CN113789412A - 一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法，包括六项呼吸道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液，六项呼吸道病毒反应液为预分装至八连管中的冻干粉。其中，六项呼吸道病毒反应液A/B两管中含有多条不同荧光标记的探针、引物、酶混合物、增强剂、冻干保护剂、10xbuffer、核苷酸混合物等，可以在同一反应体系中检测是否存在呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型，A/B管均设置有内参对照，为人的保守基因β‑actin片段，标记ROX；内参对照能够显示假阴性的发生，避免了因样品中存在的抑制物或操作失误所导致假阴性判读结果的出现，从而提高PCR检测的准确率。

Description

一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及六项呼吸道病毒核酸检测技术领域，尤指一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法。
背景技术
目前呼吸道感染是临床常见病症，可由多种病毒引起。常见的呼吸道病毒包括：呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒等。呼吸道病毒感染可以引起多种疾病，如感冒、流感、咽炎、喉炎、支气管炎、肺炎等，人体感染后主要临床症状，包括发热、流涕、咽痛、咳嗽、头痛和腹泻等。由于这些病毒引起的感染症状和流行感冒特点相似，仅靠临床症状对病原难以进行区分，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。但是现有的呼吸道病毒核酸检测难以同时检测多种病毒且难以对检测过程进行有效把控。
发明内容
本发明提供一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法，解决现有呼吸道病毒核酸检测难以同时检测多种病毒且难以对检测过程进行有效把控的问题。
本发明提供的技术方案如下：一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，包括反应液A、反应液B、阳性对照液和阴性对照液。
优选地，所述反应液A包括酶混合液、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、DEPC水、副流感病毒Ⅰ型上游引物、副流感病毒Ⅰ型下游引物、副流感病毒Ⅰ型探针、呼吸道腺病毒上游引物、呼吸道腺病毒下游引物、呼吸道腺病毒探针、人偏肺病毒上游引物、人偏肺病毒下游引物、人偏肺病毒探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针。
所述反应液B包括U酶混合液、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、DEPC水、呼吸道合胞病毒上游引物、呼吸道合胞病毒下游引物、呼吸道合胞病毒探针、副流感病毒Ⅱ型上游引物、副流感病毒Ⅱ型下游引物、副流感病毒Ⅱ型探针、副流感病毒Ⅲ型上游引物、副流感病毒Ⅲ型下游引物、副流感病毒Ⅲ型探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针。
优选地，所述阳性对照液包括呼吸道合胞病毒病毒样颗粒、呼吸道腺病毒病毒样颗粒、人偏肺病毒病毒样颗粒、副流感病毒Ⅰ型病毒样颗粒、副流感病毒Ⅱ型病毒样颗粒、副流感病毒Ⅲ型病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒和TE Buffer；所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
优选地，所述副流感病毒Ⅰ型上游引物的序列为：
ACCTACAAGGCAACAACATC；
所述副流感病毒Ⅰ型下游引物的序列为CTTCCTGCTGGTGTGTTAAT；
所述呼吸道腺病毒上游引物的序列为：
GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；
和/或；
所述呼吸道腺病毒上游引物的序列为：
GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；
所述呼吸道腺病毒下游引物的序列为：
GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
所述呼吸道腺病毒探针的序列为：
TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA；
和/或；
所述人偏肺病毒上游引物的序列为ATGTCTCTTCAAGGGATTCACC；
所述人偏肺病毒下游引物的序列为GTGTTATTTCTTGTTGCAATGATG；
所述人偏肺病毒探针的序列为：
CAAACATGCTATATTGAAAGAGTCTCAGTACAC。
优选地，所述呼吸道合胞病毒上游引物的序列为：
TTGGCAAATATGGAAACATACGT；
所述呼吸道合胞病毒下游引物的序列为：
GCCTTTTTCTAGGACATTGTACTGAAC；
所述呼吸道合胞病毒探针的序列为GCTTCACGAAGGCTCCACATAGG；和/或；
所述副流感病毒Ⅱ型上游引物的序列为：
GAGAGTCATATCTCTTCCAAATACAAC；
所述副流感病毒Ⅱ型下游引物的序列为CTAGGTGATAGATCCCGCTTC；
所述副流感病毒Ⅱ型探针的序列为：
CAATGGGCCACAATCAATCCTGCAGTT；
和/或；
所述副流感病毒Ⅲ型上游引物的序列为：
GTGATCAGGAAACTATGTTGCAG；
所述副流感病毒Ⅲ型下游引物的序列为：
TGGATACCCAAATGTGTGGAC；
所述副流感病毒Ⅲ型探针的序列为：
CGGAAGAAACAATTCAACAATTGAAGACC。
优选地，所述副流感病毒Ⅰ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱；
