CN105349529A - 一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂 - Google Patents
一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105349529A CN105349529A CN201510907693.7A CN201510907693A CN105349529A CN 105349529 A CN105349529 A CN 105349529A CN 201510907693 A CN201510907693 A CN 201510907693A CN 105349529 A CN105349529 A CN 105349529A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid amplification
- freeze
- amplification system
- lyophilized vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂，包括以下组份中的一种或多种：海藻糖、焦磷酸二乙酯处理过的水。所述核酸扩增体系的冻干保护剂进一步包括以下组分：蔗糖和/或乳糖。所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：将所述组份按照使用的浓度比混匀，即得到冻干保护剂。本发明可以冻干的检测RNA/DNA的荧光定量核酸诊断试剂体系，能实现冷冻干燥，只需一步水化就可以实现检测目的，而且能达到现阶段核酸诊断试剂无法达到的常温运输和保存的目的。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)技术基于其快速、简便、灵敏、特异等优点，自1989年开始就被应用于医学检测和临床检验，随后很快地成为医学和诊断学的主要检测手段之一。
DNA核酸扩增，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段。利用DNA在体外高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR的特点是：特异性强、灵敏度高、简便快速、纯度要求低，广泛用于各种疾病和肿瘤等的检测。
RNA核酸扩增，是将RNA的逆转录体系和DNA扩增体系相结合的技术。能够实现一步对RNA进行检测，不但操作方便，灵敏度也得到了很大的提升，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。
核酸分子诊断成为了诊断试剂行业的发展方向，荧光定量核酸诊断试剂是目前市场上最先进的诊断试剂。常规检测的乙肝、丙肝、艾滋、也可用于医院、疾控等临床样本中对各种各样的细菌、病毒感染等疾病的检测。而且相对于传统的培养、镜检、免疫学方法等来说，核酸诊断具有其他方法无法替代的灵敏和及时等优点。
核酸诊断被广泛应用于各种病原体的检测上，但是核酸扩增反应试剂在常温下保存不稳定，几周就失效了；在2～8℃条件下保存，保存期也只有三个月左右；-20℃条件下的保存期虽然可以达到一年之久，但是每次使用必须要反复冻融，这对试剂的活性也有很大的影响，并且各组分不能混合一起，用时需混合，操作麻烦等缺点，试剂盒的长期保存和长途运输将会受到很大的限制，容易因诊断试剂保存温度不当而使其敏感性下降甚至完全失效，最终导致疫病的检测不及时而造成疫病流行。
目前，市场上核酸扩增反应试剂缺少能在4℃或室温长期保存的方法，这也限制了核酸诊断试剂产品的市场。。
核酸技术作为一种新生的高新技术，代表临床实验诊断学发展的又一里程碑，十多年的临床实践表明，荧光定量核酸诊断技术已在医学基础检测和临床诊断中占据主导地位，因此开发适用于荧光定量核酸试剂常温保存的相关技术已迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂。本发明冻干保护剂为应用于荧光定量核酸诊断试剂的冻干技术提供了一种有效的、可以实现的冻干体系。诊断试剂通过冷冻干燥的技术，液体试剂变成冻干粉，以冻干粉的形式能更稳定的保存，达到现阶段核酸诊断试剂无法达到的常温运输和常温保存的目的，也减少了试剂反复冻融。检测时只需一步水化再加入样本即可以实现检测目的，操作简单。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂，包括以下组份中的一种或多种：海藻糖、焦磷酸二乙酯处理过的水。
所述核酸扩增体系的冻干保护剂进一步包括以下组分：蔗糖和/或乳糖。
所述核酸扩增体系的冻干保护剂不包括甘露醇。在本发明核酸扩增体系的试验中，加入甘露醇作为冻干保护剂的效果远不如本发明采用的海藻糖、蔗糖、和/或乳糖体系。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种如前述中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：将所述组份按照使用的浓度比混匀，即得到冻干保护剂。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种如前述任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述组份按照使用的浓度比混匀；
步骤2：冷冻干燥，即得到冻干保护剂。
所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
子步骤1：干燥的步骤；
子步骤2：冻干的步骤；
所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.5-7：13-16.5，所述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
预冻阶段：隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；
一次升华阶段：保持2-4h；
二次升华阶段：保持2-4h；
