율, 즉 병이 있는 사람을 병이 있다고 판단하는 비율을 의미한다. '특이도(specificity)'는 건강한 사람을 음성으로 검출하는 비율, 즉 정상인 사람을 정상이라고 판단하는 비율을 의미한다.
따라서 상기 프라이머를 HBV 감염여부, 감염된 HBV 유전형의 확인, HBV 역학조사, HBV 백신의 유효성 및 위해도 조사 등에 효과적으로 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재된 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 HBV S 단백질 부위에 특이적인 신규의 프라이머로써 서열번호 1의 염기서열을 가지는 센스 프라이머 및/또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 안티센스 프라이머, 및 서열번호 7의 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 HBV 검출용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 HBV pre-Core 부위에 특이적인 신 규의 프라이머로써 서열번호 3의 염기서열을 가지는 센스 프라이머 및/또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 안티센스 프라이머, 및 서열번호 8의 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 HBV 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 HBV 검출용 조성물은 위음성 반응을 확인하기 위한 내부 대조군으로, 사람 및 HBV 유전자에는 존재하지 않는 유전자에 특이적인 신규의 프라이머로써 서열번호 5의 염기서열을 가지는 센스 프라이머 및/또는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 안티센스 프라이머, 그리고 서열번호 9의 염기서열을 가지는 프로브를 포함한 내부대조군 검출용 조성물을 제공한다.
바람직하게 본 발명은 상기와 같은 S 단백질에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하고 이와 동시에 상기와 같은 pre-Core 부위에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용함으로써, 단일한 유전자 염기서열에 대한 프라이머 및 프로브를 이용하는 기술에 비해 HBV의 혈중 내 검출에 대한 뛰어난 민감도 및 특이도를 제공할 수 있다. 구체적인 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.
이름 프라이머 염기서열 길이 서열번호
BSFOR GTR TCT GCG GCG TTY TAT CA 20 1
BSREV GGA CAA ACG GGC AAC ATA CC 20 2
BCFOR AAA TGC CCC TAT CYT ATC AAC ACT 24 3
BCREV CCG AGA TTK AGA TCT TCT GCG A 22 4
ICFOR CGA TGG CCC TGT CCT TTT ACA TTT A 25 5
ICREV CTT TTC GTT GGG ATC TTT GAT TAA A 25 6
본 발명에서 사용되는 용어, "HBV (Hepatitis B virus)"란 B형 간염을 의미하고, 주로 혈액을 통하여 전염되는 간염의 일종으로, 크게 급성과 만성으로 구분된다. 급성의 경우, 증상은 A형 또는 C형 간염과 비슷하며, 대부분 아무런 증상 없이 지나가고 독감과 같은 증상이 나타나기도 하는데 별도의 치료 없이도 호전되기도 한다. 만성의 증상도 C형 간염과 유사한데, 쉽게 피곤하거나 열이 나며, 구역질, 근육통 또는 관절통 증상이 나타난다. 증세가 장기간 지속되면 간경화증이나 간암으로 발전할 가능성이 높으므로 지속적인 검사가 필요한 질병으로서, 진단방법으로는 PCR을 이용한 방법 등이 있으나, 기존 PCR을 이용한 진단 방법은 단일 부위에 대한 증폭 및 검출로 인해 이 부위가 돌연변이 등의 변형이 발생할 경우 낮은 민감도 및 특이도를 야기하고 이로 인한 위양성 및 위음성의 소지가 존재하였다. 본 발명은 상기와 같은 진단 방법에 있어서, S 단백질 부위의 프라이머 및 프로브를 사용하는 동시에 pre-Core 부위의 프라이머 및 프로브를 사용하고, 이들 두가지의 증폭 및 검출 산물을 하나의 반응 결과로 수행함으로써 진단의 편리성 유지하는 한편, 민감도 및 특이도가 높은 진단률을 제공하고 또한 정확한 정량 결과를 제공할 수 있다.
바람직한 양태로서 본 발명의 조성물은 상기 프라이머 서열에 의해 증폭되는 핵산을 검출하기 위하여 프로브(probe) 서열을 추가적으로 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"란, 올리고뉴클레오타이드를 말하는 것으로, 자연적으로 발생하거나, 합성적으로, 재조합적으로, 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는 것으로, 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 최소 부분에 결합할 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 서열의 검출, 정의 및 분리에 유용하다. 바람직한 양태로서, 본 발명에 사용된 프로브는 형광성, 방사성, 및 발광성 시스템을 포함할 수 있고, 다른 검출 시스템에서 검출할 수 있도록 "리포트 분자"로 표지될 수 있다. 본 발명은 특별한 검출 시스템 또는 라벨에 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명의 프로브는 서열번호 7과 서열번호 8로 제시되는 프로브이며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 HBV의 존부에 대해 민감도 및 특이성 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였고 상호간에 교차반응이 없음도 확인하였다.
바람직한 하나의 양태로서 본 발명은 상기 프로브의 5' 말단 및 3' 말단에 형광 물질을 포함하는 프로브일 수 있다. 하나의 바람직한 양태로서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 형광물질이 표지되어 있고, 5' 말단에 표지된 형광 물질(reporter)과 3' 말단에 표지된 형광물질(quencher)은 상호 간섭 현상을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 S 단백질 혹은 pre-Core 부위에 결합된 상태에서는 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광 물질은 소실되는 반면 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색 반응을 하게 된다. 이와 같은 상기 발색 반응에 의하여 시료로 부터 HBV의 존부를 판단할 수 있게 된다.
