CN113789411A - 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法，包括甲/乙型流感病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。其中，甲乙流病毒反应液中含有多条不同荧光标记的探针、引物、酶混合物、增强剂、冻干保护剂、10xbuffer、核苷酸混合物等，可以在同一反应体系中检测是否感染甲型、乙型流感病毒。通过内源性内参对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对甲型、乙型流感病毒在核酸水平上的检测。

Description

一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及甲型、乙型流感病毒检测技术领域，尤指一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，春冬季节高发，传播迅速，发病率高，流行期短，易引起暴发流行或大流行，控制难度较大。流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。由于这些病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状对病原进行区分非常不可靠，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。
目前国内应用荧光PCR技术进行甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸检测的试剂盒主要为单重核酸检测试剂盒及甲/乙流通用检测试剂盒。这些试剂盒或是不能同时检测甲型流感病毒和乙型流感病毒；或是无法区分甲型流感和乙型流感，且操作时间较长，操作繁琐。而实际临床使用及疾病预防控制系统在追踪和分析病原体时常常要区分病原体种类和型别。
因此，亟需一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、检测时间短的甲型流感病毒、乙型流感病毒检测方法。
发明内容
本发明提供一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法，解决现有的甲型流感病毒、乙型流感病毒检测不够便捷且难以对结果准确性进行评估的问题。
本发明提供的技术方案如下：一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括甲/乙型流感病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
优选地，所述甲/乙型流感病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10×Buffer、增强剂、冻干保护剂、甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针。
优选地，所述阳性对照液为甲/乙型病毒病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
优选地，所述甲型流感病毒上游引物的序列为：
CTCATGGAATGGCTAAAGACAAG；
所述甲型流感病毒下游引物的序列为TCCTCGCTCACTGGGCA；
所述甲型流感病毒探针的序列为：
CCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTT；
和/或；
所述乙型流感病毒上游引物的序列为：
CACCAGAAGAGGGAGACAATTAG；
所述乙型流感病毒下游引物的序列为：
GTCAGCTATTATGGAGCTGTTAGC；
所述乙型流感病毒探针的序列为：
GGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAA。
优选地，所述甲型流感病毒上游引物序列中的第13位碱基C为锁核酸修饰碱；
所述甲型流感病毒下游引物序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱基；
所述甲型流感病毒探针序列中的第9为碱基G为修饰荧光基团，第23位碱基A修饰淬灭基团，第32位A碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述乙型流感病毒上游引物序列中的第15位碱基G为锁核酸修饰碱基；
所述乙型流感病毒下游引物序列中的第17位碱基C为锁核酸修饰碱基；
所述乙型流感病毒探针序列中的8位G为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第31位碱基A修饰淬灭基团。
优选地，所述甲型流感病毒与所述乙型流感病毒探针中的G碱基修饰的荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种；
所述甲型流感病毒探针中的A碱基修饰的荧光淬灭基团以及所述乙型流感病毒探针中的C碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种；
其中，所述甲型流感病毒探针中的荧光基团与所述乙型流感病毒中修饰的荧光基团不同，修饰的淬灭基团不同。
优选地，所述内参上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG；
所述内参下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；
所述内参探针的序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG，其中，第5位碱基G修饰荧光基团，第20位碱基C修饰为淬灭基团，第23位碱基G为磷酸化碱基。
优选地，所述甲/乙型流感病毒反应液中所包含的酶混合物如下：
UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；和/或；
所述甲/乙型流感病毒反应液中的所包含的增强剂组合如下如下，MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.1-1.0g/L，氯化四甲氨0.1-0.5，叠氮钠0.05-0.1g/L；
和/或；
所述甲/乙型流感病毒反应液中的所包含的冻干保护剂组合如下如下，BSA0.6-1.2g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；
和/或；
所述反应液中所包含的10xBuffe包括Tris-HCl10-50mM，KCl100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
和/或；
所述反应液中所包含的核苷酸混合液包括dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
