CN111560417A - 一种rna扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法 - Google Patents

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CN111560417A CN202010387723.7A CN202010387723A CN111560417A CN 111560417 A CN111560417 A CN 111560417A CN 202010387723 A CN202010387723 A CN 202010387723A CN 111560417 A CN111560417 A CN 111560417A
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Abstract

本发明公开了一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法，涉及生物技术领域。所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖5‑20％、甘露醇5‑15％、牛血清白蛋白0.5‑5mg/mL、表面活性剂0.05‑0.5％、消泡剂0.01‑0.05％。本发明在实施过程中为冻干试剂中加入了少量的香菇多糖和蔗糖，发现加入之后能够有效的提高冻干试剂的冻干效果，通过控制海藻糖、香菇多糖和蔗糖的浓度比，使冻干后的试剂能够在常温条件下长期保存，冻干试剂在室温条件下存放6个月仍然具有较高的灵敏度。

Description

一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)由美国Centus公司的Kary Mullis发明，于1985年年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫中用于微量样品的检测，但是常规的PCR只能对扩增反应的终产物进行定性和定量的分析，随着技术的进步和研究的深入需要对PCR扩增反应的每一个循环的产物进行定量分析，因此发明了荧光定量PCR。
荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，其原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步；或者使用荧光染料SYBR结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。
由于PCR技术能够使用微量样品快速、定量的检测产物，因此可以应用于多种检测，如：(1)传染病的早期诊断和不完整病原检疫，使用PCR技术可使未形成病毒颗粒的DNA和RNA或样品中病原体破坏后残留核酸分子迅速扩增而测定，且只需提取微量DNA分子就可以测出结果；(2)快速、准确、安全检测病原体，用PCR技术不需经过分离培养和富集病原体，一个PCR反应一般只需几十分钟或2小时就可完成，从样品处理到产物检测，一天之内就可以完成；(3)制备探针和标记探针，PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针；(4)在病原体分类和鉴别中的应用，用PCR技术可以准确鉴别某些比较近似的病原体，此外PCR技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、癌基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。
虽然PCR技术具有比较广泛的用途，但是其反应试剂受温度的影响比较大，不容易保存，因此在保存、运输和使用过程中要求在低温条件下进行，否则试剂容易失效，因此需要对反应试剂进行冻干处理，将试剂制成冻干微球，为了保证冻干后的试剂仍然可以继续使用，因此需要冻干保护剂，尤其保护试剂中的反应酶不被破坏。
目前针对冻干保护剂的报道较多，例如中国专利申请201910208009.4中公开了一种荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。由该冻干保护剂制备得到的荧光PCR冻干制剂可长期常温保存，且复溶速度快。但是该申请是将试剂制成冻干芯片，其使用具有一定的局限性。
又如，中国专利申请201710472385.5中公开了一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法，其中公开了一种低温冻干保护剂，由以下组分组成：海藻糖4-25g、甘露糖醇1-7g、牛血清蛋白1-7g、吐温0.1-0.25g、Tris-HCl2.5-5.0mmol和水49-50mL。但是该申请制备的冻干保护剂的保护效果不佳，试剂保存时间较短。
针对以上问题，制备一种冻干效果好，复溶速率快且使用范围广的RNA扩增反应试剂的冻干保护剂尤为重要，本发明通过合理控制各组分的含量制备得到了一种冻干保护剂，使用该冻干保护剂制备得到的冻干试剂能够长期常温保存。
发明内容
针对现有技术中存在的不足,本发明旨在提供一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖5-20％、甘露醇5-15％、牛血清白蛋白0.5-5mg/mL、表面活性剂0.05-0.5％、消泡剂0.01-0.05％。
优选地，所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖8-18％、甘露醇8-14％、牛血清白蛋白0.8-4mg/mL、表面活性剂0.1-0.4％、消泡剂0.02-0.04％。
再优选地，所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖12-15％、甘露醇12-13％、牛血清白蛋白1-3mg/mL、表面活性剂0.2-0.3％、消泡剂0.02-0.03％。