상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광 물질 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5 (cyanine-5) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 5' 말단 형광물질이 제한되는 것은 아니다.
3' 말단에 표지될 수 있는 형광물질 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한없이 사용될 수 있으며, 그 예로, 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ 1, 2 및 3 (black hole quencher 1, 2, 3) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 형광물질이 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 서열번호 7의 프로브 내지 서열번호 9의 프로브의 염기서열은 하기 표 2와 같다.
이름 5' 프로브 염기서열(5'->3') 3' 길이 서열번호
BSFAM FAM CAT CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT C TAMRA 25 7
BCFAM FAM CCC CTA GAA GAA AGA ACT CCC TCG CC TAMRA 26 8
ICCy5 Cy5 ATT ACC TGT CCA CAC AAT CTG CCC TT BHQ3 26 9
본 발명의 HBV 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브는 실시간 중합효소 연쇄반응에 적합한 100bp 정도의 길이를 갖는 PCR 증폭 산물을 형성할 수 있으며, 특히, S-단백질 및 pre-Core에 특이적인 프로브는 테크만 분석법(taqman assay) 또는 분자 비콘 분석법 (molecular beacon assay)에 의한 PCR 정량 분석시 유용하게 사용될 수 있다.
이와 같은 프라이머 및 프로브 서열은, 본 발명자들은 염기서열 분석을 통하여 위양성 및 위음성의 위험이 적은 부위를 연구한 결과, HBV 유전자만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열이고, BBI에서 제공하는 공인된 Genotype Panel (PHD201(M))을 이용한 시험에서 100% 양성 예측률을 나타냄으로써 위양성 및 위음성의 위험이 극히 적다는 것을 확인하였다. 또한 상기 Genotype Panel을 이용하여 각각의 정량성을 측정한 결과 Panel간 정량 결과에 유의한 차이가 없음을 확인하였다 (표 5). 따라서, 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 7, 서열번호 8의 프로브 사용하는 경우 매우 신뢰성 있게 혈액내에서 HBV 감염을 검출 및 정량을 할 수 있다.
바람직한 양태로서 본 발명은, 위양성 및 위음성을 최소화 하기 위하여 내부 대조군으로써 추가적인 프라이머 서열 및 프로브 서열을 포함할 수 있다. 내부 대조군은, 비교를 위하여 내부에 대조군을 설정함으로써 위양성 및 위음성을 방지하기 위한 표지자로 작용한다.
바람직하게 상기 내부 대조군은 식물로부터 유래한 GFP (Green Fluorescence
Protein)일 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 GFP 프라이머 서열은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 포함할 수 있다 (표 1 참조).
이와 같은 위음성을 방지하기 위한 내부 대조군 프라이머 및 프로브는 식물 유래의 유전자인 GFP (Green Fluorescence Protein) 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브로써, 상기 HBV 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브의 실시간 중합효소 연쇄반응을 저해하지 않고 별개로 PCR 증폭 산물을 형성함으로써 특히 낮은 농도의 HBV 검출에 있어서 내부 대조군의 PCR 증폭 산물 형성으로 인해 HBV PCR 증폭 산물 형성이 저해를 하지 않아, 위음성을 보다 효과적으로 방지할 수 있게 되고, 정량결과의 신뢰성을 높이는 동시에 정량의 범위에 있어 보다 낮은 범위에 대한 정량을 가능하게 한다. 반대로 높은 농도의 HBV 검출에 있어서 HBV 유전자의 PCR 증폭 산물 형성으로 인해 내부 대조군의 PCR 증폭 산물 형성이 저해를 받지 않아, 시험결과의 신뢰성을 효과적으로 유지하여 내부대조군 반응의 유실로 인한 재시험 소지를 낮추어 검사자의 편의성 및 업무 효율성을 높이는 동시에 높은 범위에 대한 정량을 가능하게 한다. 내부 대조군에 대한 프로브의 염기서열은 상기 표 2에 기재한 서열번호 9와 같다.
또 하나의 바람직한 양태로서 본 발명은 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 멸균 증류수를 추가적으로 포함하는 HBV 검출 및 정량용 조성물일 수 있다. 또한, 상기 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 멸균 증류수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소등이 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 표 3의 조성에 따른 HBV 검출용 조성물 일 수 있다.
바람직하게 추가되는 효소는 HS-Taq일 수 있다. HS-Taq은 열 처리에 의해 활성화되는 Taq DNA 중합효소로부터 변형된 것으로서 활성 부위에 효소가 부착되어 실온에서는 효소가 불활성을 나타내게 되므로, 증폭 과정에서 잘못된 프라이머가 신장 (extend)되지 않아, 일반적인 DNA 중합효소와 비교하여 높은 특이성과 높은 수율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머, 프로브, HS-Taq 및 완충용액 등의 구체적인 조성은 하기 표 3과 같다.
첨가물 투입량 (㎕)
프라이머