本发明还公开了一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，使用上述所述所述的试剂盒，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有甲/乙型流感病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各30μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S300得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、结合内参检测结果判断样本检测结果。
具体判断如下：
Figure BDA0003294210930000041
Figure BDA0003294210930000051
优选地，所述步骤S300中的甲型、乙型流感病毒反应液包含了荧光PCR扩增所需的全部组分。
优选地，所述步骤S400中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
Figure BDA0003294210930000052
与现有技术相比，本发明提供的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法具有以下有益效果：
1、本发明的试剂盒包括甲型、乙型流感病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。组分简单，试剂盒仅含有3部分；使用方便，反应程序快速简单，仅需30min即可完成扩增，加上提取10min，从获得样本到得到检测结果，40min内即可完成全部检测。
2、本发明的引物探针中含有多条不同修饰方式、不同荧光标记的探针、引物，引物中个别碱基通过锁核酸的修饰，即将核糖的2′-O位和4′-C位通过特定的的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性，降低与互补碱基的结合自由能，从而稳定互补结构。通过该技术，人为调整引物探针结合自由能分布使得结合自由能呈正弦分布，不仅提高引物与模板结合的稳定性，同时大大提高了特异性。本发明中的探针有多种修饰方式，多种修饰的目的在于尽可能降低探针自身的本底信号值，提高检测的灵敏度。
3、本发明的甲/乙型流感病毒反应液中的酶混合液含有逆转录酶，Tth DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Taq酶，Vent酶扩增效率明显高于Taq酶，有利于在扩增初始阶段快速累积PCR产物，并在此基础上有Taq酶进一步发挥Taqman探针切割作用，给出扩增信号，从而提高反应灵敏度，Tth DNA聚合酶兼有逆转录酶和DNA聚合酶的活性，且热稳定性好，Tth酶因高温变性而失活，且本反应体系含有Mn2+离子，Tth酶在延伸过程中可继续进行逆转录，从而在扩增过程中适当引入逆转录，充分利用RNA模板，从而提高逆转录和扩增效率。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测甲/乙型流感病毒的灵敏度得到显著提升。
4、本发明的甲/乙型流感病毒反应液中的增强剂含有MnCl2 1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.1-1.0g/L，氯化四甲氨0.1-0.5，叠氮钠0.05-0.1g/L。其中，MnCl2和氯化四甲氨有助于提高扩增效率，SSB单链结合蛋白有助于稳定单链结构，焦磷酸酶有助于消除PCR过程生成的焦磷酸，从而提高PCR的持续性，增强PCR的持续性。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测甲/乙型流感病毒的信号值及灵敏度得到显著提升。
5、本发明的甲/乙型流感病毒反应液中含有冻干保护剂，其成为含有BSA0.6-1.2g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L。其中，BSA和明胶有助于提高酶热稳定性和冻融稳定性，增强PCR的持续性，精氨酸，山梨糖醇，葡聚糖和海藻糖有助于提高酶的冻融稳定性和构象。
6、本发明的甲/乙型流感病毒反应液为预分装冻干八连管，开封后可直接加入提取好的核酸进行上机检测。省事，省时，省力，由于加入核酸体积量大，故灵敏度高。
7、本发明试剂盒为内源性内参，可对对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对甲/乙型流感病毒在核酸水平上的检测。
8、本发明通过酶混合物和增强剂组合，使得试剂盒灵敏度显著提高，各靶标灵敏度均可达80copies/mL，且检测时间大大缩短，整个检测过程仅需30分钟；通过冻干保护剂，使得试剂盒热稳定性显著增加，可于37℃稳定储存1个月，从而减少对低温运输和储存的依赖。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及其使用方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1为为甲型、乙型流感病毒检测结果效果图；
图2为不同浓度UNG酶检测含甲流dUTP产物的对比图；
图3为不同浓度UNG酶检测含乙流dUTP产物的对比图；
图4为不同DNA聚合酶组合方式检测甲流阳性样本的对比效果图；
图5为不同DNA聚合酶组合方式检测乙流阳性样本的对比效果图；
图6甲型流感病毒不同引物探针的修饰方法组合效果图；
图7乙型流感病毒不同引物探针的修饰方法组合效果图；
图8甲/乙型流感病毒反应液是否含有增强剂的对比效果图；
图9预分装在八连管中的冻干甲/乙型流感病毒反应液37℃保存30天与正常冻存于-20℃条件保存的冻干粉的检测效果对比图；
图10甲型流感病毒(HIN1和H3N2)检测限检测结果图；
图11乙型流感病毒(Victoria型和Yamagata型)检测限检测结果图。
具体实施方式
本发明提供一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，包括甲/乙型流感病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
其中，甲/乙型流感病毒混合反应液包括甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针。
甲/乙型流感病毒混合反应液还包括酶混合物、核苷酸混合物，10xBuffer、增强剂、冻干保护剂和DEPC水。
酶混合物包括UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；。
增强剂包括如下组分：MnCl2 1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L。
冻干保护剂包括如下组分：BSA 0.8g/L，明胶1％，山梨醇糖1％，精氨酸1.0g/L，葡聚糖1.0g/L，海藻糖1.0g/L；
10xBuffer如下，Tris-HCl10-50mM，KCl 100-1000mM，Mg2SO4 20-80mM；
核苷酸混合液如下，dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
具体实施时，甲/乙流反应液的具体配方具体如表1所示：