终干燥阶段：保持2-3h。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，包括以下步骤：
步骤1：将用于核酸扩增体系的酶混合液、核酸扩增反应液、低温冻干保护液将按照对应的浓度比混匀，即得到用于核酸扩增体系的组合物；
步骤2：冷冻干燥，即得到冻干状态的用于核酸扩增体系的组合物。
所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
子步骤1：干燥的步骤；
子步骤2：冻干的步骤；
所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.5-7：13-16.5，所述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
预冻阶段：隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；
一次升华阶段：保持2-4h；
二次升华阶段：保持2-4h；
终干燥阶段：保持2-3h。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的检测试剂盒，所述检测试剂盒能够在常温下运输和/或保存。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂和/或所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法和/或所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，在核酸扩增体系的制备及使用中的应用。
本发明有益的技术效果在于：
在将本发明的荧光定量核酸诊断试剂体系冻干后，常温放置后再进行临床样本检测，与对比产品进行比较，不论在检出准确率上，还是在CT值的变化上面，都没有显著性差异，而且灵敏度也比较好。本发明可以冻干的检测RNA/DNA的荧光定量核酸诊断试剂体系，能实现冷冻干燥，和上市的同类产品相比较，检测时操作简单，只需一步水化就可以实现检测目的，而且能达到现阶段核酸诊断试剂无法达到的常温运输和保存的目的。
附图说明
图1为本发明体系与对比产品检测肠道病毒71型和B族链球菌临床样本的对比结果图；
图2为本发明体系灵敏度检测结果图。
其中：
A为本发明体系的检测结果(重复3次)；
B为对比产品的检测结果(重复3次)。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
需要说明的是，为节省说明书撰写篇幅，避免不必要的重复和浪费，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明公开了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂。所述内容包括缓冲液、酶混合液、核酸扩增反应液、冻干保护剂。本发明为应用于荧光定量核酸诊断试剂的冻干技术提供了一种有效的、可以实现的冻干体系。诊断试剂通过冷冻干燥的技术，液体试剂变成冻干粉，以冻干粉的形式能更稳定的保存，达到现阶段核酸诊断试剂无法达到的常温运输和常温保存的目的，也减少了试剂反复冻融。检测时只需一步水化再加入样本即可以实现检测目的，操作简单。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂，包括以下组份中的一种或多种：海藻糖、焦磷酸二乙酯处理过的水。
所述核酸扩增体系的冻干保护剂进一步包括以下组分：蔗糖和/或乳糖。
所述核酸扩增体系的冻干保护剂不包括甘露醇。在本发明核酸扩增体系的试验中，加入甘露醇作为冻干保护剂的效果远不如本发明采用的海藻糖、蔗糖、和/或乳糖体系。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种如前述中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：将所述组份按照使用的浓度比混匀，即得到冻干保护剂。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种如前述任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述组份按照使用的浓度比混匀；
步骤2：冷冻干燥，即得到冻干保护剂。
所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
子步骤1：干燥的步骤；
子步骤2：冻干的步骤；
所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.5-7：13-16.5，所述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
预冻阶段：隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；
一次升华阶段：保持2-4h；
二次升华阶段：保持2-4h；
终干燥阶段：保持2-3h。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，包括以下步骤：
步骤1：将用于核酸扩增体系的酶混合液、核酸扩增反应液、低温冻干保护液将按照对应的浓度比混匀，即得到用于核酸扩增体系的组合物；
步骤2：冷冻干燥，即得到冻干状态的用于核酸扩增体系的组合物。
所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
子步骤1：干燥的步骤；
子步骤2：冻干的步骤；
所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.5-7：13-16.5，所述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
预冻阶段：隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；
一次升华阶段：保持2-4h；
二次升华阶段：保持2-4h；