所述副流感病毒Ⅰ型下游引物序列中的第9位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述副流感病毒Ⅰ型探针序列中的第5为碱基C为修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第23位A碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述呼吸道腺病毒上游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱；
所述呼吸道腺病毒下游引物序列中的第15位碱基A为锁核酸修饰碱基；
所述呼吸道腺病毒探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第18位碱基C修饰淬灭基团，第29位A碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述人偏肺病毒上游引物序列中的第10位碱基C为锁核酸修饰碱；
所述人偏肺病毒下游引物序列中的第14位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述人偏肺病毒探针序列中的第10为碱基T为修饰荧光基团，第22位碱基G修饰淬灭基团，第33位C碱基为磷酸化碱基。
优选地，所述呼吸道合胞病毒上游引物序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱；
所述呼吸道合胞病毒下游引物序列中的第17位碱基T为锁核酸修饰碱基；所述呼吸道合胞病毒探针序列中的第6为碱基A为修饰荧光基团，第15位碱基C修饰淬灭基团，第23位G碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述副流感病毒Ⅱ型上游引物序列中的第19位碱基A为锁核酸修饰碱；
所述副流感病毒Ⅱ型下游引物序列中的第11位碱基G为锁核酸修饰碱基；所述副流感病毒Ⅱ型探针序列中的第14为碱基T为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第27位T碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述副流感病毒Ⅲ型上游引物序列中的第13，14位碱基CT为锁核酸修饰碱；
所述副流感病毒Ⅲ型下游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述副流感病毒Ⅲ型探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第23位碱基G修饰淬灭基团，第29位C碱基为磷酸化碱基。
优选地，所述内参上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG；
所述内参下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；
所述内参探针的序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG,，其中，第7位碱基C修饰荧光基团，第16位碱基T修饰为淬灭基团，第23位碱基G为磷酸化碱基。
优选地，所述反应液A/B中所包含的酶混合液如下：UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；
反应液A/B中所包含的增强剂组合如下，MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L；
和/或；
所述反应液A/B中所包含的冻干保护剂组合如下，BSA 0.6-1.0g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；
和/或；
所述反应液A或B中所包含的10xBuffer如下：Tris-HCl10-50mM，KCl100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
和/或；
所述反应液A或B中所包含的核苷酸混合液如下：dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
本发明还公开了一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，使用上述所述所述的试剂盒，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有六项呼吸道病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各50μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S400得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、根据下述判定标准判断样本检测结果。
具体判断如下：
Figure BDA0003294212140000061
优选地，所述步骤S200中的六项呼吸道病毒反应液包含了荧光PCR扩增所需的全部组分。
优选地，所述步骤S500中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
Figure BDA0003294212140000071
与现有技术相比，本发明提供的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法具有以下有益效果：
1、本发明的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，包括六项呼吸道病毒反应液A、反应液B、阳性对照液和阴性对照液。组分简单，试剂盒仅含有4种组分；使用方便，反应程序快速简单，仅需35min即可完成扩增，加上提取10min，从获得样本到得到检测结果，45min内即可完成全部检测。
