CN108977586A - 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 - Google Patents

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，包括有针对S和/或C基因的引物和探针，所述引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述探针为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7，且三条探针分别标记有荧光。所述高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒对HBV基因组DNA分子进行检测，具有很高的定量范围，灵敏度可达0.5IU/ml的HBV DNA，定量限低至2IU/ml的HBV DNA，检测限低至1IU/ml的HBV DNA。而且，采用本发明的方法和试剂盒，其引物与核酸侵入反应阶段的探针多功能使用，能够进一步降低探针设计和检测体系的复杂性和经济成本。

Description

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种超高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。
背景技术
HBV属于肝脱氧核糖核酸病毒科，在电子显微镜下显示为直径42nm的小圆颗粒，称为丹氏颗粒。丹氏颗粒由包膜和核心两部分组成，包膜含有表面蛋白、糖蛋白和细胞脂肪；核心含核心蛋白、HBV基因组DNA和HBV DNA多聚酶。HBV基因组为部分双链环状DNA，较长链通常含有3182个核苷酸而较短链含1700-2800个核苷酸。HBV全基因组DNA包含四个相互重叠的开放阅读框，编码四种具有特殊结构和功能的蛋白质。
HBV病毒侵入人体后，与宿主细胞上的特异性受体结合，脱去包膜，进入宿主细胞质内，脱去核衣壳，部分病毒基因组DNA进入并整合至宿主细胞核内，进一步反转录成mRNA进入宿主细胞质，并在HBV DNA逆转录酶的作用下逆转录合成病毒负链DNA，负链DNA在HBVDNA聚合酶作用下合成正链DNA，这样就完成了HBV基因组DNA的复制，形成了子代的部分双链环状DNA；最后和相关蛋白装配成完整的病毒颗粒，释放至宿主细胞外，由此完成病毒粒子的复制。在基因复制过程中会自发地或由免疫诱导产生突变，突变会随着时间累积，因此相对于其他DNA病毒而言，HBV基因组变异程度更大。
目前，世界上主要存在8种HBV亚型，即HBV基因型A-H，不同基因型之间全基因组序列差异不少于8％或S基因差异不少4％。在中国人群中出现的主要是A-D型HBV，其中以B、C、D型为主，A型较少见，且存在地区分布差异性。对于长期感染HBV的患者来说，若不加以干预，在慢性HBV患者几十年的发展历程中，有15％-40％的患者会发展成为肝硬化、晚期肝脏疾病、肝细胞癌或需要进行肝脏移植。在输血过程产生的漏检也是HBV感染的重要途径，因此，乙肝病毒的检测对于乙肝病毒感染的预防、诊断和治疗具有举足轻重的关键作用。
HBV病毒核酸遗传基因序列中的主要有四个开放阅读框(ORF)，分别称为S(ORFS)、C(ORF Core)、P(ORF P)及X(ORF X)，能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为S基因和前S基因，其中S基因能编码主要表面蛋白，前S基因能编码PreS1和PreS2蛋白。C区基因包括：前C基因，编码e抗原(HBeAg)；C基因，编码核心抗原(HBcAg)。其中S基因和C基因是保守型较高的序列区域，因此在检测中常以此序列为目标进行检测，已达到覆盖不同分型的目的。
对HBV的检测的灵敏度的要求越来越高，而且，对检测系统又要求不能过于复杂，要保持较高的稳定性。目前尚无一种方式采用该方式完成乙型肝炎病毒核酸超高灵敏定量检测。
发明内容
基于此，本发明的目的之一为提供一种超高灵敏乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，包括有针对S和/或C基因的引物和探针，所述引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述探针为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7，且三条探针分别标记有荧光。其中，SEQ ID NO.2可与SEQID NO.5及SEQ ID NO.7(内定量参考品探针)形成侵入结构并构成核酸侵入反应的探针组件，SEQ ID NO.4亦可与SEQ ID NO.6形成侵入结构并构成核酸侵入反应的探针组件。
一种乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，包括有针对S基因的引物和探针，所述引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述探针为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，且标记有荧光。其中，SEQ ID NO.2亦可与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7形成侵入结构并构成核酸侵入反应的探针组件。
一种乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，包括有针对C基因的引物和探针，所述引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述探针为SEQ ID NO.6，且标记有荧光。其中，SEQ ID NO.4亦可与SEQ ID NO.6形成侵入结构并构成核酸侵入反应的探针组件。
在其中一个实施例中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4中，各序列中至少有一个碱基通过LNA碱基修饰增加其模板结合效率，进一步提高检测灵敏度。
在其中一个实施例中，还包括有内定量参考品，进一步地，所述内定量参考品的碱基组成如SEQ ID NO.8所示。有该定量参考品(内对照)，可实现不需要标准曲线就能对临床样本实现定量检测。
本发明所述乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，分别针对乙型肝炎病毒核酸的S基因和C基因的两段保守序列作为靶序列，并通过引入内定量参考品(QS)，无需制备标曲即可实现样本的准确定量，可实现对HBV DNA的高灵敏实时荧光定量检测。
