CN109593886A - 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 - Google Patents
一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109593886A CN109593886A CN201811633135.6A CN201811633135A CN109593886A CN 109593886 A CN109593886 A CN 109593886A CN 201811633135 A CN201811633135 A CN 201811633135A CN 109593886 A CN109593886 A CN 109593886A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbv
- kit
- virus
- primer
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,具体地,本发明利用实时荧光聚合酶链式反应技术对HBV DNA核酸鉴别并且进行定量的检测试剂盒,可广泛应用于HBV病毒引起的乙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪,以及检验检疫和疫情防控等多个领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒。
背景技术
乙肝病毒((hepatitis B virus,HBV)是目前已知可导致病毒性肝炎的病毒之一。全世界HBV感染者达20多亿,其中3.5亿是慢性乙肝病毒携带者。慢性病毒携带者发生并发症的风险较高,并发症包括:慢性肝炎、肝硬化与肝细胞性肝癌。血清学标志物通常作为急性或慢性HBV感染的诊断和/或预后指标。HBV感染最常见的标志物是HBV表面抗原(HBsAg)。尽管病毒携带者可清除HBsAg,并形成抗HBsAg抗体,但依然具有发生严重肝脏并发症的风险。HBVe抗原(HBeAg)通常是作为进展性肝病相关,活动性HBV复制的次要标志物使用。HBeAg清除障碍患者,晚期肝病风险增加。HBV变异株可失去产生HBeAg的能力,即使是患者处于肝炎活动期,也可出现所产生的HBeAg无法被测出的情况。因此,通过该标志物检测,进行疾病进展监测,具有一定的局限性,有研究报道,血清HBV DNA检测具有急性、慢性HBV感染预后预测价值。使用该方法,可进行HBsAg清除后HBV DNA检测,或血清学标志物缺失情况下的HBV检测。然而,目前为止,还未确立血清学标志物与HBV DNA拷贝之间的关系。可通过血清学标志物与肝脏酶活性检测结果,对HBV感染患者抗病毒治疗疗效进行评估。但最直接,最可靠的病毒复制检测方法是血清或血浆HBV DNA定量测定。研究显示,α-干扰素,拉米夫定,甘昔洛韦、阿德福韦酯治疗患者HBV DNA拷贝的迅速、持续性下降,是理想治疗疗效的一种可预测性因素。通过HBV DNA拷贝检测,可对拉米夫定耐药情况进行预测。因此,HBVDNA定量检测是一种有价值的工具,可与其他血清学标志物联用,用于对HBV感染者的管理。可通过应用核酸扩增技术,如多聚酶链反应(PCR),对血清与血浆中的HBV DNA进行定量测定。乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)应用PCR技术,EDTA抗凝血清与血清HBV DNA定量测定动态范围与灵敏性非常高。
乙肝五项检测并不能作为判断病毒是否复制的指标,而DNA检测通过扩增病毒核酸,对体内低水平的HBV病毒敏感,是判断病毒复制的常用手段。DNA是乙肝病毒感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标,HBV DNA阳性,提示HBV复制和有传染性,HBV DNA越高表示病毒复制越多,传染性越强。乙肝病毒的持续复制是乙肝致病的根本原因,HBV的治疗主要是进行抗病毒治疗,根本目的是抑制病毒复制,促使乙型肝炎病毒DNA的转阴。DNA检测对确诊HBV和评估HBV治疗效果也具有十分重要的作用,可了解机体内病毒的数量、复制水平、传染性、药物治疗效果、制定治疗策略等并作为评估指标,也是唯一能帮助确诊隐匿性HBV感染和隐匿性慢性HBV的实验室检测指标。
目前市面上有很多公司均研发出通过实时荧光PCR定量检测血清或血浆HBV病毒核酸载量的试剂盒。乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)能准确检测的HBVDNA浓度最低检出限越低(95%确信率),则灵敏度越高,越能及时检出HBV潜在感染者及对低水平HBV感染患者抗病毒治疗疗效进行有效评估,最低检出限仍然有可优化的空间。因此,本领域致力于开发灵敏度更高的HBV检测方法以满足临床需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏度、使用便捷的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒。
本发明的第一方面,提供了一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的PCR引物对组,所述引物对组包括第一引物对,所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。
在另一优选例中,所述引物对组还包括第二引物对,所述第二引物对包括如SEQID NO.:4所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.:5所示的反向引物。
本发明的第二方面,提供了一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的探针组,所述探针组包括:如SEQ ID NO.:3所示的针对乙型肝炎病毒S区基因保守序列的特异性的探针。
在另一优选例中,所述探针组还包括:如SEQ ID NO.:6所示的针对乙型肝炎病毒C区基因保守序列的特异性的探针。
在另一优选例中,所述探针组还包括:如SEQ ID NO.:7所示的内标探针。
本发明的第三方面,提供了一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的试剂盒,所述试剂盒包括HBV反应液B,所述HBV反应液B包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。