终干燥阶段：保持2-3h。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的检测试剂盒，所述检测试剂盒能够在常温下运输和/或保存。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂和/或所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法和/或所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，在核酸扩增体系的制备及使用中的应用。
本发明提供的用于冻干保护剂如下1)或2)或3)：
1)所述冻干保护剂由海藻糖、蔗糖和焦磷酸二乙酯处理过的水(DEPC水)组成，所述海藻糖、蔗糖用DEPC水溶解，配比为：0.001-2000mmol/L：0.001-6000mmol/L。
2)所述冻干保护剂由海藻糖、乳糖和焦磷酸二乙酯处理过的水(DEPC水)组成，所述海藻糖、乳糖用DEPC水溶解，配比为：0.001-2000mmol/L：0.001-280mmol/L。
所述冻干保护剂由海藻糖、蔗糖、乳糖和焦磷酸二乙酯处理过的水(DEPC水)组成，所述海藻糖、蔗糖、乳糖用DEPC水溶解，配比为：0.001-2000mmol/L：0.001-6000mmol/L：0.001-280mmol/L。
在本发明一实施例中，
上述1)所述冻干保护剂中，所述海藻糖、蔗糖配制的RNA扩增反应冻干体系(25μL)如下表1：
或2)所述冻干保护剂中，所述海藻糖、蔗糖配制的RNA扩增反应冻干体系(25μL)如下表2：
或3)所述冻干保护剂中，所述海藻糖、蔗糖、乳糖配制的RNA扩增反应冻干体系(25μL)如下表3：
或1)所述冻干保护剂中，所述海藻糖配制的DNA扩增反应冻干体系(25μL)如下表4：
或2)所述冻干保护剂中，所述海藻糖配制的DNA扩增反应冻干体系(25μL)如下表5：
或2)所述冻干保护剂中，所述海藻糖配制的DNA扩增反应冻干体系(25μL)如下表6：
在本发明的另一实施例中，提供了一种制备上述反应体系混合物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述混合物的各物质按照对应的浓度比混匀，即得到用于冻干保护的组合物。
上述用于冻干保护的混合物在冻干核酸扩增反应试剂中的应用也是本发明保护的范围。
在本发明的再一实施例中，提供了一种冻干核酸扩增反应试剂的使用方法。
本发明提供的使用方法，包括如下步骤：
所述将上述用于冻干保护的组合物和核酸扩增反应试剂混匀，干燥，得到干燥产物；
所述冻干保护剂和所述RNA核酸扩增反应体积比为7：13；冻干保护剂和所述DNA核酸扩增反应体积比为3.5：16.5；
所述核酸扩增反应试剂为实时荧光定量RNA检测试剂或实时荧光定量DNA检测试剂；
所述干燥采用冷冻真空干燥；
所述冻干的条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；一次升华阶段：开始设置抽真空至0.3mbar，同时温度开始1℃/min升至-35℃－-25℃，保持2-4h；二次升华阶段：设置温度开始1℃/min升至-5℃－0℃，保持2-4h；终干燥阶段：设置温度1℃/min升至10℃-25℃，保持2-3h。
本发明冻干保护剂可以在试剂混合液冻结和干燥过程中，防止活性组分发生变性的物质。
在本发明再一实施例中，通过设计双盲实验对本发明冻干保护剂进行质量评估，具体检验方法如下：
海藻糖购自Sigma公司；
乳糖、蔗糖购买自国药集团化学试剂有限公司；
引物探针是本公司自己设计，上海百力格生物技术有限公司合成；
扩增所需要的酶和其他原料购买自Promega公司；
按照本发明实施例中表1和表4进行配制RNA和DNA反应体系，配制完核酸反应体系混合液后，按照本发明实施例的冻干方法进行真空冷冻干燥。
在本发明的又一实施例中，对本发明实施例的核酸扩增反应试剂冻干制品的方法进行详细描述。
冻干保护剂的制备：
冻干保护剂组分的选择和配比对诊断试剂的成型和保存效果有显著的影响。
为了使此核酸扩增反应试剂冻干制品的外观和成型较好，以及延长其保存期限，对冻干保护剂的组分进行了长期的分析和研究，经过一系列的试验，优化了各种组分的种类以及含量，选用如下组分：海藻糖、蔗糖。
(一)冻干保护剂的配制
称取海藻糖0.3g，蔗糖0.07g，将以上试剂加入到100mL容量瓶中，充分溶解后混匀，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到冻干保护剂，置于4℃冰箱中保存备用。
(二)RNA反应缓冲液的配制：
称取MgCl20.0038g，Tris-HCl(pH8.8)0.1454g，KCl0.4473g，再量取250μLdNTP(100mM)，加入70mL三重水中，定容至100mL混匀，-20℃保存备用。
(三)引物探针混合液的配制：
以肠道病毒71型(EV71)的扩增引物为例提供各引物的序列：
EV71-上游引物(5‘ATGATGGGYACRTTCTCAGT-3‘)
EV71-下游引物(5‘TTRCGCATMGGSCGAGGT-3‘)
EV71-探针(5‘GTGCTTCATYCTCATGCC3‘)
引物探针配制成100μmol的母液，放4℃保存备用。使用时，按300nmol：300nmol：150nmol的浓度配制(25μL体系/人份)。
(四)酶混合液的配制：RNA逆转录酶50U/μL2μL，RAN抑制剂20U/μL1μL，HotStartTaqDNA聚合酶2.5U/μL1μL(25μL体系/人份)。
(五)冻干混合液的配制(25μL/人份)：
RNA反应缓冲液：4μL
酶混合液：5μL
引物探针混合液4μL
冻干保护剂7μL
上述配制试剂混匀，离心，分装到PCR8连管中。
(六)真空冷冻干燥：
预冻阶段，隔板温度下降到-50℃，保持时间4h；一次升华阶段：开始设置抽真空至0.3mbar，同时温度开始1℃/min升至-25℃，保持2h；二次升华阶段：设置温度开始1℃/min升至0℃，保持2h；终干燥阶段：设置温度1℃/min升至15℃，保持2h，冻干全过程为10h。
冻干当天，溶解冻干粉，进行灵敏度检测，对比产品为：
北京爱普益生物科技有限公司生产的“肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”国械注准20153401611；