在其中给一个实施例中，所述内定量参考品(QS)是人为设计合成的质粒，针对HBV基因组中S基因上的保守序列设计相应的QS序列，使QS序列与靶标序列仅有一个碱基差异，保证了QS扩增效率与靶序列高度一致，因此进一步保证了HBV病毒定量的准确性。
本发明利用了PCR扩增和核酸侵入反应的结合方法，用于超高灵敏定量检测HBV核酸分子。该方法的具体原理是：通过设计一对PCR引物对目标模板进行扩增，为了增加引物与待检模板的结合效率，特别地，在引物上增加LNA碱基修饰以以进一步提高HBV模板扩增效率。针对扩增产物，以引物2为上游探针设计荧光下游探针，它可与模板退火杂交，形成一个单碱基重叠侵入结构，该结构可被Afu酶特异性识别，从而切割下游探针与模板互补的第一碱基的化学键，产生荧光信号。由于设计的下游探针与模板结合部分的Tm值接近反应温度，新的完整的下游探针会再次与模板退火，形成新一轮的切割，从而实现荧光信号的累积与扩增，实现对目标模板的检测。
而且，本发明所述试剂盒通过引物与探针的多功能使用，简化并优化了实验体系，进一步降低探针设计与检测体系的复杂性和经济成本。
本发明具有以下有益效果：
采用本发明的高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒对HBV基因组DNA分子进行检测，具有很高的定量范围，灵敏度可达0.5IU/ml的HBV DNA，定量限低至2IU/ml的HBVDNA，检测限低至1IU/ml的HBV DNA。而且，采用本发明的方法和试剂盒，其引物与核酸侵入反应阶段的探针多功能使用，能够进一步降低探针设计和检测体系的复杂性和经济成本。
进一步地，采用本发明的检测方法和试剂盒，其引物对采用LNA碱基修饰，通过增加引物与模板的结合效率和特异性，提高HBV核酸的扩增效率，从而进一步地提高试剂盒的检测性能。
此外，本发明中的新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒引入了单基因QS内标体系，简化了内标体系组分，不仅能够质控样本和试剂的有效性，还能够作为定量参考品定量待测样本的拷贝数，无需另外做定量标准曲线，实现了一种组分多重作用，简化了实验操作量，节约了成本。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。
图1是实施例2中乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的检测原理。
图2是实施例4中乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的灵敏度。
图3是实施例4中乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的单体系验证结果。
图4是实施例7中引物做LNA修饰的作用验证实验结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
建立一种PCR结合核酸侵入反应的方法进行HBV DNA的实时定量检测，原理如图1所示。通过设计一对PCR引物对目标模板进行扩增，为了增加引物与待检模板的结合效率，特别地，在引物上增加LNA碱基修饰以以进一步提高HBV模板扩增效率。针对扩增产物，以引物2为上游探针设计荧光下游探针，它可与模板退火杂交，形成一个单碱基重叠侵入结构，该结构可被Afu酶特异性识别，从而切割下游探针与模板互补的第一碱基的化学键，产生荧光信号。由于设计的下游探针与模板结合部分的Tm值接近反应温度，新的完整的下游探针会再次与模板退火，形成新一轮的切割，从而实现荧光信号的累积与扩增，实现对目标模板的检测。
采用加入内定量参考品(QS)进行HBV DNA的定量检测。QS是人工设计合成的质粒模板，含有与HBV目标C基因的DNA序列仅单碱基差异，完全相同的PCR引物和上游探针结合区域及一个特异的荧光下游探针结合区域，探针结合区域可用于HBV DNA和QS扩增子的区分，以此实现对QS的实时检测。
为尽可能增加HBV检测灵敏性，首先，分别针对HBV基因组的S基因和C基因分别进行扩增，不仅能够避免个别基因丢失产生的假阳性，还能够进一步提高检出的灵敏性；其次，扩增引物对上引入了LNA修饰，在不增加引物序列的前提下增加其Tm值，提高其与模板的杂交效率，进而增加扩增效率，提高检出灵敏性；最后，通过上游引物和上游探针的简化以及下游探针和荧光信号探针的简化，进一步降低了反应体系的复杂度，降低了体系中各个组分间的非特异性反应，提高各阶段反应的效率，由此提高检测灵敏性和稳定性。
所述新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包含4条引物、3条探针、反应液、酶液。
引物、探针序列如引物1-引物4、探针1-探针3：
针对S基因：引物1：SEQID NO.1；
引物2：SEQ ID NO.2；
针对C基因：引物3：CAGAGGTGAAGCGAAGTGCACA，SEQ ID NO.3；
引物4：SEQ ID NO.4；
针对S基因：探针1：FAM-GAG CAT(BHQ)CCTGCTGCTATGC，SEQ ID NO.5；
针对C基因：探针2：FAM-GAG CTT(BHQ)CTCATCTRCCGGACC，SEQ ID NO.6；
针对QS：探针3：VIC-AGG TAT(BHQ)CCTGCTGCTATGC，SEQ ID NO.7；QS:TGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCC，SEQ ID NO.8；
注：加粗(斜体)碱基为LNA修饰。
实施例2乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的灵敏度
本实施例应用实施例1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒检测了不同浓度的HBV DNA模板，用来验证本发明所述的检测方法的灵敏度。
反应条件：