2、本发明的引物探针中含有多条不同修饰方式、不同荧光标记的探针、引物，引物中个别碱基通过锁核酸的修饰，即将核糖的2′-O位和4′-C位通过特定的的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性，降低与互补碱基的结合自由能，从而稳定互补结构。从而通过该技术，人为调整引物探针结合自由能分布使得结合自由能呈正弦分布，不仅提高引物与模板结合的稳定性，同时大大提高了特异性。本发明中的探针有多种修饰方式，多种修饰的目的在于尽可能降低探针自身的本底信号值，提高检测的灵敏度。
3、本发明的六项呼吸道病毒反应液中的酶混合液含有逆转录酶，Tth DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Taq酶，Vent酶扩增效率明显高于Taq酶，有利于在扩增初始阶段快速累积PCR产物，并在此基础上有Taq酶进一步发挥Taqman探针切割作用，给出扩增信号，从而提高反应灵敏度，Tth DNA聚合酶兼有逆转录酶和DNA聚合酶的活性，且热稳定性好，Tth酶因高温变性而失活，且本反应体系含有Mn2+离子，Tth酶在延伸过程中可继续进行逆转录，从而在扩增过程中适当引入逆转录，充分利用RNA模板，从而提高逆转录和扩增效率。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测六项呼吸道病毒的灵敏度得到显著提升。
4、本发明的六项呼吸道病毒反应液中的增强剂含有MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L，其中，MnCl2和氯化四甲氨有助于提高扩增效率，SSB单链结合蛋白有助于稳定单链结构，焦磷酸酶有助于消除PCR过程生成的焦磷酸，从而提高PCR的持续性，BSA有助于提高酶热稳定性，增强PCR的持续性。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测六项呼吸道病毒的信号值及灵敏度得到显著提升。
5、本发明的六项呼吸道病毒反应液中含有冻干保护剂，其成为含有BSA0.6-1.0g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L，其中，BSA和明胶有助于提高酶热稳定性和冻融稳定性，增强PCR的持续性，精氨酸，山梨糖醇，葡聚糖和海藻糖有助于提高酶的冻融稳定性和构象。
6、本发明的六项呼吸道病毒反应液未预分装预分装且冻干冻干入八连管，开封后可直接加入提取好的核酸进行上机检测。省事，省时，省力，由于加入核酸体积量大，故灵敏度高。
7、本发明试剂盒为内源性内参，可对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对六项呼吸道病毒在核酸水平上的检测。
8、本发明的六项呼吸道病毒反应液未预分装冻干八连管，开封后可直接加入提取好的核酸进行上机检测。省事，省时，省力，由于加入核酸体积量大，故灵敏度高。
9、本发明通过酶混合物和增强剂组合，使得试剂盒灵敏度显著提高，各靶标灵敏度均可达100copies/mL，且检测时间大大缩短，整个检测过程仅需30分钟；通过冻干保护剂，使得试剂盒热稳定性显著增加，可于37℃稳定储存1个月，从而减少对低温运输和储存的依赖：
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及其使用方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1为呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、呼吸道合胞病毒、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型检测结果图；
图2为不同浓度UNG酶检测含dUTP产物的对比效果图；
图3为副流感I型病毒和呼吸道腺病毒不同酶组合验证结果；
图4为人偏肺病毒和呼吸道合胞病毒不同酶组合验证结果；
图5为副流感Ⅱ型病毒和副流感Ⅲ型病毒不同酶组合验证结果；
图6为副流感I型病毒和呼吸道腺病毒不同引物探针修饰组合验证结果；
图7为人偏肺病毒和呼吸道合胞病毒不同引物探针修饰组合验证结果
图8为副流感Ⅱ型病毒和副流感Ⅲ型病毒不同引物探针修饰组合验证结果；
图9为副流感I型病毒和呼吸道腺病毒增强剂组合组合验证结果；
图10为人偏肺病毒和呼吸道合胞病毒增强剂组合组合验证结果
图11为副流感Ⅱ型病毒和副流感Ⅲ型病毒增强剂组合组合验证结果；
图12为呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、呼吸道合胞病毒、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型预分装在八连管中的冻干病毒反应液37℃保存30天与正常冻存于-20℃条件保存的冻干粉的检测效果对比图；
图13副流感病毒Ⅰ型检测限结果图；
图14副流感病毒Ⅱ型检测限结果图；
图15人偏肺病毒检测限结果图；
图16呼吸道合胞病毒检测限结果图；
图17副流感病毒Ⅰ型检测限结果图；
图18副流感病毒Ⅲ型检测限结果图。
具体实施方式
本发明提供一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，包括包括核反应液A、反应液B、阳性对照液和阴性对照液。
其中，反应液A包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、DEPC水、副流感病毒Ⅰ型上游引物、副流感病毒Ⅰ型下游引物、副流感病毒Ⅰ型探针、呼吸道腺病毒上游引物、呼吸道腺病毒下游引物、呼吸道腺病毒探针、人偏肺病毒上游引物、人偏肺病毒下游引物、人偏肺病毒探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针。
反应液B包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂和DEPC水、DEPC水、呼吸道合胞病毒上游引物、呼吸道合胞病毒下游引物、呼吸道合胞病毒探针、副流感病毒Ⅱ型上游引物、副流感病毒Ⅱ型下游引物、副流感病毒Ⅱ型探针、副流感病毒Ⅲ型上游引物、副流感病毒Ⅲ型下游引物、副流感病毒Ⅲ型探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针。