 100 μM BSFOR 0.1
100 μM BSREV 0.1
100 μM BCFOR 0.1
100 μM BCREV 0.1
100 μM ICFOR 0.1
100 μM ICREV 0.1
프로브

 100 μM BSFAM 0.02
100 μM BCFAM 0.02
100 μM ICCy5 0.02

PCR 반응물

2U HS prime Taq premix 4.845
1M MGCl2 0.004
100mM dUNTP 0.025
2000 U/mL UDG 0.125
추출된 DNA 5
Milli-Q Water 4.34
합계 20
본 발명은 바람직하게 상기 표적 증폭반응은 PCR 반응일 수 있으며, PCR 반응의 수행조건은 하기 표 4와 같다.
실시간 PCR 반응 조건
온도/시간 반복 회수
50℃/2분 1
95℃/10분 1
95℃/15초
57℃/60초
72℃/20초		 40
또 하나의 양태로서 본 발명은 개체로부터 시료를 수득하는 단계; 상기 HBV 검출용 조성물을 사용하여 생물학적 시료의 HBV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HBV 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 HBV로 감염되거나, 감염을 의심받는 개체 또는 HBV 백신으로 백신화된 개체의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 HBV 의심 개체의 혈액으로부터 수득되는 시료임이 바람직하다.
상기 HBV의 존재 및 유전형의 검출 방법은 상기의 프라이머를 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 이런 방법에는 특정한 가닥의 프라이머를 프로브로 사용하여 이를 검출하는 HBV DNA의 직접 확인법이 있고, 서던 블럿팅(southern blotting), 도트 블럿팅(dot blotting) 및 FISH(filter in situ hybridization) 등을 예로 들 수 있다. 다른 방법으로는 프라이머 쌍을 사용하여 HBV DNA의 증폭을 이용하는 방법이 있고, 유전형-특이적 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR), 일반화된-프라이머(general-primer) PCR 등을 그 예로 들 수 있다. 보다 바람직하게는 PCR이며, 더욱 바람직하게는 실시간 PCR 이다.
본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)"은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 1985년 물리스(Mullis) 등에 의해 개발되었고, DNA 분자의 어느 부분이든지 그 경계 서열만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제 1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시킨다(변성단계). 제 2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다(결합단계). 제 3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 25 내지 30회 반복한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 임상 검체로부터 추출한 DNA를 증폭시키고 생성된 산물을 실시간으로 분석 검출하는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR) 분석을 수행할 수 있다. 이러한 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR) 분석은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, 실시간 중합효소 연쇄반응기기의 예를 들면, SLAN real time PCR detection system (LG 생명과학, 한국), LightCyclerTM (Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700 (Applied Biosystems, USA), iCyclerTM (Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM (PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
PCR 결과의 신뢰성을 결정하는 가장 큰 요소는 프라이머로, 프라이머 서열에 따라서는 비특이적 증폭에 의해 잘못된 결과를 내릴 수도 있다. 그런 점에서, 본 발명은 신뢰할 수 있는 프라이머 쌍을 제공하는데 의의가 있다. 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 각 유전형별 HBV를 정확하게 검출 가능하고 아주 적은 양까지도 민감하게 정량 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타낸다. 즉, 본 발명의 프라이머 쌍은 타당도(validity)와 신뢰도(reliability)가 높은 프라이머로, 이를 이용하여 얻은 결과를 신뢰할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 HBV 검출용 조성물을 포함하는 HBV 검출 및 정량용 키트에 관한 것이다.