检测：拿出所需要的冻干管，离心1-3分钟，直接加DEPC水20μL，加5μL提取的RNA模板，对比产品按说明书进行操作，ABI7500进行上机检测，程序如下：逆转录程序50℃：25min：95℃预变性5min；94℃变性10sec；55℃退火40sec，55℃采集荧光，退回变性阶段，共45个循环。灵敏度检测如图1所示。
样本的来源
肠道病毒71(RNA)100例样本来自淮南东方医院集团总医院(安徽理工大学附属医院)；
实时稳定性试验
常温放置1个月，检测结果统计如下表7。
在本发明另一实施例中，提供了一种应用于DNA冻干保护剂的制备方法。
冻干保护剂的配制
称取海藻糖0.6g，蔗糖0.14g，将以上试剂加入到100mL容量瓶中，充分溶解后混匀，用用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到冻干保护剂，置于4℃冰箱中保存备用。
RNA反应缓冲液的配制：
称取MgCl20.0038g，Tris-HCl(pH8.8)0.1454g,KCl0.4473g，再量取250μLdNTP(100mM)，加入70mL三重水中，定容至100mL混匀，-20℃保存备用。
以B族链球菌(GBS)的扩增引物为例提供各引物的序列：
GBS-上游引物(5‘CAAATTGAACCTCTTGTAGCTGAA3‘)
GBS-下游引物(5‘CCGCTGTTGATAGGGCATC3‘)
GBS-探针(5‘CAAAGCTGCTATGGCAATCCTTCAACA‘)
引物探针混合液的配制：引物探针配制成100μmol的母液，放4℃保存备用。使用时，按300nmol：300nmol：150nmol的浓度配制(25μL体系/人份)。
酶混合液的配制：HotStartTaqDNA聚合酶2.5U/μL1μL(25μL体系/人份)。
冻干混合液的配制(25μL/人份)：
DNA反应缓冲液11.5μL
酶混合液1μL
引物探针混合液4μL
冻干保护剂3.5μL
上述配制试剂混匀，离心，分装到PCR8连管中。
真空冷冻干燥
预冻阶段，隔板温度下降到-50℃，保持时间4h；一次升华阶段：开始设置抽真空至0.3mbar，同时温度开始1℃/min升至-25℃，保持2h；二次升华阶段：设置温度开始1℃/min升至0℃，保持2h；终干燥阶段：设置温度1℃/min升至15℃，保持2h，冻干全过程为10h。
冻干当天，溶解冻干粉，进行灵敏度检测，对比产品为：
博尔诚(北京)科技有限公司生产的“B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”国食药监械(准)字2013第3400105号
检测：拿出所需要的冻干管，进行离心1-3分钟，直接加DEPC水20μL，加5μL提取的RNA模板，对比产品按说明书进行操作，ABI7500进行上机检测，程序如下：95℃预变性5min；94℃变性10sec；55℃退火40sec，55℃采集荧光，退回变性阶段，共40个循环。灵敏度检测如图2所示。
样本的来源
B族链球菌(RNA)100例样本来自淮南东方医院集团总医院(安徽理工大学附属医院)；
实时稳定性试验
常温放置1个月，检测结果统计如下表1。
验证结果
选择的临床样本如下：
(1)肠道病毒71型临床样本来自淮南东方医院集团总医院(安徽理工大学附属医院)
(2)B族链球菌临床样本来自淮南东方医院集团总医院(安徽理工大学附属医院)
上述每类临床样本各200份，其中本发明冻干后的体系检测100份临床样本、对比产品检测100份临床样品。
对比产品来源：
北京爱普益生物科技有限公司生产的“肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”国械注准20153401611；
博尔诚(北京)科技有限公司生产的“B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”国食药监械(准)字2013第3400105号。
评估结果：
(1)准确率和CT值分析
本发明的冻干体系对2类临床样本各进行100次的检测，同时与对比产品的检测结果进行比较分析，准确率结果如下表7：
表7稳定性实验结果
A：本发明的体系；
B：对比产品；
C：A和B的CT值显著性(P值)
(2)灵敏度分析
应用本发明的体系对肠道病毒71型和B族链球菌进行灵敏度检测，将肠道病毒71型病毒培养液和B族链球菌培养液进行10倍梯度稀释，检测结果如图2。
上述结果表明，在将本发明的荧光定量核酸诊断试剂体系冻干后，常温放置后再进行临床样本检测，与对比产品进行比较，不论在检出准确率上，还是在CT值的变化上面，都没有显著性差异，而且灵敏度也比较好。本发明研究出的一种可以冻干的检测RNA的荧光定量核酸诊断试剂体系，能实现冷冻干燥，和上市的同类产品相比较，检测时操作简单，只需一步水化就可以实现检测目的，而且能达到现阶段核酸诊断试剂无法达到的常温运输和保存的目的。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
Claims (10)
1.一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂，其特征在于，包括以下组份中的一种或多种：海藻糖、焦磷酸二乙酯处理过的水。
2.根据权利要求1所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂，其特征在于，所述核酸扩增体系的冻干保护剂进一步包括以下组分：蔗糖和/或乳糖。
3.根据权利要求1或2所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂，其特征在于，所述核酸扩增体系的冻干保护剂不包括甘露醇。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述组份按照使用的浓度比混匀，即得到冻干保护剂。
5.一种如权利要求1-3中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将所述组份按照使用的浓度比混匀；
步骤2：冷冻干燥，即得到冻干保护剂。