其中，副流感病毒Ⅰ型上游引物的序列为ACCTACAAGGCAACAACATC；副流感病毒Ⅰ型下游引物的序列为CTTCCTGCTGGTGTGTTAAT；副流感病毒Ⅰ型探针的序列为：CAAACGATGGCTGAAAAAGGGA；副流感病毒Ⅰ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱；副流感病毒Ⅰ型下游引物序列中的第9位碱基T为锁核酸修饰碱基；副流感病毒Ⅰ型探针序列中的第5为碱基C为修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第23位A碱基为磷酸化碱基。
呼吸道腺病毒上游引物的序列为：GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；呼吸道腺病毒下游引物的序列为：GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC；呼吸道腺病毒探针的序列为：
TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA；呼吸道腺病毒上游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱；呼吸道腺病毒下游引物序列中的第15位碱基A为锁核酸修饰碱基；呼吸道腺病毒探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第18位碱基C修饰淬灭基团，第29位A碱基为磷酸化碱基。
人偏肺病毒上游引物的序列为ATGTCTCTTCAAGGGATTCACC；人偏肺病毒下游引物的序列为GTGTTATTTCTTGTTGCAATGATG；人偏肺病毒探针的序列为：CAAACATGCTATATTGAAAGAGTCTCAGTACAC；人偏肺病毒上游引物序列中的第10位碱基C为锁核酸修饰碱；人偏肺病毒下游引物序列中的第14位碱基T为锁核酸修饰碱基；人偏肺病毒探针序列中的第10为碱基T为修饰荧光基团，第22位碱基G修饰淬灭基团，第33位C碱基为磷酸化碱基。
呼吸道合胞病毒上游引物的序列为：TTGGCAAATATGGAAACATACGT；呼吸道合胞病毒下游引物的序列为：
GCCTTTTTCTAGGACATTGTACTGAAC；呼吸道合胞病毒探针的序列为GCTTCACGAAGGCTCCACATAGG；呼吸道合胞病毒上游引物序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱；呼吸道合胞病毒下游引物序列中的第17位碱基T为锁核酸修饰碱基；呼吸道合胞病毒探针序列中的第6为碱基A为修饰荧光基团，第15位碱基C修饰淬灭基团，第23位G碱基为磷酸化碱基。
副流感病毒Ⅱ型上游引物的序列为：GAGAGTCATATCTCTTCCAAATACAAC；副流感病毒Ⅱ型下游引物的序列为CTAGGTGATAGATCCCGCTTC；副流感病毒Ⅱ型探针的序列为：CAATGGGCCACAATCAATCCTGCAGTT；副流感病毒Ⅱ型上游引物序列中的第19位碱基A为锁核酸修饰碱；副流感病毒Ⅱ型下游引物序列中的第11位碱基G为锁核酸修饰碱基；副流感病毒Ⅱ型探针序列中的第14为碱基T为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第27位T碱基为磷酸化碱基。
副流感病毒Ⅲ型上游引物的序列为：GTGATCAGGAAACTATGTTGCAG；副流感病毒Ⅲ型下游引物的序列为：TGGATACCCAAATGTGTGGAC；副流感病毒Ⅲ型探针的序列为：CGGAAGAAACAATTCAACAATTGAAGACC；副流感病毒Ⅲ型上游引物序列中的第13位碱基C为锁核酸修饰碱；副流感病毒Ⅲ型下游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱基。副流感病毒Ⅲ型探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第23位碱基G修饰淬灭基团，第29位C碱基为磷酸化碱基。
其中，内参上游引物的序列为：
AGATTTGGACCTGCGAGCG；
内参下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；
内参探针的序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG,，其中，第7位碱基C修饰荧光基团，第16位碱基T修饰为淬灭基团，第23位碱基G为磷酸化碱基。
六项呼吸道病毒反应液中的所包含的酶混合物包括如下组分：UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；UNG酶5U/μL、Tth DNA聚合酶1.25U/μL，Vent DNA聚合酶1.5U/μL、Taq酶2.5U/μL、逆转录酶200U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL。
增强剂包括如下组分：MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L。
冻干保护剂包括如下组分：BSA 0.8g/L，明胶1％，山梨醇糖1％，精氨酸1.0g/L，葡聚糖1.0g/L，海藻糖1.0g/L；
10xBuffer如下，Tris-HCl10-50mM，KCl 100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
核苷酸混合液如下，dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
具体实施时，反应液A和反应液B中的个组分的配比分别如下表1和表2所示：
表1：反应液A组分及配比
Figure BDA0003294212140000131
Figure BDA0003294212140000141
表1
表2：反应液B组分及配比
Figure BDA0003294212140000142
Figure BDA0003294212140000151
表2