50μL扩增体系包括：5μL 10×buffer，250μmol/L dNTP，500nmol/L PCR上下游引物(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)，250nmol/L探针(SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7)，3U TaqDNA聚合酶，40U Afu酶和20μL血浆提取HBV模板DNA。HBV模板浓度分别为：2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、20、2、0.5和0IU/ml(QS定量模板为103拷贝/μL)，加水补充至50μL。扩增反应程序：95℃，3min；95℃20s，67℃，30s，70℃，20s，预扩增5个循环；95℃，20s，63℃，1min，70℃，20s，扩增40个循环，每个循环结束读一次荧光信号。
结果示于图2中，结果显示该乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒能够区分检测低至0.5IU/ml的HBV样本DNA。
实施例3乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的定量限
本实施例应用实施例1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒检测了混合于人血清样本中的不同浓度HBV标准品模板，用来验证本发明所述的检测方法在检测模拟样本时定量限检测情况。
反应条件：
50μL扩增体系包括：5μL 10×buffer，250μmol/L dNTP，500nmol/L PCR上下游引物(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)，250nmol/L探针(SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7)，3U TaqDNA聚合酶，40U Afu酶和20μL血浆提取HBV标准品模板DNA。HBV标准品模板浓度分别为：2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、20和2IU/ml(QS定量模板为103拷贝/μL)，加水补充至50μL。扩增反应程序：95℃，3min；95℃20s，67℃，30s，70℃，20s，预扩增5个循环；95℃，20s，63℃，1min，70℃，20s，扩增40个循环，每个循环结束读一次荧光信号。
表1新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的定量限统计
结果示于表1中，结果显示2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、20和2IU/ml的实际值与理论值的对数值之差均小于0.5log，且线性相关数R为0.9991，说明在新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒能够准确检测低至2IU/mL的HBV病毒。
实施例4乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的检测限
本实施例应用实施例1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒检测了混合于人血清样本中的不同浓度HBV病毒模板(标准品样本)，用来验证本发明所述的检测方法的检测限。
反应条件：
50μL扩增体系包括：5μL 10×buffer，250μmol/L dNTP，500nmol/L PCR上下游引物(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)，250nmol/L探针(SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7)，3U TaqDNA聚合酶，40U Afu酶和20μL血浆提取HBV标准品模板DNA。HBV标准品模板浓度分别为：20、10、5、2和0IU/ml，QS定量模板为103拷贝/μL)，加水补充至50μL。扩增反应程序：95℃，3min；95℃20s，67℃，30s，70℃，20s，预扩增5个循环；95℃，20s，63℃，1min，70℃，20s，扩增40个循环，每个循环结束读一次荧光信号。
结果示于表2中，结果显示所述乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒能够检测低至1IU/mL的HBV病毒分子(96.0％检出)。
表2新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的检测限统计
浓度(IU/ml) 重复检测数 检测阳性数 检出百分数
4 25 25 100.0％
2 25 25 100.0％
1 25 24 96.0％
0.4 25 8 32.0％
0 25 0 0.0％
实施例5乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的精密度
本实施例应用实施例1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒检测了混合于人血清样本中的不同浓度HBV病毒模板(标准品样本)，用来验证本发明所述的检测方法的精密度。
反应条件：
50μL扩增体系包括：5μL 10×buffer，250μmol/L dNTP，500nmol/L PCR上下游引物(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)，250nmol/L探针(SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7)，3U TaqDNA聚合酶，40U Afu酶和20μL血浆提取HBV标准品模板DNA。HBV标准品模板浓度分别为：2×105IU/mL和2×103IU/mL(QS定量模板为103拷贝/μL)，加水补充至50μL，每个浓度检测10次。扩增反应程序：95℃，3min；95℃20s，67℃，30s，70℃，20s，预扩增5个循环；95℃，20s，63℃，1min，70℃，20s，扩增40个循环，每个循环结束读一次荧光信号。
结果示于表3中，结果显示该乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的精密度较为理想，各浓度精密度变异系数0.4％和4.8％，符合行业标准不大于5％的要求。
表3乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的精密度统计
实施例6
本实施例应用实施例1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒单独扩增S基因体系或者C基因体系，以证实S和C基因体系的优势。