6.根据权利要求5所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
子步骤1：干燥的步骤；
子步骤2：冻干的步骤；
所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.5-7：13-16.5，所述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
预冻阶段：隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；
一次升华阶段：保持2-4h；
二次升华阶段：保持2-4h；
终干燥阶段：保持2-3h。
7.一种如权利要求1-3中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将用于核酸扩增体系的酶混合液、核酸扩增反应液、低温冻干保护液将按照对应的浓度比混匀，即得到用于核酸扩增体系的组合物；
步骤2：冷冻干燥，即得到冻干状态的用于核酸扩增体系的组合物。
8.根据权利要求7所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
子步骤1：干燥的步骤；
子步骤2：冻干的步骤；
所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.5-7：13-16.5，所述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
预冻阶段：隔板温度下降到-45℃－-55℃，保持时间3-5h；
一次升华阶段：保持2-4h；
二次升华阶段：保持2-4h；
终干燥阶段：保持2-3h。
9.一种包括如权利要求1-3中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒能够在常温下运输和/或保存。
10.一种如权利要求1-3中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂和/或如权利要求4-6中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的制备方法和/或如权利要求7-8中任一项所述应用于核酸扩增体系的冻干保护剂的使用方法，在核酸扩增体系的制备及使用中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510907693.7A CN105349529A (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510907693.7A CN105349529A (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105349529A true CN105349529A (zh) | 2016-02-24 |
Family
ID=55325591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510907693.7A Pending CN105349529A (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105349529A (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119390A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-16 | 济南诺贝莱生物科技有限公司 | 一种基于mgb探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒及其检测方法 |
| CN106591432A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-04-26 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 一种rna扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 |
| CN108070583A (zh) * | 2016-11-07 | 2018-05-25 | 中国动物疫病预防控制中心 | 羟丙基-β-环糊精在制备核酸冷冻干燥保护剂中的用途 |
| CN109337899A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-02-15 | 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 | 一种核酸提取与pcr检测试剂盒 |
| CN109371008A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-02-22 | 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 | 一种核酸提取扩增检测试剂盒及其检测方法 |
| CN109735655A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-05-10 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种能同时检测dna和rna的多重荧光pcr预存冻干试剂 |
| CN110093403A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-08-06 | 融智生物科技（青岛）有限公司 | 荧光pcr试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法 |
| CN111560417A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-21 | 北京中科生仪科技有限公司 | 一种rna扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 |