在同一反应体系A/B两管中检测是否存在呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型，A管为副流感病毒Ⅰ型、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒，分别标记FAM、VIC、CY5；B为呼吸道合胞病毒、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型，分别标记FAM、VIC、CY5；A/B管均设置有内参对照，为人的保守基因β-actin片段，标记ROX。内参对照能够显示假阴性的发生，避免了因样品中存在的抑制物或操作失误所导致检测结果呈现假阴性而做出的结果误判，从而提高PCR检测的准确率。
内参引物的TM值在55-60℃之间，GC含量在30-80％，两条引物的TM值差异小于5℃；扩增长度50-150bp之间；引物3’末端自身错配小于3bp；引物在非靶标序列中，无特异结合位点，或特异结合区域大于1000bp。探针的TM值在60-70℃之间，GC含量在30-80％；探针的5’端第一个碱基不能为G；探针无大于3bp的发夹结构。
本实施例的内参是对产品本身内参的检测，在样本中含有天然的人脱落细胞，因此含有大量的内参基因，由于内参基因独立于六项呼吸道病毒，因此无论样本中是否含有六项呼吸道病毒，其内参均为阳性。本实施例的内参会参与从核酸提取到RT-PCR的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程和扩增过程进行监控，避免假阴性结果的出现，而现有的呼吸道病毒检测试剂中的内参为外源的含有内参基因片段的慢病毒，不参与提取，只参与扩增，这样只能指示扩增的结果是否正常，完全不能避免样品采集，保存运输和核酸提取过程有误而导致的阴性结果的出现。
本发明还提供一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有六项呼吸道病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各50μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S400得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、根据下述判定标准判断样本检测结果。
Figure BDA0003294212140000161
其中，具体实施时，所述步骤S200中的六项呼吸道病毒反应液包含了荧光PCR扩增所需的全部组分。
步骤S500中的荧光定量PCR仪的扩增检测循环参数如下：
Figure BDA0003294212140000171
PCR反应过程中，若待检样本包含副流感病毒Ⅰ型，则A管的标记FAM探针产生荧光信号；若待检样本包含呼吸道腺病毒，则A管的标记VIC探针产生荧光信号；若待检样本包含人偏肺病毒，则A管的标记CY5探针产生荧光信号；若待检样本包含呼吸道合胞病毒，则B管的标记FAM探针产生荧光信号；若待检样本包含副流感病毒Ⅱ型，则B管的标记VIC探针产生荧光信号；若待检样本包含副流感病毒Ⅲ型，则B管的标记CY5探针产生荧光信号。另外，A/B管反应中均含有内参基因，则标记的ROX探针应产生荧光信号，用于检测仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素等。
实施例2
本实施例中，使用上述配置体系的剂盒分别检测呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型样本混合感染，结果如图1所示。
实施例3
特异性验证：本实施例中检测其他病原体的特异性检测效果如下表3所示。
检测其他常见病原体均为阴性。
样品 检测结果
博卡病毒 -
巨细胞病毒 -
单纯疱疹病毒1型 -
水痘带状疱疹病毒 -
EB病毒 -
百日咳杆菌 -
肺炎衣原体 -
棒状杆菌属 -
流感嗜血杆菌 -
乳酸杆菌属 -
嗜肺军团菌 -
卡他莫拉菌 -
肺炎支原体 -
奈瑟氏菌属 -
金黄色葡萄球菌 -
表皮葡萄球菌 -
肺炎链球菌 -
化脓性链球菌 -
唾液链球菌 -
肺孢子菌 -
白念珠菌 -
肺炎克雷伯菌 -
表3
试剂盒检测对照组和以及加入不同干扰物质，对于呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型样本，加入干扰物质与对照组(不加干扰物质)的对比检测结果见下表。结果表明，呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型样本中含有下表中的干扰物质时，结果分别如表4或表5所示，对试剂盒检测无干扰，表明试剂盒抗干扰能力较强。
A管干扰物质研究实验数据
Figure BDA0003294212140000181
Figure BDA0003294212140000191
表4B管干扰物质研究实验数据
Figure BDA0003294212140000192
Figure BDA0003294212140000201
表5
实施例4
体系中加入不同浓度的UNG酶：浓度1(4.0U//μL)、浓度2(6.0U//μL)、浓度3(5.0U/μL)，以1×104copies/mL的含dU的产物为模板进行扩增，结果显示，浓度3(最佳浓度)UNG酶无扩增曲线，表明5U/μL的UNG酶能够消除不高于1×104copies/mL的产物的污染，起到防污染的效果，检测结果如图2所示。
实施例5
设置4种不同的DNA聚合酶组合方式，分别为体系中加入Taq酶+Tth酶(组合1)、Taq酶+Vent酶+Tth酶(组合2)、Taq酶+Vent酶(组合3)、仅含Taq酶(组合4)4种组合，对比检测呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型，阳性样本，对比检测结果如图3-5所示。从图3-5中可知，体系中同时加入Taq酶、Vent酶和Tth酶时，反应体系扩增效果最佳，检测Ct值和信号值有较大提升。
实施例6
设置3种不同引物探针的修饰方法组合，通过呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型，阳性样本对引物探针的修饰组合进行评价，针对六项呼吸道病毒分别通过不同的组合进行修饰，具体情况如下：