在另一优选例中,所述HBV反应液B还包括本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括HBV反应液A,所述HBV反应液A包括选自下组的一种或多种组分:
热启动Taq酶、UDG酶和dNTPs。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括HBV定量参考品。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括阴性质控品。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括HBV强阳性质控品。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括HBV临界阳性质控品。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括内标质控品。
本发明的第四方面,提供了一种检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法,所述方法包括步骤:
(1)提供待检测样本,所述样本中含有HBV DNA;
(2)制备扩增反应体系,进行扩增反应,绘制扩增曲线,并计算阈值循环值从而获得样本核酸的定量检测结果:
其中,所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、用于将待检测样本中HBV DNA进行扩增的PCR酶系试剂、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中,所述方法为非诊断目的。
本发明的第五方面,提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途,用于制备检测试剂盒,所述检测试剂盒用于乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量。
应理解,在本发明范围内,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1:20份灵敏度参考品PCR扩增曲线。
图2准确性参考品L0~L8的RT-PCR扩增曲线。
图3定量线性范围的标准曲线。
图4 1.0x105IU/mL参考品精密度扩增曲线。
图5 1.0x104IU/mL参考品精密度扩增曲线。
图6 1.0x103IU/mL参考品精密度扩增曲线。
图7对照引物对1检测结果。
图8对照引物对2检测结果。
图9使用对照引物对3的多重检测结果。
具体实施方式
本发明属于病原体分子检测领域,涉及一种高灵敏度的人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA的检测试剂盒,具体涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对HBV DNA核酸鉴别并且进行定量的检测试剂盒,可广泛应用于HBV病毒引起的乙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪,以及检验检疫和疫情防控等多个领域。
多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术,该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点,结合防污染技术处理,特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用不同荧光基团对特异性探针进行标记,配合多重PCR技术,可以在同一个PCR反应管中对多种类型的病毒同时进行扩增,荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系,并被自动化荧光检测仪收集,最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。由于,荧光PCR技术具有扩增片段短,引物、探针具有双重特异等优点,因此,将多重实时荧光PCR技术应用于乙型肝炎病毒的快速检测,能提高检测鉴别效率,在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染乙型肝炎病毒,便于临床及时采取必要的防控和治疗措施,防止这些病毒继续传播,并提高诊疗效率,为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供支持和依据。
多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多,比如:
(1)反应体系不平衡,反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增,获得大量的扩增产物,而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以,随着扩增产物的大量出现,聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制,因此,前期处于劣势的引物及其模板,这时就更加难以反应,最终导致扩增产物量非常之小,以至于无法检测。
(2)引物特异性,如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强,那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争,从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致,将多对引物放置入一个体系中扩增,由于进行PCR反应的退火温度相同,所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体,包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构,还有一类是第三方DNA介导的聚体,这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争,影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素,但更多的因素尚不清楚。到目前为止,还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
在本发明的一个优选地实施方式中,本发明提供了一种荧光定量PCR方法定量检测HBV DNA的方案,具体涉及一种利用实时荧光PCR技术对HBV DNA核酸检测并且进行定量的试剂盒。