| CN111893169A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-06 | 济南国益生物科技有限公司 | 一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法 |
| CN113789412A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-12-14 | 上海伯杰医疗科技有限公司 | 一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法 |
| CN114480591A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-05-13 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 一种用于一步法qpcr试剂的冻干保护剂及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101591703A (zh) * | 2008-11-22 | 2009-12-02 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法 |
| CN103911367A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-07-09 | 中国农业大学 | 一种核酸扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 |
| CN103966323A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-08-06 | 广州迪澳生物科技有限公司 | 可常温运输的干粉化恒温扩增检测试剂及其制备方法 |
-
2015
- 2015-12-09 CN CN201510907693.7A patent/CN105349529A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101591703A (zh) * | 2008-11-22 | 2009-12-02 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法 |
| CN103911367A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-07-09 | 中国农业大学 | 一种核酸扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 |
| CN103966323A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-08-06 | 广州迪澳生物科技有限公司 | 可常温运输的干粉化恒温扩增检测试剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 周新丽等: "生物材料冻干保护剂的热分析", 《制冷学报》 * |
| 姚静等: "《药物冻干制剂技术的设计及应用》", 30 June 2007 * |
| 朴英实等: "《分子病理生物学实验技术指南》", 31 May 2015 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119390A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-16 | 济南诺贝莱生物科技有限公司 | 一种基于mgb探针鉴定驴皮、马皮和骡子皮的试剂盒及其检测方法 |
| CN106591432A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-04-26 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 一种rna扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 |
| CN108070583A (zh) * | 2016-11-07 | 2018-05-25 | 中国动物疫病预防控制中心 | 羟丙基-β-环糊精在制备核酸冷冻干燥保护剂中的用途 |
| CN108070583B (zh) * | 2016-11-07 | 2021-03-30 | 中国动物疫病预防控制中心 | 羟丙基-β-环糊精在制备核酸冷冻干燥保护剂中的用途 |
| CN109337899A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-02-15 | 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 | 一种核酸提取与pcr检测试剂盒 |
| CN109371008A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-02-22 | 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 | 一种核酸提取扩增检测试剂盒及其检测方法 |
| CN109735655A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-05-10 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种能同时检测dna和rna的多重荧光pcr预存冻干试剂 |
| CN110093403A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-08-06 | 融智生物科技（青岛）有限公司 | 荧光pcr试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法 |