针对副流感病毒Ⅰ型，修饰组合如下：
修饰1：副流感病毒Ⅰ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱；副流感病毒Ⅰ型下游引物序列中的第9位碱基T为锁核酸修饰碱基；副流感病毒Ⅰ型探针序列中的第5为碱基C为修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第23位A碱基为磷酸化碱基；
修饰2：上游引物下游引物序列均无修饰，探针序列中的第5为碱基C为修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第23位A碱基为磷酸化碱基；
修饰3：上游引物下游引物序列均无修饰，序列中的5‘端修饰荧光基团，3‘端修饰淬灭基团。
针对呼吸道腺病毒，修饰组合如下：
修饰1：呼吸道腺病毒上游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱；呼吸道腺病毒下游引物序列中的第15位碱基A为锁核酸修饰碱基；呼吸道腺病毒探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第18位碱基C修饰淬灭基团，第29位A碱基为磷酸化碱基；
修饰2：上有引物和下游引物均无修饰，探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第18位碱基C修饰淬灭基团，第29位A碱基为磷酸化碱基；
修饰3：上游引物和下游引物均无修饰，探针序列的5‘端修饰荧光基团，3‘端修饰淬灭基团。
针对人偏肺病毒，修饰组合如下：
修饰1：人偏肺病毒上游引物序列中的第10位碱基C为锁核酸修饰碱；人偏肺病毒下游引物序列中的第14位碱基T为锁核酸修饰碱基；人偏肺病毒探针序列中的第10为碱基T为修饰荧光基团，第22位碱基G修饰淬灭基团，第33位C碱基为磷酸化碱基。
修饰2：上游引物和下游引物均无修饰，人偏肺病毒探针序列中的第10为碱基T为修饰荧光基团，第22位碱基G修饰淬灭基团，第33位C碱基为磷酸化碱基。
修饰3：上游引物和下游引物均无修饰，探针序列的5‘端修饰荧光基团，3‘端修饰淬灭基团。
针对呼吸道合胞病毒，修饰如下：
修饰1：呼吸道合胞病毒上游引物序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱；呼吸道合胞病毒下游引物序列中的第17位碱基T为锁核酸修饰碱基；呼吸道合胞病毒探针序列中的第6为碱基A为修饰荧光基团，第15位碱基C修饰淬灭基团，第23位G碱基为磷酸化碱基。
修饰2：上游引物和下游引物均无修饰，呼吸道合胞病毒探针序列中的第6为碱基A为修饰荧光基团，第15位碱基C修饰淬灭基团，第23位G碱基为磷酸化碱基。
修饰3：上游引物和下游引物均无修饰，探针序列的5‘端修饰荧光基团，3‘端修饰淬灭基团。
针对副流感病毒Ⅱ型，修饰如下：
修饰1：副流感病毒Ⅱ型上游引物序列中的第19位碱基A为锁核酸修饰碱；副流感病毒Ⅱ型下游引物序列中的第11位碱基G为锁核酸修饰碱基；副流感病毒Ⅱ型探针序列中的第14为碱基T为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第27位T碱基为磷酸化碱基。
修饰2：上游和下游引物序列均无修饰，探针序列中的第14为碱基T为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第27位T碱基为磷酸化碱基。
修饰3：上游和下游引物序列均无修饰，探针序列的5‘端修饰荧光基团，3‘端修饰淬灭基团。
针对副流感病毒Ⅲ型，修饰如下：
修饰1：副流感病毒Ⅲ型上游引物序列中的第13位碱基C为锁核酸修饰碱；副流感病毒Ⅲ型下游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱基。副流感病毒Ⅲ型探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第23位碱基G修饰淬灭基团，第29位C碱基为磷酸化碱基。
修饰2：上游引物和下游引物序列均无修饰，探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第23位碱基G修饰淬灭基团，第29位C碱基为磷酸化碱基。
修饰3：上游引物和下游引物序列均无修饰，探针序列的5‘端修饰荧光基团，3‘端修饰淬灭基团。
从六种呼吸道病毒中的3种修饰组合对比来看，每个病毒中的修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于其他修饰方法，以副流感病毒I型引物探针的不同修饰方式下的检测结果见图6-8所示。由图6-8可知，本实施例的修饰方法极大改善了体系扩增的效率问题，检测Ct值和信号值有较大提升。
实施例7
本实施例中含有增强剂，具有增强六项呼吸道病毒反应液稳定性的效果，同时也可显著提高灵敏度及信号值。通过检测呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型阳性样本，对比去除增强剂和加入增强剂的对扩增检测的影响，对比效果图如图9-11所示，由图9-11可知，对于高浓度样本还是低浓度样本，增强剂均有显著提升效果，检测Ct值和信号值有较大提升。
实施例8
本实施例中六项呼吸道病毒反应液为预分装在冻干八连管中的冻干粉，具有操作简便，上样量大的效果，稳定性更强，置于37℃条件下可稳定保存30天。具体实施步骤见图，实施方案中将预分装在冻干八连管中的冻干粉置于37℃条件下储存30天，与正常冻存于-20℃条件保存的冻干粉的检测效果对比。
预分装在八连管中的冻干六项呼吸道反应液分别在37℃和-20℃下保存30天，对比检测6例临床样本的检测效果对比如图12所示，从图12所示的结果中可以看出，检测冻干粉在37℃条件下放置30天与第0天无差异，与-20℃条件下放置30天也无差异。表明预分装在八连管中的冻干六项呼吸道病毒反应液37℃条件下储存的稳定性良好。
Figure BDA0003294212140000241
表7
实施例9
