CN108950082A - 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,包括PCR反应液1,PCR反应液2,DNA内控,定量参考品A、B、C、D,强阳性质控品,临界阳性质控品和阴性质控品;PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上、下游引物,用于检测靶多核苷酸的探针,DNA内控引物及探针,PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液。本发明的试剂盒灵敏度高,最低检出限为5IU/ml;线性范围广,可覆盖20‑1.0E+09IU/ml;特异性强,针对保守区段S区序列设计1对引物,与其他病原体无交叉干扰;扩增效率高,通过添加酶保护液稳定双功能酶的空间构象,增强了其活性;快速检测,整个检测过程在50分钟内完成;便于保存运输,无需冷冻及反复冻融,提高了用户使用的便捷性。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术,尤其是涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝病毒,主要存在于肝细胞内并损害肝细胞,引起肝细胞炎症、坏死、纤维化,是导致人类病毒性肝炎最主要的原因。HBV感染呈世界性流行,但不同地区HBV 感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道,全球约20亿人曾感染HBV,其中2.4亿人为慢性HBV感染者,每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。所以对于乙肝病毒的预防和诊疗是国家传染病控制的头等大事。
HBV 酶联免疫试剂是目前诊断乙肝的主要手段。乙肝“两对半”酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床、急诊、血液筛查等各个领域。但是,酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方法,容易造成漏检,不利于乙肝的早期诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势,相比较免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。
目前,国内已有多种基于荧光定量PCR 技术的乙肝定量检测试剂盒应用于临床检测中,这些试剂盒所提供的乙肝核酸提取方法主要是离心柱法,且扩增试剂需要于-20℃保存。该类试剂盒虽具有一定的优点,但仍存在很多不足:(1)离心柱法操作繁琐,容易导致核酸“气溶胶”污染;(2)扩增试剂-20℃的保存条件不利于保存和运输;(3)提取和扩增时间比较长,延长了患者等待时间;(4)检测灵敏度低,约在500IU/ml 左右;定量范围窄,一般在1.00E+03IU/ml ~ 1.00E+08IU/ml之间;(5) 没有设置阳性内对照( 即内标),无法监控假阴性;(6)一般没有预防PCR 产物污染的措施。因此,研究开发一种乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒是目前急待解决的新课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,以期从根本上解决现有乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测试剂盒扩增试剂需-20℃保存且扩增时间较长的技术问题。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,包括PCR反应液1,PCR反应液2,DNA内控,定量参考品A、B、C、D,强阳性质控品,临界阳性质控品和阴性质控品;所述PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、用于检测靶多核苷酸的探针、DNA内控引物及探针、PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液;所述的PCR反应液2包括20~30mM MnCl2,0.09%叠氮化钠。
所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的浓度为20~30pmol/µl,用于检测靶多核苷酸的探针浓度为10~15pmol/µl,DNA内控引物的浓度为20~30pmol/µl,DNA内控引物探针的浓度为为10~15pmol/µl,其碱基序列分别为:
靶标引物1(SEQ ID No.1):5’- CCTACGGATGGAAATTGCAC -3’;
靶标引物2(SEQ ID No.2):5’- GAGCCAAGAGAAACGGACTGA -3’;
内控引物3(SEQ ID No.3):5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA -3’;