反应条件：
50μL扩增体系包括：5μL 10×buffer，250μmol/L dNTP，500nmol/L PCR上下游引物(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)，250nmol/L探针(SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7)，3U TaqDNA聚合酶，40U Afu酶和20μL血浆提取HBV标准品模板DNA(103IU/mL)，加水补充至50μL。扩增反应程序：95℃，3min；95℃20s，67℃，30s，70℃，20s，预扩增5个循环；95℃，20s，63℃，1min，70℃，20s，扩增40个循环，每个循环结束读一次荧光信号，与双体系进行比较。
结果如图3所示，根据结果，单独S体系或者C体系检测的Ct值较S+C双体系检测Ct值高，说明双体系检测结果优于S体系或者C体系检测结果。
实施例7引物做LNA修饰的作用验证实验结果
本实施例通过对比有无LNA修饰及不同LNA修饰的引物检测不同浓度的HBV DNA模板，验证本发明中引物修饰LNA的作用和效果，进一步验证本发明所述检测方法的优势。
所用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒与实施例1相同，只是所用引物都未进行LNA修饰或LNA修饰位置有所不同，分别为靠近5’端、中间和靠近3’端进行修饰，四组引物修饰LNA情况如表4所示，将该四组不同修饰的引物用于实验验证对比，以验证本发明所使用的修饰引物的效果。
表4 LNA修饰引物情况
反应条件：50μL扩增体系包括：5μL 10×buffer，250μmol/L dNTP，500nmol/L PCR上下游引物((SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4，LNA修饰情况如表4所示)，250nmol/L探针(SEQID NO.5至SEQ ID NO.7)，3U Taq DNA聚合酶，40U Afu酶和20μL血浆提取HBV模板DNA。HBV模板浓度分别为：2×103、2×102、50、20、10、5和0IU/ml(QS定量模板为103拷贝/μL)，加水补充至50μL。扩增反应程序：95℃，3min；95℃20s，67℃，30s，70℃，20s，预扩增5个循环；95℃，20s，63℃，1min，70℃，20s，扩增40个循环，每个循环结束读一次荧光信号。结果参见图4。
根据图4的结果说明，在无LNA修饰引物的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂仅能够区分检测至20IU/ml的HBV样本DNA，而修饰了LNA的引物检测灵敏度均高于无LNA修饰引物组；LNA修饰数量相同的情况下，LNA引物1(靠近序列5’端修饰LNA)的检测体系可检测到10IU/ml的HBV样本DNA，而LNA引物2(靠近序列中间修饰LNA)和LNA引物3(序列3’端修饰LNA)的检测体系均可检测到5IU/ml的HBV样本DNA，但是LNA引物3(序列3’端修饰LNA)的检测体系存在一些背景(0IU/ml有弱的信号抬起)，这显示LNA引物2(本发明使用的LNA修饰引物)的检测体系具有更好的检测效果和作用，且该引物组组成的反应体系检测灵敏度最高可以达到0.5IU/ml的HBV样本DNA(见实施例2)，这表明LNA修饰引物可以在不增加检测背景的情况下使检测反应灵敏度提高40倍左右。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市宝创生物技术有限公司
<120> 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcaacatac cyygrtartc cagaagaacc aayaa 35
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtctgcggc gttttatcat mttcctytkc 30
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagaggtgaa gcgaagtgca ca 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggwctccccg yctgtkcc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcatcctg ctgctatgc 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagcttctca tctrccggac c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggtatcctg ctgctatgc 19
<210> 8
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc atcctgctgc tatgcctcat cttcttattg 60
gttcttctgg attatcaagg tatgttgcc 89

Claims (10)

1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括有针对S和/或C基因的引物和探针，所述引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述探针为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.7，且每条探针分别标记有荧光。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括有针对S基因的引物和探针，所述引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述探针为SEQ ID NO.5，和SEQ ID NO.7，且探针分别标记有荧光。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括有针对C基因的引物和探针，所述引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述探针为SEQ ID NO.6，且探针标记有荧光。