试剂盒检测检测限浓度(50copies/mL)的不同来源的呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型样本，检测结果见图13-18所示。结果表明，试剂盒可检测检测限浓度的呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅲ型样本，表明试剂盒检测能力较强。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括反应液A、反应液B、阳性对照液和阴性对照液。
2.根据权利要求1所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述反应液A包括酶混合液、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、DEPC水、副流感病毒Ⅰ型上游引物、副流感病毒Ⅰ型下游引物、副流感病毒Ⅰ型探针、呼吸道腺病毒上游引物、呼吸道腺病毒下游引物、呼吸道腺病毒探针、人偏肺病毒上游引物、人偏肺病毒下游引物、人偏肺病毒探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针；
所述反应液B包括酶混合液、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、DEPC水、呼吸道合胞病毒上游引物、呼吸道合胞病毒下游引物、呼吸道合胞病毒探针、副流感病毒Ⅱ型上游引物、副流感病毒Ⅱ型下游引物、副流感病毒Ⅱ型探针、副流感病毒Ⅲ型上游引物、副流感病毒Ⅲ型下游引物、副流感病毒Ⅲ型探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针。
3.根据权利要求2所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液包括呼吸道合胞病毒病毒样颗粒、呼吸道腺病毒病毒样颗粒、人偏肺病毒病毒样颗粒、副流感病毒Ⅰ型病毒样颗粒、副流感病毒Ⅱ型病毒样颗粒、副流感病毒Ⅲ型病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒和TE Buffer；所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
4.根据权利要求2所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应液A中的引物探针如下：
所述副流感病毒Ⅰ型上游引物的序列为ACCTACAAGGCAACAACATC；
所述副流感病毒Ⅰ型下游引物的序列为CTTCCTGCTGGTGTGTTAAT；
所述副流感病毒Ⅰ型探针的序列为：
CAAACGATGGCTGAAAAAGGGA；
和/或；
所述呼吸道腺病毒上游引物的序列为：
GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；
所述呼吸道腺病毒下游引物的序列为：
GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
所述呼吸道腺病毒探针的序列为：
TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA；
和/或；
所述人偏肺病毒上游引物的序列为ATGTCTCTTCAAGGGATTCACC；
所述人偏肺病毒下游引物的序列为GTGTTATTTCTTGTTGCAATGATG；
所述人偏肺病毒探针的序列为：
CAAACATGCTATATTGAAAGAGTCTCAGTACAC。
5.根据权利要求2所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应液B中的引物探针如下：
所述呼吸道合胞病毒上游引物的序列为：
TTGGCAAATATGGAAACATACGT；
所述呼吸道合胞病毒下游引物的序列为：
GCCTTTTTCTAGGACATTGTACTGAAC；
所述呼吸道合胞病毒探针的序列为GCTTCACGAAGGCTCCACATAGG；和/或；
所述副流感病毒Ⅱ型上游引物的序列为：
GAGAGTCATATCTCTTCCAAATACAAC；
所述副流感病毒Ⅱ型下游引物的序列为CTAGGTGATAGATCCCGCTTC；
所述副流感病毒Ⅱ型探针的序列为：
CAATGGGCCACAATCAATCCTGCAGTT；
和/或；
所述副流感病毒Ⅲ型上游引物的序列为：
GTGATCAGGAAACTATGTTGCAG；
所述副流感病毒Ⅲ型下游引物的序列为：
TGGATACCCAAATGTGTGGAC；
所述副流感病毒Ⅲ型探针的序列为：
CGGAAGAAACAATTCAACAATTGAAGACC。
6.根据权利要求4所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述副流感病毒Ⅰ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱；
所述副流感病毒Ⅰ型下游引物序列中的第9位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述副流感病毒Ⅰ型探针序列中的第5为碱基C为修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第23位A碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述呼吸道腺病毒上游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱；
所述呼吸道腺病毒下游引物序列中的第15位碱基A为锁核酸修饰碱基；
所述呼吸道腺病毒探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第18位碱基C修饰淬灭基团，第29位A碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述人偏肺病毒上游引物序列中的第10位碱基C为锁核酸修饰碱；