为了达到上述目的,本发明采用以下的技术方案:
(1)针对HBV基因组两个高度保守区同时设计特异性的引物和探针,避免漏检;
(2)通过仪器进行样本自动化检测;
(3)通过单管多重PCR反应进行特异性扩增HBV的两个保守序列;
(4)通过仪器自动绘制扩增曲线和计算阈值循环值,得到样本核酸的定量检测结果。
(5)通过阳性质控品、阴性质控品、定量参考品和内标质控品的质量控制,确保检测结果的有效性。
具体地,本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR方法的高灵敏度的HBV DNA定量检测试剂盒方案。
在GENBANK数据库上对已知的HBV的核酸序列进行比对,寻找各种HBV亚型的核酸序列的特异性保守区,并选定S区和C区两个基因保守区上分别设计两个靶核苷酸探针和对应的引物。这些引物探针在含有热启动Taq酶、尿嘧啶DNA糖基酶(UDG)、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的PCR反应液中,通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增
根据本发明的实施方案,本发明所涉及的试剂盒主要组成成分包括:酶系混合液(HBV反应液A)、引物探针及PCR反应液(HBV反应液B)、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、定量参考品和内标质控品;以及,分隔并集中包装这些试剂管的包装盒。
根据本发明的实施方案,引物探针混合液由4条HBV特异性的正、反向引物和2条特异性的探针组成。
根据本发明的实施方案,乙型肝炎病毒S区特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO.:1)和5’-AGATGAGGCATAGCAGCAGGATG-3’(SEQ ID NO.:2),对应乙型肝炎病毒特异性探针的序列是5’-GGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCG-3’(SEQ ID NO.:3);探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1;该对引物探针可特异性地检测乙型肝炎病毒,对其他病毒无交叉反应。
根据本发明的实施方案,乙型肝炎病毒C区特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GGAGTGTGGATTCGCACTCC-3’(SEQ ID NO.:4)和5’-CATTGAGATTCCCGAGATTGAG-3’(SEQID NO.:5),对应乙型肝炎病毒特异性探针的序列是5’-CCACCAAATGCCCCTTATCAACAC-3’(SEQ ID NO.:6),探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团Ecl ipse+4zip;该对引物探针可特异性地检测乙型肝炎病毒,对其他病毒无交叉反应。
根据本发明的实施方案,内标的正向和反向引物的序列分别是5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO.:1)和5’-AGATGAGGCATAGCAGCAGGATG-3’(SEQID NO.:2),与HBV引物(1)共用一套引物,内标探针的序列是5’-ATCATCACCAGGCACAACCCGAAGC-3’(SEQ ID NO.:7),探针的两端分别结合有荧光发生基团YELLOW和荧光淬灭基团BHQ1;
根据本发明的实施方案,两套引物所用探针5’端可采用FAM、VIC、HEX、YELLOW中任一荧光基团标记,但两套引物所用基团必须相同,3’端可采用TAMRA、BHQ1、BHQ2、Eclipse、Dabcy 1中任一荧光淬灭基团标记。
根据本发明的实施方案,引物探针混合液中两套引物浓度均为0.4mmol/L,探针浓度为0.04~0.08mmol/L。
根据本发明的实施方案,PCR反应液由pH值为8.8的40mmol/L Tris-HCl、1~10mmol/L MgCl2、10~50mmol/L KCl、5~10mmol/L(NH4)SO4组成。
根据本发明的实施方案,PCR反应酶系由热启动Taq酶、UDG酶、dUTPs组成;优选地,每人份PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5~10U,最佳用量8U;UDG酶用量为0.5~1U,最佳用量0.8U;dUTPs为6~12mmol,最佳用量10mmol。
根据本发明的实施方案,检测单人份的PCR反应液由PCR引物探针反应液、反应酶系混合液按26uL、4uL的体积混合成总体积30uL的反应液混合物,加入40uL待测样本的核酸,然后进行实时荧光定量PCR反应。
根据本发明的实施方案,PCR扩增的条件为:1、37℃5分钟,3、95℃15分钟;4、94℃15秒,随后55℃45秒,45个循环,在每一次步骤4循环的55℃45秒完成后,进行收集荧光信号。
根据本发明的实施方案,试剂盒提供了阴性质控品,阳性质控品,定量参考品和内标质控品。阴性质控品为HBV DNA阴性的健康人血浆。强阳性质控品,临界阳性质控品和定量参考品为临床检测乙肝表面抗原阳性的样本经国家标准品定值后,使用HBV DNA阴性的健康人血浆稀释到工作浓度。选择5.0×106IU/mL阳性标本制备成强阳性质控品,选择1.0×103IU/mL制备成临界阳性质控品,选择浓度分别为:HBV定量参考品1(1.0×106IU/mL)、HBV定量参考品2(1.0×105IU/mL)、HBV定量参考品3(1.0×104IU/mL)、HBV定量参考品4(1.0×103IU/mL)病毒样本制备成定量参考品。内标质控品为含有目的片段的重组质粒。
本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成,操作简单,耗时少,且最大限度地减少了后续污染的发生。检测结果可用于HBV快速筛查、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。
本发明的主要优点在于:
(1)自动化检测:自动样本制备、自动PCR扩增,与靶DNA和HBV内标质控检测。磁珠提取样本纯度高,通量大,提升了加样稳定性和试剂盒的灵敏度。
(2)增加UNG(UDG)/dUTP体系:UNG(UDG)/dUTP是一种防污染体系,能消除因PCR产物污染引起的假阳性检测结果。
(3)增加了内标(Internal Amplification Control)质控系统:内标可以对核酸提取及PCR扩增的整个过程进行监控,减少假阴性结果的出现。