Figure BDA0003294210930000081
Figure BDA0003294210930000091
表1
其中，阳性对照液为甲/乙型病毒病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒的混合液，阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
其中，甲型流感病毒上游引物的序列为CTCATGGAATGGCTAAAGACAAG，其中，序列中的第13位碱基C为锁核酸修饰碱；甲型流感病毒下游引物的序列为TCCTCGCTCACTGGGCA，其中，序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱基；甲型流感病毒探针的序列为CCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTT，其中，序列中的第9为碱基G为修饰荧光基团，第23位碱基A修饰淬灭基团，第32位A碱基为磷酸化碱基；乙型流感病毒上游引物的序列为CACCAGAAGAGGGAGACAATTAG，其中，序列中的第15位碱基G为锁核酸修饰碱基；乙型流感病毒下游引物的序列为GTCAGCTATTATGGAGCTGTTAGC，其中，序列中的第17位碱基C为锁核酸修饰碱基；乙型流感病毒探针的序列为GGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAA，其中，序列中的8位G为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第31位碱基A修饰淬灭基团；甲流探针的G碱基标记的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种，并且A碱基修饰一种荧光淬灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。乙流探针的序列为GGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAA，乙流探针的G碱基标记的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种，并且C碱基修饰一种荧光淬灭基团，与甲流探针修饰荧光基团不同，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种，与甲流探针修饰淬灭基团不同。
内参上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG，内参下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT，内参探针序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。其中，内参探针序列中第5位碱基G修饰荧光基团，第20位碱基C修饰为淬灭基团，第23位碱基G为磷酸化碱基。
内参引物的TM值在55-60℃之间，GC含量在30-80％，两条引物的TM值差异小于5℃；扩增长度50-150bp之间；引物3’末端自身错配小于3bp；引物在非靶标序列中，无特异结合位点，或特异结合区域大于1000bp。探针的TM值在60-70℃之间，GC含量在30-80％；探针的5’端第一个碱基不能为G；探针无大于3bp的发夹结构。
本实施例的内参是对产品本身内参的检测，本实施例的内参会参与核酸提取到RT-PCR的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程和扩增过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现，而现有的甲乙型流感病毒检测试剂中的内参为外源的含有内参基因片段的慢病毒，不参与提取，只参与扩增，这样只能指示扩增的结果是否正常，完全不能避免样品采集，保存运输和核酸提取过程有误而导致的阴性结果的出现。
本发明还提供一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有甲/乙型流感病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各30μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S300得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、结合内参检测结果判断样本检测结果。
具体的判断过程如下表2：
Figure BDA0003294210930000111
表2
具体实施时，步骤S300中的甲/乙型流感病毒反应液为预分装冻干粉。
步骤S400中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下表3：
Figure BDA0003294210930000121
表3
在同一反应体系中加入多条不同荧光标记的探针和引物，可在同一反应体系中检测是否存在甲型流感病毒和乙型流感病毒。探针为包括报告基团和淬灭基团的寡核苷酸，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对甲型流感病毒和乙型流感病毒在核酸水平上的检测。
PCR反应过程中，若待检样本包含甲型流感病毒，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含乙型流感病毒，则标记VIC的探针产生荧光信号。另外，每个反应中含有内参基因，则标记的ROX的探针应产生荧光信号。。
实施例2
将1例甲型流感病毒阳性样本和1例乙流阳性样本样本用本试剂盒进行检测，结果如图1所示，2例样本均为对应通道的阳性，表明本发明可有效检测甲型和乙型流感病毒样本，并能正确分型。
实施例3
体系中加入不同浓度的UNG酶：浓度1(4.0U//μL)、浓度2(6.0U//μL)、最佳浓度(5.0U/μL)，以1×104copies/mL的含dU的产物为模板进行扩增，结果显示，最佳浓度UNG酶无扩增曲线，表明5U/μL的UNG酶能够消除不高于1×104copies/mL的产物的污染，起到防污染的效果，检测结果如图2-3所示。
实施例4
设置4种不同的DNA聚合酶组合方式，分别为体系中加入Taq酶+Tth酶(组合1)、Taq酶+Vent酶+Tth酶(组合2)、Taq酶+Vent酶(组合3)、仅含Taq酶(组合4)4种组合，对比检测甲/乙型流感阳性样本，对比检测结果如图4-5所示。从图4-5中可知，体系中同时加入Taq酶、Vent酶和Tth酶时，反应体系扩增效果最佳。
实施例5
设置3种不同引物探针的修饰方法组合，进行对比评价，以甲型流感病毒引物探针的修饰组合为例进行案例实施，修饰组合方法见下表4。
Figure BDA0003294210930000131
表4
3种修饰组合对比来看，修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于其他修饰方法，以甲型流感病毒引物探针的不同修饰方式下的检测结果如图6-7所示。