所述人偏肺病毒下游引物序列中的第14位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述人偏肺病毒探针序列中的第10为碱基T为修饰荧光基团，第22位碱基G修饰淬灭基团，第33位C碱基为磷酸化碱基。
7.根据权利要求5所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述呼吸道合胞病毒上游引物序列中的第13位碱基G为锁核酸修饰碱；
所述呼吸道合胞病毒下游引物序列中的第17位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述呼吸道合胞病毒探针序列中的第6为碱基A为修饰荧光基团，第15位碱基C修饰淬灭基团，第23位G碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述副流感病毒Ⅱ型上游引物序列中的第19位碱基A为锁核酸修饰碱；
所述副流感病毒Ⅱ型下游引物序列中的第11位碱基G为锁核酸修饰碱基；所述副流感病毒Ⅱ型探针序列中的第14为碱基T为修饰荧光基团，第20位碱基C修饰淬灭基团，第27位T碱基为磷酸化碱基；
和/或；
所述副流感病毒Ⅲ型上游引物序列中的第13位碱基C为锁核酸修饰碱；
所述副流感病毒Ⅲ型下游引物序列中的第13位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述副流感病毒Ⅲ型探针序列中的第9为碱基A为修饰荧光基团，第23位碱基G修饰淬灭基团，第29位C碱基为磷酸化碱基。
8.根据权利要求2所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述内参上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG；
所述内参下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；
所述内参探针的序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG,，其中，第7位碱基C修饰荧光基团，第16位碱基T修饰为淬灭基团，第23位碱基G为磷酸化碱基。
9.根据权利要求2所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述反应液A或B中所包含的酶混合液如下：UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；
反应液A或B中所包含的增强剂组合如下，MnCl2 1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L；
和/或；
所述反应液A或B中所包含的冻干保护剂组合如下，BSA 0.6-1。0g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；
和/或；
所述反应液A或B中所包含的10xBuffer如下：Tris-HCl 10-50mM，KCl 100-1000mM，Mg2SO4 20-80mM；
和/或；
所述反应液A或B中所包含的核苷酸混合液如下：dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
10.一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于，使用权利要求1-8任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有六项呼吸道病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各50μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S400得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、根据下述判定标准判断样本检测结果，具体如下：
Figure FDA0003294212130000061
11.根据权利要求9所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于：所述步骤S200中的六项呼吸道病毒反应液包含了荧光PCR扩增所需的全部组分。
12.根据权利要求10所述的一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于，所述步骤S500中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
Figure FDA0003294212130000062
Figure FDA0003294212130000071
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Applicant before: SHANGHAI BOJIE MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

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Application publication date: 20211214

Assignee: Shanghai Fangyuan Biaoping Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Shanghai Berger Medical Technology Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024310000035

Denomination of invention: A six item respiratory virus nucleic acid testing kit and its usage method

Granted publication date: 20221111

License type: Common License

Record date: 20240402