内控引物4(SEQ ID No.4):5’- CCAGTATGGAACCACGCTATGT -3’;
靶标探针1(SEQ ID No.5):FAM- CGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACC-BHQ1;
内控探针2(SEQ ID No.6):ROX- TCGGGTTTCCGTCTTGCTCGTATCGC-BHQ2。
所述PCR反应缓冲液包括30~80mM基础缓冲液Tris和增强剂(含有DMSO、甘油、甜菜碱、甲酰胺等)。
所述酶混合液包括双功能酶、UNG酶和酶保护液(包括甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、葡聚糖、聚乙二醇等),其中双功能酶含量为5~10U/ul,UNG酶含量为0.1~0.5U/ul。
采用权利要求1的试剂盒定量检测乙型肝炎病毒核酸的方法,其具体步骤为:
第一步,样本制备:提取强阳性质控品,临界阳性质控品、阴性质控品、定量参考品A、B、C、D以及待检测样品中的DNA,并在其中添加DNA内控,浓度为1.0E+05-1.0E+06copies/ml;
第二步,聚合酶链式反应:在80µl PCR管配制反应体系:PCR反应液1 20µl,PCR反应液210µl,模板RNA 20~60µl,将上述反应管于以下条件进行荧光定量PCR反应:
第三步,结果判断:阴性质控FAM通道No Ct,ROX通道Ct值≤40.0,强阳性质控品检测浓度应在1.0E+05-1.0E+07IU/mL范围内,临界阳性质控品Ct值≤45.0,在满足以上3个条件下,荧光定量PCR仪即可根据4个定量参考品绘制的工作曲线自动生成待测样本的检测浓度结果
本发明的优点在于试剂盒灵敏度高,最低检出限为5IU/ml;线性范围广,可覆盖20-1.0E+09IU/ml;特异性强,针对保守区段S区序列设计1对引物,与其他病原体无交叉干扰;扩增效率高,通过添加酶保护液稳定双功能酶的空间构象,增强了其活性;快速检测,整个检测过程在50分钟内完成;便于保存运输,无需冷冻及反复冻融,提高了用户使用的便捷性;本发明对于HBV抗病毒疗效监测和预后评估具有较高的参考价值,适于推广应用。
附图说明
图1是本发明试剂盒的线性范围。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。其中实施例中所用的技术手段若无特殊指明,均为常规方法;涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可以通过商业途径获取。
实施例1 本发明试剂盒的组成
1、PCR反应液1 20µl,其中含有4条特异性引物(SEQ ID No.1~4)和2条特异性探针(SEQ ID No.5~6),引物SEQ ID No.1~4的浓度为25 pmol/µl、探针SEQ ID No.5~6的浓度为15 pmol/µl;20mM dNTP,10×PCR反应缓冲液,双功能酶10U,UNG酶0.4U,酶保护液1.1µl。
2、PCR反应液2 10µl:其中含有25mM MnCl2,0.09%叠氮化钠。
3、DNA内控:为人工构建的质粒,浓度为1.0E+05-1.0E+06copies/ml。
4、定量参考品A、B、C、D:均为含有HBV目的片段的假病毒。
5、阴性质控品:HBV阴性血清或血浆,
6、强阳性质控品和临界阳性质控品:含有HBV目的片段的假病毒。
实施例2 HBV DNA的检测
1、构建反应体系
计算所需要的样本数,按照下表中的量等比例增加试剂量,强阳性质控品、临界阳性质控品和阴性质控品只做一份。
2、上机检测
直接上荧光定量PCR仪进行检测,扩增程序设置为50℃ 2min,93℃ 2min,(93℃ 5s,55℃ 20s)45Cycle,40℃10s;每个循环后收集FAM、ROX荧光。
3、质量控制
每批次测试均应包含一个强阳性质控品、一个临界阳性质控品和一个阴性质控品,所有质控均应无标记且:阳性质控品:1.0E+05~1.0E+07 IU/mL;临界阳性质控品:Ct值应<45;阴性质控品:FAM通道No Ct,ROX通道Ct值≤40.0;则该次测试结果有效,否则视为实验无效。
4、结果判读
确认本次实验符合上述“质量控制”中的要求,根据4个定量参考品绘制的工作曲线自动生成待测样本的检测浓度结果。
实施例3 本发明试剂盒的最低检出限
用核酸阴性血浆稀释国家参考品(code:300009-201602)中最低检出量参考品L至5IU/ml,采用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取纯化试剂(磁珠法)进行乙型肝炎病毒DNA的提取纯化,并使用本试剂盒进行检测,重复20次。检测结果如表1所示。
表1
从表1可以看出,20个重复复检出,本试剂盒的最低检出限可以达到5IU/ml。
实施例4 本发明试剂盒的线性范围
采用核酸阴性血浆梯度稀释乙型肝炎临床高值样本至1.0E+09IU/ml、1.0E+08IU/ml、1.0E+07IU/ml、1.0E+06IU/ml、1.0E+05IU/ml、1.0E+04IU/ml、1.0E+03IU/ml、1.0E+02IU/ml、30IU/ml、20IU/ml,每个浓度水平作3次重复,计算每个样本实测浓度对数值与理论浓度对数值的偏差(判定标准:偏差应在±0.5log值以内),并以理论浓度的对数值为X轴,以实测浓度的对数值为Y轴进行线性拟合,计算其线性相关系数|r|(判定标准:|r|应≧0.9800)。检测结果如表2和图1所示。
表2
从表2中可以看出,在20IU/ml-1.0E+09IU/ml的浓度范围内,每个样本实测浓度对数值与理论浓度对数值的偏差均在±0.5log值以内。
如图1中所述对数据进行线性拟合,R2=0.9993,r=0.9996。因此,本发明试剂盒的线性范围为20IU/ml-1.0E+09IU/ml。
实施例5 本发明试剂盒在2-8℃保存的稳定性
对本发明试剂盒进行2-8℃实时稳定性考核,考核点为1个月、3个月、6个月、12个月,并设置-20℃对照。在各考核时间点分别检测试剂盒的最低检出限、精密度、准确度和线性,结果如表3所示。
表3
结论:从表3可以看出,本发明试剂盒于2-8℃保存1年后,最低检测限、精密度、准确度和线性与-20℃对照组相比,检测结果无差异。表明本发明试剂盒可以实现2-8℃保存1年的技术效果。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
<141> 2018-08-13
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
Claims (5)
1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于:包括PCR反应液1,PCR反应液2,DNA内控,定量参考品A、B、C、D,强阳性质控品,临界阳性质控品和阴性质控品;所述PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、用于检测靶多核苷酸的探针、DNA内控引物及探针、PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液;所述的PCR反应液2包括20~30mMMnCl2,0.09%叠氮化钠。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于:
所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的浓度为20~30pmol/µl,用于检测靶多核苷酸的探针浓度为10~15pmol/µl,DNA内控引物的浓度为20~30pmol/µl,DNA内控引物探针的浓度为为10~15pmol/µl,其碱基序列分别为:
靶标引物1:5’- CCTACGGATGGAAATTGCAC -3’;
靶标引物2:5’- GAGCCAAGAGAAACGGACTGA -3’;
内控引物3:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA -3’;
内控引物4:5’- CCAGTATGGAACCACGCTATGT -3’;
靶标探针1:FAM- CGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACC –BHQ1;
内控探针2:ROX- TCGGGTTTCCGTCTTGCTCGTATCGC –BHQ2。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于:所述PCR反应缓冲液包括30~80mM基础缓冲液Tris和增强剂。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于:所述酶混合液包括双功能酶、UNG酶和酶保护液,其中双功能酶含量为5~10U/ul,UNG酶含量为0.1~0.5U/ul。
5.采用权利要求1的试剂盒定量检测乙型肝炎病毒核酸的方法,其特征在于:包括以下步骤:
第一步,样本制备:提取强阳性质控品,临界阳性质控品、阴性质控品、定量参考品A、B、C、D以及待检测样品中的DNA,并在其中添加DNA内控,浓度为1.0E+05-1.0E+06copies/ml;
第二步,聚合酶链式反应:在80µl PCR管配制反应体系:PCR反应液1 20µl,PCR反应液210µl,模板RNA 20~60µl,将上述反应管于以下条件进行荧光定量PCR反应:50℃ 2min,93℃2min,93℃ 5s、55℃ 20s循环45次,40℃10s;
第三步,结果判断:阴性质控FAM通道No Ct,ROX通道Ct值≤40.0,强阳性质控品检测浓度应在1.0E+05-1.0E+07IU/mL范围内,临界阳性质控品Ct值≤45.0,在满足以上3个条件下,荧光定量PCR仪即可根据4个定量参考品绘制的工作曲线自动生成待测样本的检测浓度结果。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181207 |
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