由图6-7可知，本申请的修饰方法极大改善了体系扩增的效率问题，提升检测灵敏度和信号值。
设置3种不同引物探针的修饰方法组合，进行对比评价，以乙型流感病毒引物探针的修饰组合为例进行案例实施，修饰组合方法见下表5。
Figure BDA0003294210930000141
表5
3种修饰组合对比来看，修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于其他修饰方法，以乙型流感病毒引物探针的不同修饰方式下的检测结果如图5所示。
由图5可知，本申请的修饰方法极大改善了体系扩增的效率问题，提升检测灵敏度和信号值。
实施例6
本实施例中含有增强剂，具有增强甲/乙型流感病毒反应液稳定性的效果，同时也可显著提高灵敏度及信号值。具体实施步骤如图8所示，实施方案中去除增强剂和加入增强剂的对比效果图，可明显看到无论高浓度样本还是低浓度样本，增强剂均有显著提升效果。
实施例7
本申请专利中甲/乙型流感病毒反应液为预分装在冻干八连管中的冻干粉，具有操作简便，上样量大的效果，稳定性更强，置于37℃条件下可稳定保存30天。具体实施步骤如图9所示，实施方案中将预分装在冻干八连管中的冻干粉置于37℃条件下储存30天，与正常冻存于-20℃条件保存的冻干粉的检测效果对比。可以明显观察到同浓度之间曲线差异很小，表面冻干粉37℃保存30天储存性能良好。
实施例8
特异性验证(交叉反应)：本发明检测其他病原体的特异性检测效果如下表6。检测其他常见病原体均为阴性，甲型和乙型流感病毒为阳性。
Figure BDA0003294210930000151
Figure BDA0003294210930000161
表6
实施例9
特异性验证(抗干扰)：试剂盒检测对照组和分别加入不同干扰物质进行检测，对于甲型和乙型流感病毒样本，加入干扰物质(如表7所示)与对照组(不加干扰物质)的对比检测结果见下表8-9。试验结果显示：阳性对照、阴性对照扩增正常，试验组和对照组CT无显著差异。内源性干扰物质(血红蛋白、黏蛋白、白细胞、人基因组核酸)和外源性干扰物质(肾上腺素、薄荷脑、莫匹罗星、妥布霉素、扎那米韦)在研究的浓度范围内对本反应体系的检测结果均无干扰。
甲型和乙型流感病毒干扰物质
Figure BDA0003294210930000171
表7
Figure BDA0003294210930000172
表8甲型流感病毒干扰物质研究实验数据
Figure BDA0003294210930000181
表9乙型流感病毒干扰物质研究实验数据
实施例10
检测限验证：试剂盒检测甲型流感病毒(HIN1和H3N2)和乙型流感病毒(Victoria型和Yamagata型)，各型别在80copies/mL分别重复检测20次，检测结果如图10-11所示。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括甲/乙型流感病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
2.根据权利要求1所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述甲/乙型流感病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10×Buffer、增强剂、冻干保护剂、甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针。
3.根据权利要求1-2任一所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为甲/乙型病毒病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
4.根据权利要求3所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述甲型流感病毒上游引物的序列为：
CTCATGGAATGGCTAAAGACAAG；
所述甲型流感病毒下游引物的序列为TCCTCGCTCACTGGGCA；
所述甲型流感病毒探针的序列为：
CCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTT；
和/或；
所述乙型流感病毒上游引物的序列为：
CACCAGAAGAGGGAGACAATTAG；
所述乙型流感病毒下游引物的序列为：
GTCAGCTATTATGGAGCTGTTAGC；
所述乙型流感病毒探针的序列为：
GGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAA。
5.根据权利要求4所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述甲型流感病毒上游引物序列中的第13位碱基C为锁核酸修饰碱；
所述甲型流感病毒下游引物序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱基；
所述甲型流感病毒探针序列中的第9为碱基G为修饰荧光基团，第23位碱基A修饰淬灭基团，第32位A碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述乙型流感病毒上游引物序列中的第15位碱基G为锁核酸修饰碱基；
所述乙型流感病毒下游引物序列中的第17位碱基C为锁核酸修饰碱基；
所述乙型流感病毒探针序列中的8位G为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第31位碱基A修饰淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述甲型流感病毒与所述乙型流感病毒探针中的G碱基修饰的荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种；
所述甲型流感病毒探针中的A碱基修饰的荧光淬灭基团以及所述乙型流感病毒探针中的C碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种；
其中，所述甲型流感病毒探针中的荧光基团与所述乙型流感病毒中修饰的荧光基团不同，修饰的淬灭基团不同。
7.根据权利要求6所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述内参上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG；
所述内参下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；
所述内参探针的序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG，其中，第5位碱基G修饰荧光基团，第20位碱基C修饰为淬灭基团，第23位碱基G为磷酸化碱基。
8.根据权利要求2所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述甲/乙型流感病毒反应液中所包含的酶混合物如下：UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；
和/或；
所述甲/乙型流感病毒反应液中的所包含的增强剂组合如下如下，MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.1-1.0g/L，氯化四甲氨0.1-0.5，叠氮钠0.05-0.1g/L；
和/或；
所述甲/乙型流感病毒反应液中的所包含的冻干保护剂组合如下如下，BSA0.6-1.2g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；
和/或；
所述反应液中所包含的10xBuffe包括Tris-HCl10-50mM，KCl100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
和/或；
所述反应液中所包含的核苷酸混合液包括dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
9.一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于，使用权利要求1-8任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有甲/乙型流感病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各25μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S300得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、结合内参检测结果判断样本检测结果。
10.根据权利要求9所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于：所述步骤S300中的甲型、乙型流感病毒反应液包含了荧光PCR扩增所需的全部组分。
11.根据权利要求10所述的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于，所述步骤S400中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
Figure FDA0003294210920000041
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024045461A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一管式RT-qPCR全预混反应试剂、应用及RT-qPCR方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176109A (zh) * 2020-10-29 2021-01-05 上海伯杰医疗科技有限公司 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108411036A (zh) * 2017-03-03 2018-08-17 绍兴迅敏康生物科技有限公司 一种快速检测甲、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及方法
CN108977586A (zh) * 2018-09-11 2018-12-11 广州市宝创生物技术有限公司 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN112048545A (zh) * 2020-09-10 2020-12-08 上海创宏生物科技有限公司 一种冻干保护剂、pcr扩增试剂及其冻干方法和应用
CN112176109A (zh) * 2020-10-29 2021-01-05 上海伯杰医疗科技有限公司 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275862B (zh) * 2013-04-25 2014-10-01 浙江大学 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒
CN109517927A (zh) * 2018-09-03 2019-03-26 连云港出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
CN110172529A (zh) * 2019-05-21 2019-08-27 上海星耀医学科技发展有限公司 一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法
CN111411172A (zh) * 2020-02-28 2020-07-14 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物
CN111349721B (zh) * 2020-03-19 2022-10-04 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108411036A (zh) * 2017-03-03 2018-08-17 绍兴迅敏康生物科技有限公司 一种快速检测甲、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及方法
CN108977586A (zh) * 2018-09-11 2018-12-11 广州市宝创生物技术有限公司 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN112048545A (zh) * 2020-09-10 2020-12-08 上海创宏生物科技有限公司 一种冻干保护剂、pcr扩增试剂及其冻干方法和应用
CN112176109A (zh) * 2020-10-29 2021-01-05 上海伯杰医疗科技有限公司 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAMAN MURADRASOLI等: "Broadly targeted triplex real-time PCR detection of influenza A, B and C viruses based on the nucleoprotein gene and a novel "MegaBeacon" probe strategy", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
叶维萍等: "长PCR技术及其在动物学研究中的应用", 《动物学杂志》 *
范玉明等主编: "《毒理学 安全性评价标准操作规程指南（下册）》", 31 May 2009, 电子科技大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024045461A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一管式RT-qPCR全预混反应试剂、应用及RT-qPCR方法

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