4.根据权利要求1-3任一所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，SEQID NO.1和SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.4，各序列中至少有一个碱基经过LNA碱基修饰。
5.根据权利要求4所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，SEQ IDNO.1从5’到3’的第20和第21个碱基经过LNA碱基修饰。
6.根据权利要求4所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，SEQ IDNO.2从5’到3’的第10和第11个碱基经过LNA碱基修饰。
7.根据权利要求4-7任一项所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.4从5’到3’的第9和第10个碱基经过LNA碱基修饰。
8.根据权利要求1-3任一所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，还包括有内定量参考品。
9.根据权利要求8所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述内定量参考品的碱基组成如SEQ ID NO.8所示。
10.根据权利要求1-3任一所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，还包括有扩增酶，所述扩增酶为Taq DNA聚合酶。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593886A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 中山大学达安基因股份有限公司 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN112029855A (zh) * 2020-08-05 2020-12-04 上海思路迪医学检验所有限公司 雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒
CN113789411A (zh) * 2020-10-29 2021-12-14 上海伯杰医疗科技有限公司 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642941A (zh) * 2013-12-12 2014-03-19 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种乙型肝炎病毒（hbv）核酸定量检测试剂盒
CN106801110A (zh) * 2017-04-13 2017-06-06 广州市宝创生物技术有限公司 高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN108342507A (zh) * 2017-03-05 2018-07-31 北京天健惠康生物科技有限公司 基于微液滴数字pcr技术的hbv核酸定量检测系统

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642941A (zh) * 2013-12-12 2014-03-19 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种乙型肝炎病毒（hbv）核酸定量检测试剂盒
CN108342507A (zh) * 2017-03-05 2018-07-31 北京天健惠康生物科技有限公司 基于微液滴数字pcr技术的hbv核酸定量检测系统
CN106801110A (zh) * 2017-04-13 2017-06-06 广州市宝创生物技术有限公司 高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREA MAST等: "《Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols》", 31 December 2006, HUMANA PRESS INC. *
LATORRA D等: "Design considerations and effects of LNA in PCR primers", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *
MATSUURA,K.等: "Hepatitis B virus S gene, partial cds, isolate: Aichi7-S-2011", 《GENBANK》 *
MATSUURA,K.等: "Hepatitis B virus S gene, partial cds, isolate: R25", 《GENBANK》 *
周国华主编: "《SNP检测技术与个体化药物治疗》", 28 February 2015, 苏州大学出版社 *
郑梦琳等: "实时荧光聚合酶链式反应偶联高特异性核酸侵入反应检测单核苷酸多态性", 《分析化学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593886A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 中山大学达安基因股份有限公司 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN112029855A (zh) * 2020-08-05 2020-12-04 上海思路迪医学检验所有限公司 雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒
CN112029855B (zh) * 2020-08-05 2024-05-17 上海思路迪医学检验所有限公司 雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒
CN113789411A (zh) * 2020-10-29 2021-12-14 上海伯杰医疗科技有限公司 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法

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