| CN111560417A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-21 | 北京中科生仪科技有限公司 | 一种rna扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 |
| CN111893169A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-06 | 济南国益生物科技有限公司 | 一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法 |
| CN113789412A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-12-14 | 上海伯杰医疗科技有限公司 | 一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法 |
| CN114480591A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-05-13 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 一种用于一步法qpcr试剂的冻干保护剂及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105349529A (zh) | 一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂 | |
| CN105463125A (zh) | 核酸扩增体系及其冻干保护剂 | |
| BR112021013524A2 (pt) | Agente de liberação de ácido nucleico, método de amplificação em pcr de ácido nucleico, e kit de amplificação em pcr | |
| CN111363858B (zh) | 2019-nCoV S基因检测核酸组合物及试剂盒与生产方法 | |
| JP2009545317A (ja) | 分析物および核酸の検出 | |
| Renaud et al. | Comparison of FilmArray respiratory panel and laboratory-developed real-time reverse transcription–polymerase chain reaction assays for respiratory virus detection | |
| CN105695631A (zh) | 人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用 | |
| CN114507716B (zh) | 检测样品中靶核酸的方法 | |
| CN107653325A (zh) | 用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒 | |
| CN108977580A (zh) | 一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒 | |
| CN110747263A (zh) | 一种冻干添加剂及荧光pcr反应混合物干粉和制备方法 | |
| CN105112558B (zh) | 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒 | |
| CN105483289B (zh) | 一种肠道病毒三重直接荧光rt-pcr的检测试剂盒和反应体系 | |
| CN112779357B (zh) | 人冠状病毒核酸多重检测试剂盒 | |
| WO2021043139A1 (zh) | 获得cfDNA标准品的引物组、PCR扩增阳性标准品及其制备方法、试剂盒及应用 | |
| CN104831000A (zh) | 用于樱桃病毒检测的多重rt-pcr试剂盒及检测方法 | |
| CN101985664B (zh) | 检测a型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒 | |
| CN105525036B (zh) | 一种乙型肝炎病毒hbv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN105803050B (zh) | 检测cho细胞dna的引物及方法 | |
| JP6402905B2 (ja) | 核酸増幅の非特異反応を抑制する新規の方法 | |
| CN104059994B (zh) | 一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法和应用 | |
| CN106701940A (zh) | 一种荧光探针检测血吸虫dna的方法 | |
| CN108300804B (zh) | 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法 | |
| Mohamed et al. | Clinical validation of 3 commercial real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction assays for the detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus from upper respiratory tract specimens | |
| CN109355433A (zh) | 一种汉坦病毒极速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160224 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |