CN114480741A - 一种寡聚核苷酸混合物、荧光rt-pcr检测试剂及应用 - Google Patents
一种寡聚核苷酸混合物、荧光rt-pcr检测试剂及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种寡聚核苷酸混合物、荧光RT‑PCR检测试剂及应用。该寡聚核苷酸混合物含有以下寡聚核苷酸组合A、B、C中的一个或多个：寡聚核苷酸组合A，由三条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.1、2、3；寡聚核苷酸组合B，由三条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.4、5、6；寡聚核苷酸组合C，由四条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.7、8、9、10。本发明所述的寡聚核苷酸混合物是基于最新的HPIV1‑3核酸序列信息设计以及基于特定的筛选原则筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物检测技术，具体涉及一种寡聚核苷酸混合物、荧光RT-PCR检测试剂及应用。
背景技术
人副流感病毒(Human parainfluenza viruses，HPIVs)是引起上呼吸道感染(如普通感冒和喉咙痛)最常见的病原体之一(其它还有鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等)，也能造成反复的下呼吸道疾病(如肺炎、支气管炎和细支气管炎)，人群普遍易感，特别是儿童、老人和有免疫缺陷人群。据统计，大约1/3的婴幼儿急性呼吸道感染都是由HPIVs引起的。HPIVs能通过接触传染性污染物或吸入污染物的飞沫而传播，由人的眼睛、口腔或鼻腔等部位进入人体，引起感染。
HPIVs属于副粘病毒科(Paramyxoviridae family)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae subfamily)，根据遗传性与抗原性分为四种血清型，即1-4型(HPIV1-4)，其中HPIV1和HPIV3属于呼吸道病毒属(Respirovirus genus)，而PIV2和PIV4属于腮腺炎病毒属(Rubulavirus genus)。
HPIV粒子有包膜，直径150-300nm，基因组由不分节段的单股负链RNA组成，长约15000个核苷酸，编码6种结构蛋白(3’-N-P-C-M-F-HN-L-5’)。包膜内为核衣壳，由病毒RNA、N蛋白、P蛋白和L蛋白组成。包膜上有两种刺突，分别是HN蛋白和F蛋白，各血清型的抗原特征主要由HN蛋白区分。
各血清型有不同的临床和流行病学特点。HPIV1和HPIV2能造成上、下呼吸道感染，引起假膜性喉炎、气管炎或支气管炎等疾病，其中HPIV1是儿童喉气管支气管炎的主要原因，HPIV2次之；HPIV3是引起婴儿支气管炎和肺炎的主要病原体之一(仅次于呼吸道合胞病毒)，也可导致假膜性喉炎，在1岁以下儿童中症状最严重；HPIV4一般引起轻微的上呼吸道疾病，重症报道较少。HPIV1-3引起呼吸道疾病的报道都比较常见，其中HPIV1一般为隔年发生一次较大的交替流行，各地都可发病。据报道，5岁及以上儿童有90％以上有抗HPIV3的抗体，约75％有抗HPIV1和HPIV2的抗体。所以在医疗卫生领域，对HPIV1-3的诊断和监测最为重要。
HPIVs的体外检测通常是通过对样本中的HPIVs进行分离培养、免疫检测和核酸检测等方法实现。分离培养虽为“金标准”，但操作复杂、耗时长、灵敏度不稳定；免疫检测则特异性差、敏感性低。以荧光RT-PCR技术为代表的核酸检测法因其准确、灵敏、快速等特点，已被越来越多地应用于辅助诊断呼吸道病毒感染相关疾病，是目前HPIVs主要确诊方法。但是，随着新发表的HPIVs核酸序列不断增加，经过序列比对分析可见，现有HPIVs荧光RT-PCR检测试剂的引物探针序列存在不同程度的错配，具有较大的漏检风险。
发明内容
本发明的目的是：提供一种寡聚核苷酸混合物和荧光RT-PCR检测试剂，可用于更准确检测样本中的HPIVs。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
1.引物、探针的设计方案
本发明根据GenBank最新的核酸信息设计并筛选出三组寡聚核苷酸分别作为HPIV1、HPIV2和HPIV3的特异性引物探针组合，用于本发明提供的荧光RT-PCR检测试剂中。本发明所用的寡聚核苷酸序列如表1所示，其中：
检测HPIV1的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.3，即寡聚核苷酸组合A；
检测HPIV2的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID No.4、SEQID No.5和SEQ ID No.6，即寡聚核苷酸组合B；
检测HPIV3的正向引物的核苷酸序列为SEQ ID No.7，反向引物1和2的核苷酸序列为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(两条反向引物是针对所在位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用)，探针的核苷酸序列为SEQ ID No.10，即寡聚核苷酸组合C。
本发明所述的荧光RT-PCR检测试剂可以以HPIV1、HPIV2和HPIV3中的一个或多个作为检测对象并选用相应的引物探针组合，优选同时以HPIV1、HPIV2和HPIV3作为检测对象。
所述荧光RT-PCR检测试剂中还可添加人RNase P的特异性引物探针，作为检测的内标，用于监测采样质量和核酸提取效果。
上述人RNase P的特异性引物探针中的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。
上述的检测HPIV1、HPIV2、HPIV3及人RNase P的引物和探针序列在各自的检测对象的已知核酸序列中高度保守，且对非目标检测对象具有排他性，因而能有效防止漏检(假阴性)和错检(假阳性)。
上述的检测HPIV1、HPIV2、HPIV3及人RNase P的探针的5’端用荧光报告基团修饰，3’端用荧光淬灭基团修饰。荧光报告基团可从FAM、JOE、HEX、VIC、NED、TET、ROX、Cy5中选择；HPIV1和HPIV2的探针的荧光淬灭基团为MGB，HPIV3和人RNase P的探针的荧光淬灭基团可从BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中选择。
若对HPIV1-3进行通用型检测，则HPIV1、HPIV2和HPIV3的探针用相同通道的荧光报告基团修饰；若对HPIV1、HPIV2和HPIV3进行分型检测，则HPIV1、HPIV2和HPIV3的探针用不同通道的荧光报告基团修饰。作为优选，HPIV1、HPIV2和HPIV3的探针的荧光报告基团均选用FAM，HPIV3的荧光淬灭基团选用BHQ1；人RNase P的探针的荧光报告基团选用VIC，荧光淬灭基团选用BHQ1。
表1.本发明涉及的寡聚核苷酸序列
| 编号 | 核苷酸序列(5’-3’) |
| SEQ ID No.1 | ATCACTCAAGGATGTGCAGATATAGG |
| SEQ ID No.2 | TACCGGGTTTAAATCAGGATACATATC |
| SEQ ID No.3 | CATATCAGGTTTTACAATTAGGTTAC |
| SEQ ID No.4 | TCGATTTGCTGGAGCCTTTCT |
| SEQ ID No.5 | TGCTTTGTGATTGGTGTTGTTGA |
| SEQ ID No.6 | AAATGAGTCCAACCGAAC |
| SEQ ID No.7 | AGGTCTTGAACATCCAATAAATGAGAAT |
| SEQ ID No.8 | TTCTATCTGAAAACCATGGACTATGAGA |
| SEQ ID No.9 | CTGTCTGAAAACCATGGACTATGAGA |
| SEQ ID No.10 | ACACAACTGGGTGTCCTGGGAAAACACAG |
| SEQ ID No.11 | CTGCGAGCGGGTTCTGAC |
| SEQ ID No.12 | AACGATATGATTGATAGCAACAACTGA |
| SEQ ID No.13 | AAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGA |
2.反应体系
本发明提供一种荧光RT-PCR检测试剂，其成分包含了除核酸模板外的所有荧光RT-PCR反应组分(见表2)，反应体积为25μl，可配成2×(即12.5μl/反应)的预混液保存于-20℃，使用时加水和待测样本核酸至25μl的反应体积即可上机检测。试剂的反应体积可按比例在5μl-100μl范围内扩大或缩小。
作为优选，可以在所述荧光RT-PCR检测试剂中加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和dUTP(见表2)以防止PCR产物污染可能造成的假阳性结果，进一步保证检测的准确性。其原理是：在PCR反应体系中加入dUTP可产生含dU的PCR产物，含dU的PCR产物气溶胶污染物在下次PCR反应前被试剂中的UDG降解，从而消除PCR产物气溶胶污染对检测结果的影响。
表2.荧光RT-PCR检测试剂成分
| 成分 | 每反应含量 | 每反应优选含量 |
| 200mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0) | 2.5μl | 2.5μl |
| 氯化钾 | 1-2μmol | 1.55μmol |
| 氯化镁 | 0.03-0.1μmol | 0.075μmol |
| dATP、dTTP、dCTP、dGTP | 3-6pmol | 5pmol |
| UDG | 0.1U-1U | 0.25U |
| dUTP | 3-12pmol | 10pmol |
| DNA聚合酶 | 1-5U | 2U |
| 逆转录酶 | 150-400U | 200U |
| HPIV1正向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| HPIV1反向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| HPIV1探针 | 1-10×10<sup>-12</sup>mol | 5×10<sup>-12</sup>mol |
| HPIV2正向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| HPIV2反向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| HPIV2探针 | 1-10×10<sup>-12</sup>mol | 5×10<sup>-12</sup>mol |
| HPIV3正向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| HPIV3反向引物1 | 0.25-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 5×10<sup>-12</sup>mol |
| HPIV3反向引物2 | 0.25-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 5×10<sup>-12</sup>mol |
| HPIV3探针 | 1-10×10<sup>-12</sup>mol | 5×10<sup>-12</sup>mol |
| 人RNaseP正向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| 人RNaseP反向引物 | 0.5-1.5×10<sup>-11</sup>mol | 1×10<sup>-11</sup>mol |
| 人RNaseP探针 | 1-10×10<sup>-12</sup>mol | 5×10<sup>-12</sup>mol |
| 冻干赋形剂<sup>*</sup> | 1.5-4mg | 2.25mg |
*冻干赋形剂仅在冻干试剂时添加
3.冻干型试剂的制备
本发明通过真空冷冻干燥工艺将荧光RT-PCR检测试剂制成常温下稳定的冻干型试剂，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。
本发明所述冻干型荧光RT-PCR检测试剂是由表2的成分冻干而成，可将试剂按1份或多份冻干在容器中，优选地，可按1份/管冻干在可直接上机的PCR管或多连管中。为确保冻干成功，表2中的成分均不含甘油。冻干所得的冻干型荧光RT-PCR检测试剂为白色颗粒，可在遮光、防潮条件下常温保存12个月。单份试剂所含干物质的体积约为2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测样本核酸即可配成25μl的反应体系。作为优选，在样本核酸提取的最后洗脱步骤中，适当增加洗脱液的量(如100μl)即可得到合适浓度的样本核酸，该样本核酸可直接取23μl加至单份冻干试剂中。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡使试剂溶解，短暂离心后即可上机检测。
4.反应程序及结果判定
本发明所述荧光RT-PCR检测试剂的反应程序按表3设置，荧光信号根据检测目标的探针的荧光报告基团设置。
表3.荧光RT-PCR检测试剂的反应程序
*UDG消化步骤仅用于已添加UDG和dUTP的试剂
反应后，阴性对照品(无核酸酶水)的Ct≥40或无Ct，阳性对照的Ct≤35且样本中RNase P内标(试剂中含RNase P内对照时)的Ct＜40，则检测有效。否则结果无效，须排除错误因素后重检。在检测有效的前提下，则检测结果根据以下条件进行判定：
a)检测样品Ct≤35，可报告为所检对象阳性；
b)检测样品35＜Ct＜40，报告为所检对象疑似阳性，需重复实验或通过独立方法进行确定；
c)检测样品Ct≥40或无Ct，则报告为所检对象阴性。
本发明的有益效果：
本发明所述的寡聚核苷酸混合物是基于最新的HPIV1-3核酸序列信息设计以及基于特定的筛选原则筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性。含有上述寡聚核苷酸混合物的荧光RT-PCR检测试剂可加入UDG和dUTP以防止PCR产物污染可能造成的假阳性结果，进一步保证检测的准确性。
现有荧光RT-PCR检测试剂均为液体试剂，需要在-20℃以下保存才能保持检测活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能，特别是在长途运输时试剂失效的风险及冷链管理成本均大大增加，不能适应国际长途运输及冷链条件较差的基层检测机构的应用。为此，本发明所述荧光RT-PCR检测试剂可通过冷冻干燥技术制成冻干型试剂，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，适应长途运输和冷链条件差的地区的使用需要。
附图说明
图1显示本发明所述的HPIV1检测目标核酸序列和近缘病毒的核酸序列的比较(差异位点用实线框显示)以及HPIV1引物和探针的位置。
图2显示本发明所述的HPIV2检测目标核酸序列以及特异性引物和探针的位置。
图3显示本发明所述的HPIV3检测目标核酸序列和近缘病毒的核酸序列的比较(差异位点用实线框显示)以及HPIV3引物和探针的位置。
图4显示本发明所述的人RNase P检测目标核酸序列以及特异性引物和探针的位置。
图5显示冻干于PCR八连管中的荧光RT-PCR检测试剂的形态。
图6显示本发明所述的冻干型荧光RT-PCR检测试剂对HPIV1-3和RNase P核酸阳性参考品的检测结果及重复性。
图7显示本发明所述的冻干型荧光RT-PCR检测试剂对HPIV1-3核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。
图8显示本发明所述的冻干型荧光RT-PCR检测试剂对人RNase P核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。
具体实施方式
以下实施例仅为对本发明的进一步说明，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1：本实施例提供一种用于检测HPIV1-3和人RNase P核酸的荧光RT-PCR引物及探针的设计方案。
本发明所涉及的引物和探针按以下原则进行设计和筛选：
(1)引物和探针的位置选择在检测对象基因组的保守序列区域，以减少漏检(假阴性)，而该区域必须对其它生物具有排他性，以避免假阳性(非特异扩增)。
(2)探针的5’端距离其上游的引物不超过30bp，最好不超过10bp，以保证Taq DNA聚合酶对探针进行高效的切割从而产生荧光信号。
(3)GC含量30-80％；引物的Tm值约58-60℃，探针的Tm值约68-70℃。正、反向引物间的Tm差别应尽量小，以有利于两条引物的同时退火；探针的Tm应比引物高足够多(8℃以上)以保证探针早于引物完成退火。
(4)引物和探针的发夹结构自由能dG≥-1.0，自身及二聚体自由能dG≥-6.0，优选dG≥-3.6，以保证不会形成阻碍PCR的二级结构。
(5)扩增片段长度50-150bp，较短的扩增子有利于提高PCR反应效率。
(6)探针的5’端的第1和第2个核苷酸避免使用G以提高荧光信号，因为靠近5’端的G有荧光淬灭作用。
(7)避免重复序列以降低错配的可能性，从而降低引起假阳性的风险，尤其是4个以上G；引物还要避免6个以上A。
(8)引物的3’端的前5个核苷酸避免超过两个C+G，3’端过多的C和G容易引起错配触发扩增从而造成假阳性结果。
(9)MGB探针的3’端的前4个核苷酸避免超过两个G以减少错配风险。
通过分析GenBank序列数据库中的HPIV1、HPIV2和HPIV3的基因组信息及人RNaseP核酸序列信息，本发明选取了图1、2、3、4所示的核酸序列分别作为HPIV1、HPIV2和HPIV3和人RNase P的检测目标序列。利用Primer Express V3.0软件设计出以下用于扩增目标序列的引物和用于检测目标序列的探针序列：
如图1所示，HPIV1的特异性正向引物的序列为SEQ ID No.1，Tm＝58.7℃，反向引物的序列为SEQ ID No.2，Tm＝58.6℃，探针的序列为SEQ ID No.3，Tm＝70.0℃。探针的5’端用荧光报告基团FAM修饰，3’端用MGB基团修饰。检测目标片段长度为99bp。通过BLAST检查确定：该引物和探针序列在已知HPIV1病毒株中高度保守，因而具有良好的包容性，有利于防止漏检；同时和近缘的Leopoldamys edwardsi respirovirus 1及Sendai virus有足够大的差异，且和其它生物不存在相似性，因而也具有良好的特异性，有利于防止错检。
如图2所示，HPIV2的特异性正向引物的序列为SEQ ID No.4，Tm＝59.9℃，反向引物的序列为SEQ ID No.5，Tm＝60.0℃，探针的序列为SEQ ID No.6，Tm＝69.0℃。探针的5’端用荧光报告基团FAM修饰，3’端用MGB基团修饰。检测目标片段长度为118bp。通过BLAST检查确定：该引物和探针序列在已知HPIV2毒株中高度保守，因而具有良好的包容性，有利于防止漏检；同时和其它生物不存在相似性，因而也具有良好的特异性，有利于防止错检。
如图3所示，HPIV3的特异正向引物的序列为SEQ ID No.7，Tm＝59.6℃，两条反向引物的序列分别为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9，Tm＝59.5℃，探针的序列为SEQ ID No.10，Tm＝70.0℃。探针的5’端用荧光报告基团FAM修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。检测目标片段长度为113bp或111bp。通过BLAST检查确定：该引物和探针序列在已知HPIV3毒株中高度保守，因而具有良好的包容性，有利于防止漏检，同时和近缘的Swine parainfluenzavirus 3及Bovine respirovirus 3有足够大的差异，且和其它生物不存在相似性，因而也具有良好的特异性，有利于防止错检。
如图4所示，人RNase P的特异正向引物的序列为SEQ ID No.11，Tm＝59.1℃，反向引物的序列为SEQ ID No.12，Tm＝59.0℃，探针的序列为SEQ ID No.13，Tm＝69.8℃。探针的5’端用荧光报告基团VIC修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。检测目标片段长度为93bp。通过BLAST检查确定：该引物和探针序列在已知人RNase P序列中高度保守，因而具有良好的包容性，有利于防止漏检；同时和其它生物的核酸序列不存在相似性，因而也具有良好的特异性，有利于防止错检。
上述HPIV1、HPIV2、HPIV3和人RNase P的正向引物、反向引物和探针均符合本发明所遵循的设计原则的要求，有利于提高检测性能。
上述引物和探针由华大基因合成，用TE缓冲液配成100uM的保存液和10uM的工作液于-20℃保存。
实施例2：本实施例演示通过真空冷冻干燥技术将本发明荧光RT-PCR检测试剂制成冻干型试剂。
按表2中所述的成分及含量配制荧光RT-PCR液体检测试剂(成分中的引物和探针按实施例1制备)，试剂按1份/管分装于200μl PCR八连管中后进行真空冷冻干燥，得到的冻干型荧光RT-PCR检测试剂为白色颗粒(图5)。向一份试剂中加入23μl无核酸酶水，慢速震荡10s，试剂即完全溶解，用移液枪测得体积为25μl，可知试剂干物质复溶前的体积相当于2μl。为防止试剂受潮和曝光，试剂先和硅胶干燥剂一起作真空处理，再包装于铝箔袋中，在常温中保存。
实施例3：本实施例演示用本发明冻干型荧光RT-PCR检测试剂对HPIV1-3和人RNase P核酸阳性参考品的检测效果。
对HPIV1-3及人RNase P RNA阳性参考品混合液进行10倍梯度稀释，每个浓度取5μl和18μl无核酸酶水混合，然后加到1份按实施例2制备的冻干型荧光RT-PCR检测试剂中；23μl无核酸酶水作为阴性对照品。得到体积为25μl的反应混合液，慢速震荡溶解、离心后在荧光PCR仪上机检测，反应程序按表3设置。每个处理做2个重复。
检测结果如图6所示，本发明所述的冻干型荧光RT-PCR检测试剂对不低于5个拷贝的HPIV1-3及人RNase P核酸阳性参考品的检测结果均显阳性，重复之间Ct的差异系数(CV)＜5％，阴性对照品没有扩增信号。如图7、8所示，HPIV1-3和人RNase P模板浓度的常用对数及其Ct之间呈良好的线性关系(相关系数分别为-0.999和-0.998)，HPIV1-3和人RNase P核酸的扩增效率分别为96.77％和96.70％。
可见，本发明的冻干型荧光RT-PCR检测试剂对HPIV1-3和人RNase P核酸的检测表现良好，同时具有多项优点：(1)可常温保存，无传统液体试剂对保存温度(-20℃)的要求；(2)使用前无需解冻，完全避免了反复冻融对试剂活性的影响；(3)已按单份分装，使用时无需配液、分装步骤，减少了试剂损耗和试剂污染的风险。
Claims (7)
1.一种寡聚核苷酸混合物，其特征在于，含有以下寡聚核苷酸组合A、B、C中的一个或多个：
寡聚核苷酸组合A，由三条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.1、2、3，其中序列为SEQ ID No.3的寡聚核苷酸的5’端和3’端分别用荧光报告基团和MGB基团修饰；
寡聚核苷酸组合B，由三条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.4、5、6，其中序列为SEQ ID No.6的寡聚核苷酸的5’端和3’端分别用荧光报告基团和MGB基团修饰；
寡聚核苷酸组合C，由四条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.7、8、9、10，其中序列为SEQ ID No.10的寡聚核苷酸的5’端和3’端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰。
2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸混合物，其特征在于，所述荧光报告基团从FAM、JOE、HEX、VIC、NED、TET、ROX、Cy5中选择。
3.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸混合物，其特征在于，所述寡聚核苷酸组合C的荧光淬灭基团选用BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中任一种。
4.一种荧光RT-PCR试剂，含有Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶和用于检测人RNase P的引物探针组合，其特征在于，还含有权利要求1至3任一所述的寡聚核苷酸混合物。
5.根据权利要求4所述的荧光RT-PCR试剂，其特征在于，所述荧光RT-PCR试剂还含有尿嘧啶DNA糖基化酶和dUTP。
6.根据权利要求4或5所述的荧光RT-PCR试剂，其特征在于，所述荧光RT-PCR试剂添加冻干赋形剂后通过冷冻干燥工艺制备成冻干型试剂。
7.权利要求4、5或6所述的荧光RT-PCR试剂的应用，其特征在于，应用于检测样本中是否存在人副流感病毒1、2、3型中的一种或多种。
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