(4)使用热启动Taq酶:热启动Taq酶采用化学修饰,经95℃热激15分钟,Taq酶才发挥作用。热启动Taq酶可减少引物二聚体的形成及增加反应特异性。
(5)灵敏度:使用两套HBV引物和探针,增加试剂盒灵敏度,可以达到2IU/mL,并降低漏检率。
(6)试剂采用PCR反应液、引物探针反应酶系混合液的大包装设置,适合多种荧光检测设备,具有适用性更加广泛的特点。
(7)本发明的方法所需样本少、性能稳定高效、准确性高。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1用于定量测定人血清与血浆中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的试剂盒
本试剂盒用于定量测定人血清与血浆中乙型肝炎病毒(HBV)DNA,可用于临床测量基础HBV DNA水平和治疗中HBV DNA水平,从而辅助进行治疗疗效评估。不能单独作为确诊或排除病例的依据。
试剂盒中包含的试剂组分
检验方案
1样本处理和核酸提取(样本制备区)
本试剂盒中的内标溶液参与提取过程,按照样本体积:内标溶液体积=50:1的比例在样本中加入内标溶液后进行核酸提取。本试剂盒中的质控品及阳性定量参考品均需要提取,用于对环境进行监控和PCR检测试剂的质控。阳性质控品和阴性质控品应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合相关法规要求。
2 PCR试剂准备(试剂准备区)
大包装:
从试剂盒中取出HBV反应液A、HBV反应液B,室温融化后振荡混匀,8,000rpm离心数秒后使用,取N个(N=待测样本个数+阴性质控品+HBV强阳性质控品+HBV临界阳性质控品+4管HBV阳性定量参考品)PCR反应管。
HBV单人份扩增体系配制如下表:
将A、B液充分混合,混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底,之后将30uL扩增体系分装到PCR管中。
3加样(样本制备区)
往上述HBV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HBV阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和HBV阳性定量参考品40uL。盖紧管盖,8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。
4 PCR扩增(扩增和产物分析区)
4.1 ABI Prism 7300,7500仪器设置
4.1.1打开“Setup”窗口,按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(Unknow)、阳性定量参考品(Standard),并在“Sample Name”一栏中设置样本名称;探针检测模式设置为:Reporter Dye1:FAM,Quencher Dye1:TAMRA,Reporter Dye2:VIC,Quencher Dye2:none,Passive Reference:NONE。
4.1.2打开instrument窗口,设置循环条件如下:
37℃5分钟,1个循环;95℃15分钟,1个循环;94℃15秒→55℃45秒(收集荧光),45个循环。
设置完成后,保存文件,运行程序。
4.2 LightCycler480仪器设置
4.2.1打开软件后,选择“New Experiment”,设置检测模式为“Multi ColorHydrolysis Probe/UPL Probe”,检测通道为FAM和VIC,反应体积为70uL。
4.2.2设置循环条件:
4.2.3选择“Sample Editor”,设定样品的名称、类型,在“StandardConcentration”框中输入标准品浓度,设置完成后,保存文件,运行程序。
4.3 Abbott m2000rt仪器设置
4.3.1将带有protocol的CD光盘载入system计算机,安装扩增程序,在Abbottm2000rt中选择相应的扩增指令,将加完核酸的PCR反应管放入仪器样品槽,关闭仪器舱门,运行扩增程序。
5结果分析
反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整,Start值可以在3~15、End值可设在5~20,在Log图谱窗口设置Threshold的Value值,使基线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis自动获得分析结果,在Report界面察看结果,记录未知样本数值(C)。
6质量控制
阴性质控品:FAM检测通路扩增曲线无对数增长期或Ct值等于45,VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期;
HBV阳性质控品:FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期且Ct值小于40,HBV强阳性质控品定值范围在1.0×106~4.0×107IU/mL,HBV临界阳性质控品定值范围在3.0×102~1.0×104IU/mL;
HBV阳性定量参考品:FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期,且Ct值<40,且R2≥0.97;
以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。
7结果判断
7.1如果在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或Ct值等于45,且在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期,则判样品的HBV DNA浓度小于检测灵敏度。
7.2如果在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且Ct值小于45,则按以下方法判断:
若样品的20≤C≤1.00E+007,则该样品的HBV DNA浓度=C IU/mL;
若样品的C>1.00E+007,则该样品的HBV DNA浓度>1×107IU/mL;如果需要精确定量结果,可将样品稀释到线性范围后再检测,则该样品的HBV DNA浓度=(C×稀释倍数)IU/mL;
若样品的2IU/mL≤C<20IU/mL,同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期,则该样品的HBV DNA浓度仅作参考;
若样品的C<2IU/mL,同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期,则该样品的HBVDNA浓度低于试剂盒的检测下限。
8检验结果的解释
8.1每次实验均需检测阴性质控品,HBV强阳性质控品,HBV临界阳性质控品,质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。
8.2阳性结果判定标准:在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且Ct值小于45。
8.3阴性结果判定标准:在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或Ct值等于45,在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期。
8.4报告:
阴性结果报告格式为:样本未检测到乙型肝炎病毒DNA,浓度低于试剂盒的灵敏度;
阳性结果报告格式为:
8.4.1当样本试验结果HBV DNA浓度在20IU/mL≤C≤1.00E+007IU/mL时,报告格式为:样本检测到乙型肝炎病毒DNA,其浓度为C IU/mL;
8.4.2当样本的试验结果HBV DNA浓度C>1.00E+007IU/mL时,报告格式为:样本检测检测到乙型肝炎病毒DNA,其浓度大于1×107IU/mL,如经稀释后检测,则报告格式为:样本检测到乙型肝炎病毒DNA,浓度为(C×稀释倍数)IU/mL;
8.4.3当样本的试验结果HBV DNA浓度2IU/mL≤C<20IU/mL,同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期,报告格式为:样本的乙型肝炎病毒DNA载量较低,测量值仅供参考;
8.4.4当样本的试验结果HBV DNA浓度C<2IU/mL,同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期,报告格式为:样本的乙型肝炎病毒DNA含量低于试剂盒的检测下限;若内标检测通道扩增曲线无对数增长期或无Ct值,则该样本的检测结果无效,应查找并排除原因,并对此样本进行重复检测。
实施例2:灵敏度检测实验
核酸检测限样本为经国家参考品定值的临床HBV病毒DNA样本,使用HBV阴性血清稀释至本试剂盒灵敏度2IU/mL作为核酸检测限参考品(20次重复)。阴性对照为阴性血清;
取提取后的阴性对照和灵敏度参考品核酸40μL,加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中,使每管PCR反应液总体积为70μL;盖紧八连管管盖,充分混匀,高速离心10秒;用于PCR扩增;
PCR扩增条件:第一阶段,37℃5分钟消解残余含dUTP的HBV DNA片段,1个循环;第二阶段,95℃15分钟预变性,1个循环;第三阶段,94℃15秒→55℃45秒(收集荧光),45个循环扩增。
对本发明的核酸灵敏度进行检测,实际测得的结果如图1所示,剪头所指为阴性对照。
试剂盒的核酸灵敏度检测结果与理论值相符,因此,本发明的检测限核酸灵敏度为2IU/mL。
实施例3:准确度检测实验
准确性参考品样本是经过国家参考品标定浓度的人工合成的DNA病毒,以HBV阴性血浆分别稀释为1.0×108IU/ml、1.0×107IU/ml、1.0×106IU/ml、1.0×105IU/ml、1.0×104IU/ml、1.0×103IU/ml、1.0×102IU/ml、20IU/ml,作为准确性参考品,共8份,分别编号为L0~L7。将8份准确性参考品与阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和4个阳性定量参考品同时进行核酸提取。
根据实例1中的步骤,从试剂盒中取出HBV反应液A、HBV反应液B,按单人份比例换算共配制15份(准确性待测样本8个+阴性质控品1个+强阳性质控品1个+临界阳性质控品1个+阳性定量参考品4个)PCR反应体系,之后将每人份40μl扩增体系分装到PCR管中。往上述HBV反应管中分别加入提取后的准确性参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品以及HBV定量参考品核酸40μl。盖紧管盖,8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。根据实例1中的PCR扩增步骤,将4个定量参考品的标准曲线对已知浓度的8个准确性样本进行定值,比较理论浓度和检测浓度结果。结果如表1所示。
表1准确性参考品实验结果
实验结果表明,8份准确性参考品L0~L7的定值结果均即不超过真实值±0.5Log值,属于质量可控范围内,定值结果合格。对于病毒载量为50~1.0×108IU/ml范围内的病毒样本,均可以使用本发明的人类乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒进行有效的定值检测,误差范围不超过0.5个Log10对数值。本试剂盒具有质控品对每次定值实验的有效性进行控制,避免实验失误得出有偏差的病毒载量定值结果,结果可控有效。同时,本试剂盒的PCR体系具有较宽的定量线性范围,准确度高,可满足不同的临床检测需求。
实施例4:精密度检测实验
精密度参考品样本为经国家参考品定值的临床HBV病毒DNA样本,使用HBV阴性血清分别稀释至1.0×105IU/ml、1.0×104IU/ml、1.0×103IU/ml各10份作为精密度性参考品,共30份。将30份精密度性参考品与阴性质控品、HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品和4个阳性定量参考品同时进行核酸提取。
根据实例1中的步骤,从试剂盒中取出HBV反应液A、HBV反应液B,按单人份比例换算共配制37份(精密度待测样本30个+阴性质控品1个+强阳性质控品1个+临界阳性质控品1个+阳性定量参考品4个)PCR反应体系,之后将每人份40μl扩增体系分装到PCR管中。往上述HBV反应管中分别加入提取后的精密度参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品以及HBV定量参考品核酸40μl。盖紧管盖,8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。根据实例1中的PCR扩增步骤,将4个定量参考品的标准曲线对精密度样本进行定值,计算定值浓度LOG值的变异系数CV。结果如表1所示。
表2精密度参考品实验结果