바람직하게 키트의 구성으로는, 본 발명의 서열을 갖는 프라이머 및 프로브, 및 내부 대조군으로서의 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트로 제조될 수 있으며, HBV의 검출 및 정량을 위하여 완충용액, KCl, MgCl2, 또는 dNTP 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 표 3의 조성을 가진 키트를 사용함으로써, HBV의 증폭 및 검출이 가능한 키트를 제조할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기와 같은 조성을 갖는 조성물을 제조하여 높은 민감도 및 특이도를 갖고 HBV 검출 및 정량할 수 있음을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 중합 PCR 법을 이용하면 HBV 바이러스 감염에 대한 검출 및 정량을 기존 방법과 비교하여 동등 이상의 수준의 민감도와 특이도로 수행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하고, 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 및 프로브의 제작
본 발명에서 사용하는 HBV 특이 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자은행 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 진뱅크 (genebank) 염기서열을 hitachi 소프트웨어사의 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 HBV 바이러스 (HBV Virus)의 유전자만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.
식물 유래 유전자 특이 프라이머와 프로브는 염기서열을 확보한 후 HS-Taq를 이용하여 HBV를 검출하는 조성물 내에서 HBV 특이 프라이머와 프로브와 경쟁적으로 저해하지 않는 염기서열 및 조성물의 구성을 실험을 통해 결정하였다.
실시예 2. 상기 프라이머 ( primer )의 합성
실시예 1에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판 (sambrook 및 rusell, cold spring harbor laboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 메타비온사 (metabion, 독일)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 3. 임상검체로부터의 HBV DNA 추출
HBV 감염이 의심되는 환자 혈액으로부터 혈청 (Serum) 또는 EDTA-플라즈마 (EDTA-Plasma)를 분리해 내고, 이를 Qiagen사의 QIAamp MineElute Virus Spin Column과 같은 실리카 막 (Silica Membrane) 기반의 스핀 컬럼 (Spin Column)을 이용하여 추출하였다.
실시예 4. 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 다중 PCR 반응 분석
표 3과 같은 PCR 반응 조성으로 PCR 반응 조성물을 제조하고, 표 4와 같은 조건으로 PCR 반응을 SLAN real time PCR detection system (LG 생명과학, 한국)에서 시행하였다. 실시간으로 반응 산물을 측정하였으며, 반응이 완료된 후 결과를 SLAN 8.0 프로그램을 이용하여 분석하였다.
PCR을 이용한 HBV DNA 정량법 중 Cobas Amplicor HBV Monitor testTM (Roche Diagnostics Systems, Meylan, France)는 높은 민감도를 가지고 있으나 검사법의 측정 가능 범위가 2.0×102-2.0×105 copies/mL로 좁아 정확한 정량이 가능한 직선범위 내에서 측정하기 위해 검체 희석을 필요로 하는 단점이 있다. 또한, bDNA법은 신호 증폭(signal amplification) 원리에 기초한 DNA 정량법으로서, 각각의 바이러스 DNA에 특이한 프로브를 이용하여 환자의 혈청 내에 존재하는 바이러스 유전자를 포획한 후 포획된 유전자에 다시 프로브와 증폭체를 반응시킴으로써 DNA를 정량하는 방법으로, 수년 전부터 B형 간염 바이러스를 비롯한 여러 바이러스의 진단 및 치료 효과 판정에 이용되고 있다. 본 발명에서는 본 발명자들이 고안한 실시간(real-time) PCR법으로 우리나라 만성 HBV 감염 환자의 혈청 HBV DNA치를 측정하고, 기존 사용되고 있는 Cobas Amplicor HBV MonitorTM 검사법 및 bDNA 법과 비교함으로써 그 적절성을 평가하였다.
그 결과, 표 5 및 도 3에 나타난 바와 같이, BBI에서 제공하는 공인된 Genotype Panel (PHD201(M))을 이용한 시험에서 100% 양성 예측률을 나타냄으로써 위양성 및 위음성의 위험이 극히 적다는 것을 확인하였다. 또한, 도 1은 HBV 특이 프라이머 및 프로브와 내부 대조군과 경쟁적으로 저해하지 않고 양성 검출 및 정량할 수 있음을 판단할 수 있었다.
Member ID # Origin Genotypes % Identity GI # Roche Cobas Amplicor Monitor ( copies / mL ) Bayer bDNA ( copies / mL ) AdvanSure HBV QPCR ( copies / mL )
PHD201-01 US Negative N/A N/A < 300 < 2000 < 58.2
PHD201-02
 US
 A
 94 416174A 1.9 X 104
4.8 X 104
3.2 X 104
94 416076A
PHD201-03
 US
 A
 97 416074A 1.5 X 104
4.2 X 104 3.6 X 104
95 416076A
PHD201-04 E Asia B 99 416078B 1.9 X 104 8.0 X 103 4.7 X 103
PHD201-05


 E Asia


 C


 98 452622C
1.7 X 104


1.9 X 104


5.6 X 103

97 416080C
98 452641C
98 416082C
PHD201-06
 Middle East
 D
 94 416086D
1.6 X 104
9.5 X 103
3.2 X 103
95 416084D
PHD201-07
 US
 A
 99 416074A 1.1 X 104
1.4 X 104 6.5 X 103
97 416076A
PHD201-08 Africa E 99 X75657 2.4 X 104 1.8 X 104 2.5 X 104
PHD201-09 South America F 99 X69798 1.3 X 104 1.5X 104 1.3 X 104
실시예 6. 본 발명 키트의 HBV 대한 검출한계시험 결과
본 발명의 키트를 이용하여 HBV 감염에 대한 검출한계시험에 대한 내부 시험의 결과는 아래 표 6 과 같다.
검출한계 시험 결과표
IU / mL # Tested # Detected % Detected
10 24 24 100
6 24 24 100
5 24 24 100
3 24 23 96
2 24 22 92
1 24 20 83
Probit 95% Hit rate 2.6 IU/mL (95% confidence limits of 1.6 ~ 10.4 IU/mL)
검출한계를 확인하기 위해 시행한 검사에서 공인된 정량표준물질인 NIBSC Standard 97/746을 Matrix Effect가 Normalization되었다고 판단하여 일반적으로 사용하는 Drug Free Serum (Bio-rad)으로 희석한 서로 다른 농도의 6개 HBV 혈청을 DNA를 추출한 후 AdvanSure HBV Real-Time PCR로 정량한 것을 Probit 분석을 실시하여 95% 검출한계값을 산출하였다. 그 결과 95% 검출한계는 2.6 IU/mL이었다.
도 1은 HBV 특이적 프라이머 및 프로브와 내부 대조군과 경쟁적으로 저해하지 않고 양성 검출 및 정량할 수 있음을 정렬한 결과를 나타낸다.
도 2는 HBV 정량 표준 물질의 직선성을 나타낸다.
도 3은 HBV S-단백질 부위와 pre-core 부위를 개별적으로 PCR했을 때의 결과를 나타낸다.
도 4는 HBV S-단백질 부위와 pre-core 부위를 동시에 PCR 했을 때의 결과를 나타내며, 동시에 PCR 하는 경우에도 상호 경쟁적 저해현상 없이 검출되고 정량성에 있어 유의한 차이 없이 정량 가능함을 나타낸다.
<110> LG LIFE SCIENCES, LTD. <120> A METHOD FOR DETECTING HBV USING REAL TIME PCR <130> PA090092/KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplication of HBV S protein <400> 1 gtrtctgcgg cgttytatca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplication of HBV S protein region <400> 2 ggacaaacgg gcaacatacc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplication of HBV pre-Core region <400> 3 aaatgcccct atcytatcaa cact 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplication of HBV pre-Core region <400> 4 ccgagattka gatcttctgc ga 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplication of GFP <400> 5 cgatggccct gtccttttac attta 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplication of GFP <400> 6 cttttcgttg ggatctttga ttaaa 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for HBV S protein region <400> 7 catcctgctg ctatgcctca tcttc 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for HBV pre-Core region <400> 8 cccctagaag aaagaactcc ctcgcc 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for GFP <400> 9 attacctgtc cacacaatct gccctt 26

Claims (12)

  1. B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4 로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍.
  2. 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재된 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 내부 대조군으로서 서열번호 5 및 서열번호 6로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 기재된 염기서열을 가지는 프로브를 추가적으로 포함하는 경쟁적인 저해현상이 없는 HBV 검출용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, HS-Taq, 완충용액, dNTP 또는 멸균 증류수를 추가적으로 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 각각 100μM의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머, 각각 100μM인 서열번호 7 및 서열번호 8의 프로브, 2.5U HS-Taq, 및 2mM dUTP 를 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HBV 검출용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질을 포함하는 HBV 검출용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 5' 말단의 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 HBV 검출용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 3' 말단의 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ 1, 2 및 3 (black hole quencher 1, 2, 3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 HBV 검출용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 HBV 검출용 키트.
  10. 개체로부터 시료를 수득하는 단계; 및 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 생물학적 시료의 HBV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HBV 유전자를 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 검출은 중합효소 연쇄반응에 의한 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 시료는 혈액인 방법.
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