结果显示,以定量参考品定值对1.0×105IU/ml、1.0×104IU/ml、1.0×103IU/ml各10份精密度性参考品定值,三种不同浓度的精密度参考品的浓度对数值的变异系数均小于5%,表明本发明方法对同一病毒载量的样本定值具有一致的CT值,标准偏差小,多次测定结果的稳定性和精密度评价良好。
对比例1
本发明人针对HBV S区基因以及C区基因设计了十数对PCR扩增引物,其中绝大部分引物的灵敏度较低、特异性较差,存在漏检,无法满足检测需要,典型的普通PCR引物序列和检测效果数据如下:
对照引物对1(针对HBV S区基因保守序列)
上游引物:GTCCTGGCTATCGCT(SEQ ID NO.:8);
下游引物:GGCAACATACCTTGGTA(SEQ ID NO.:9)
对照RT-PCR引物对2(针对HBV C区基因保守序列):
上游引物:GGAGTGTGGATTCGCAC(SEQ ID NO.:10);
下游引物:GCCCACCTTATGAGTCC(SEQ ID NO.:11)。
具体检测步骤、检测条件、同以上实施例,使用对照引物对1的检测结果如图7所示,图7中最左侧泳道为Marker,其余泳道为不同的临床血浆样本,靶基因阳性,检测结果表明对照引物对1在部分样本中无法检测出靶基因,灵敏度差且特异性较差。
使用对照引物对2的检测结果如图8所示,图8中最左侧泳道为Marker,其余泳道为不同的临床血浆样本,靶基因阳性,检测结果表明对照引物对2的特异性同样极差,且漏检情况严重。对照引物对1和对照引物对2均不能满足核酸定量的检测的要求。
图7:对照引物对1检测结果。
图8:对照引物对2检测结果。
对比例2
为满足多重检测的需求,本发明人针对筛选出的多对PCR引物进行组合测试,其中绝大多数的组合无法满足多重检测需要,比如使用对照引物对3和本发明的针对HBV S区基因保守序列的特异性引物进行组合,进行多重检测。
对照引物对3(针对HBV C区基因保守序列):
上游引物:AAGAGAAACTGTTCTCG(SEQ ID NO.:12);
下游引物:ACCTTATGAGTCCAAGGAA(SEQ ID NO.:13)。
其中,使用对照引物对3对HBV C区基因保守序列进行检测,具有良好的特异性和灵敏度。
多重检测数据如图9所示,检测结果表明该两组引物对相互影响严重,无法进行多重检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
<130> 00018
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
caacctccaa tcactcacca acc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agatgaggca tagcagcagg atg 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggctatcgct ggatgtgtct gcggcg 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggagtgtgga ttcgcactcc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cattgagatt cccgagattg ag 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ccaccaaatg ccccttatca acac 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
atcatcacca ggcacaaccc gaagc 25
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gtcctggcta tcgct 15
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ggcaacatac cttggta 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ggagtgtgga ttcgcac 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
gcccacctta tgagtcc 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
aagagaaact gttctcg 17
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
accttatgag tccaaggaa 19
Claims (10)
1.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的PCR引物对组,其特征在于,所述引物对组包括第一引物对,所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。
2.如权利要求1所述的引物对组,其特征在于,所述引物对组还包括第二引物对,所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.:5所示的反向引物。
3.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的探针组,其特征在于,所述探针组包括:如SEQID NO.:3所示的针对乙型肝炎病毒S区基因保守序列的特异性的探针。
4.如权利要求3所述的探针组,其特征在于,所述探针组还包括:如SEQ ID NO.:6所示的针对乙型肝炎病毒C区基因保守序列的特异性的探针;优选地,所述探针组还包括:如SEQID NO.:7所示的内标探针。
5.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括HBV反应液B,所述HBV反应液B包括权利要求1所述的PCR引物对组。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述HBV反应液B还包括权利要求3所述的探针组。
7.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括HBV反应液A,所述HBV反应液A包括选自下组的一种或多种组分:
热启动Taq酶、UDG酶和dNTPs。
8.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,
所述试剂盒还包括HBV定量参考品;
所述试剂盒还包括阴性质控品;
所述试剂盒还包括HBV强阳性质控品;
所述试剂盒还包括HBV临界阳性质控品;和/或
所述试剂盒还包括内标质控品。
9.一种检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(1)提供待检测样本,所述样本中含有HBV DNA;
(2)制备扩增反应体系,进行扩增反应,绘制扩增曲线,并计算阈值循环值从而获得样本核酸的定量检测结果:
其中,所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、用于将待检测样本中HBVDNA进行扩增的PCR酶系试剂、权利要求1所述的引物对组、和权利要求3所述的探针组。
10.权利要求1所述的引物对组、和权利要求3所述的探针组的用途,用于制备检测试剂盒,所述检测试剂盒用于乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811633135.6A CN109593886A (zh) | 2018-12-29 | 2018-12-29 | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811633135.6A CN109593886A (zh) | 2018-12-29 | 2018-12-29 | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109593886A true CN109593886A (zh) | 2019-04-09 |
Family
ID=65964958
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811633135.6A Pending CN109593886A (zh) | 2018-12-29 | 2018-12-29 | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109593886A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110241264A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-09-17 | 北京达微生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 |
CN110408725A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-11-05 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 用于呼吸道病原体多重检测的试剂盒 |
CN110438262A (zh) * | 2019-07-30 | 2019-11-12 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102146487A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-08-10 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针 |
CN103642941A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-03-19 | 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 | 一种乙型肝炎病毒(hbv)核酸定量检测试剂盒 |
CN105400903A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-16 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 用于检测hbv核酸的引物组、探针、试剂盒及检测样本中hbv核酸的方法 |
CN105420410A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-23 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法 |
CN108950082A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-07 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
CN108977586A (zh) * | 2018-09-11 | 2018-12-11 | 广州市宝创生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
-
2018
- 2018-12-29 CN CN201811633135.6A patent/CN109593886A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102146487A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-08-10 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针 |
CN103642941A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-03-19 | 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 | 一种乙型肝炎病毒(hbv)核酸定量检测试剂盒 |
CN105400903A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-16 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 用于检测hbv核酸的引物组、探针、试剂盒及检测样本中hbv核酸的方法 |
CN105420410A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-23 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法 |
CN108950082A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-07 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
CN108977586A (zh) * | 2018-09-11 | 2018-12-11 | 广州市宝创生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110408725A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-11-05 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 用于呼吸道病原体多重检测的试剂盒 |
CN110408725B (zh) * | 2019-06-20 | 2022-07-05 | 广州达安基因股份有限公司 | 用于呼吸道病原体多重检测的试剂盒 |
CN110241264A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-09-17 | 北京达微生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 |
CN110241264B (zh) * | 2019-07-26 | 2023-01-31 | 北京达微生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 |
CN110438262A (zh) * | 2019-07-30 | 2019-11-12 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒 |
CN110438262B (zh) * | 2019-07-30 | 2023-12-05 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111235316B (zh) | 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用 | |
CN112063756B (zh) | 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 | |
CN105441595B (zh) | 一种用于检测hbv-b/c的数字pcr绝对定量分型检测试剂盒 | |
CN103060451B (zh) | 一种肺炎支原体mp检测试剂盒 | |
CN109576397A (zh) | 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒 | |
CN109593886A (zh) | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 | |
CN102146487B (zh) | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针 | |
CN109777893A (zh) | 微滴式数字pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒 | |
CN105483283B (zh) | 丙型肝炎病毒hcv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
CN106434996A (zh) | 一种检测鲍曼不动杆菌dna的试剂盒及检测方法 | |
CN113718021A (zh) | 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒 | |
CN102634572B (zh) | 一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒 | |
CN110923361B (zh) | 基于数字pcr用于血源筛查的引物、探针及试剂盒 | |
CN106701957A (zh) | 一种检测融合基因BCR‑ABL(P210)mRNA表达的试剂盒 | |
CN115852064A (zh) | 用于检测hbv基因t216c突变位点的引物和探针 | |
CN106399536B (zh) | 体液循环dna定量检测方法及试剂盒 | |
CN107022543A (zh) | 一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒 | |
Yang et al. | Development of highly accurate digital PCR method and reference material for monkeypox virus detection | |
CN106520763A (zh) | 一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒 | |
CN111719018B (zh) | 新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片及制备和使用方法 | |
CN104195255A (zh) | 一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒及其检测方法 | |
CN110241264A (zh) | 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 | |
CN102154523B (zh) | 检测人bk病毒核酸的引物与荧光探针及其应用 | |
CN109694926A (zh) | 一种定量检测hbv核酸的方法及试剂盒 | |
CN103820570B (zh) | 对虾桃拉综合症病毒可视化lamp检测试剂及检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: No.19 Xiangshan Road, high tech Development Zone, Guangzhou, Guangdong 510665 Applicant after: Guangzhou Da'an gene Co.,Ltd. Address before: No.19 Xiangshan Road, high tech Development Zone, Guangzhou, Guangdong 510665 Applicant before: DA AN GENE CO., LTD. OF SUN YAT-SEN University |
|
CB02 | Change of applicant information |