进一步优选地，所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖12％、甘露醇12％、牛血清白蛋白1mg/mL、表面活性剂0.2％、消泡剂0.024％。
所述的海藻糖与甘露醇的浓度比为0.5-2：1；优选为0.6-1.5：1。
再进一步优选地，所述的冻干保护剂还包括：香菇多糖和蔗糖；所述的蔗糖的浓度为1-5％，所述的香菇多糖的浓度为1-5％。
再优选地，所述的海藻糖、蔗糖和香菇多糖的浓度比为4-12：1：1，优选为5-10：1：1；再优选为5-8：1：1；进一步优选为5:1:1。
所述的表面活性剂为Tween20、Tween80、Span-20、Span-40、Span-60和Span-80中的一种或几种。
所述的消泡剂为SE-15。
其中，所述的RNA扩增反应试剂包括缓冲液、引物、探针、dNTPs、酶和DEPCH2O。
所述的缓冲液为本领域常规缓冲液；
所述的引物包括正向引物和反向引物；
所述的酶为Ribonuclease Inhibitor、DNA polymerase和/或ReverseTranscriptase组成的酶混合液。
本发明还提供了一种使用上述冻干保护剂进行RNA扩增反应试剂微球的方法，包括以下步骤：
(1)制备冻干保护剂：取配方用量的海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、香菇多糖和蔗糖混合均匀；
(2)制备反应试剂：将缓冲液、引物、探针、dNTPs和DEPCH2O混合均匀；
(3)将步骤(1)中制备的冻干保护剂与步骤(2)中制备的反应试剂混合均匀后加入酶混合液，制备成冻干试剂；
(4)吸取步骤(3)中制备的冻干试剂，然后滴入液氮中进行冻干，制成微球，将冻干彻底的微球转移到预冻好的冷冻干燥机中继续冷冻干燥即得到冻干微球成品。
上述步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：放入样品后，隔板温度下降到-45℃－-55℃，冷阱温度下降到-65℃－-75℃，保持0.5-1.5小时；开启真空，真空度为10-15Pa，保持1-3小时；第一次升华阶段：保持真空度为10-15Pa，冷阱温度为-65℃－-75℃，同时温度开始升至-10℃－-12℃，保持时间为15-16小时；第二次升华阶段：继续保持真空度为10-15Pa，冷阱温度为-65℃－-75℃，温度升至15-20℃，保持时间7-8小时。
优选地，上述步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：
冻干阶段 隔板(℃) 冷阱(℃) 真空度(Pa) 时间(hours)
放入样品 -50 -70 Off 1
开启真空 -50 -70 13 2
第一阶段干燥 -46 -70 13 2
-36 -70 13 10
-25 -70 13 2
-10 -70 13 2
第二阶段干燥 0 -70 13 1
20 -70 13 7
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明公开的冻干保护剂通过控制各种试剂的浓度，并控制海藻糖与甘露醇的浓度比能够有效维持冻干过程中试剂的稳定性；
(2)本发明公开的冻干试剂加入了一定浓度的香菇多糖，能够有效的提高冻干试剂的冻干效果，本发明通过控制海藻糖、香菇多糖和蔗糖的浓度比，使冻干后的试剂能够在常温条件下长期保存；
(3)使用本发明制备的冻干保护剂冻干得到的冻干试剂在45℃加速试验3个月仍然具有较高的灵敏度。
附图说明
图1为实施例1制备的反应微球和未冻干试剂的实时PCR扩增曲线；
其中，从左到右模板浓度依次为107、106和105；
图2为实施例1制备的反应微球和对比例1制备的反应微球的实时PCR扩增曲线；
其中，从左到右模板浓度依次为106、105和104；
图3为实施例4制备的反应微球和未冻干试剂的实时PCR扩增曲线；
其中，从左到右模板浓度依次为106、105和104；
图4为实施例4制备的反应微球和对比例2制备的反应微球的实时PCR扩增曲线；
其中，从左到右模板浓度依次为106、105和104；
附图标记：A1表示按照实施例1提供的配方制备的未冻干试剂，B1为按实施例1提供的配方制备的冻干微球，C1表示按对比例1提供的配方制备的冻干微球；A4表示按照实施例4提供的配方制备的未冻干试剂，B4为按实施例4提供的配方制备的冻干微球，C2表示按对比例2提供的配方制备的冻干微球。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施方式对本发明做进一步详细说明。本发明中的试剂均为分子生物学级别，“％”均指质量(体积)百分比。
以下实施例中所用试剂的型号及购买厂家
试剂 厂家 浓度
Taq DNA polymerase TaKaRa 10U/μL
Reverse Transcriptase Invitrogen 200U/μL
Ribonuclease Inhibitor NEB 40U/μL
dNTPs Takara 10mM
SE-15 Sigma
Trehalose Sigma
Mannitol Sigma
实施例1一种RNA扩增反应微球的制备方法
试剂：(体积为500μL)
Figure BDA0002484418430000051
制备方法包括以下步骤：
(1)制备冻干保护剂：取海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、香菇多糖和蔗糖置于容器中混合均匀；
(2)制备反应试剂：将缓冲液、引物、探针和dNTPs置于容器中混合均匀；
(3)将步骤(1)中制备的冻干保护剂与步骤(2)中制备的反应试剂混合均匀后加入酶混合液，制备成冻干试剂；
(4)使用移液枪吸取步骤(3)中制备的冻干试剂，然后一滴滴滴入液氮中进行冻干，制成微球，将冻干彻底的微球转移到预冻好的冷冻干燥机中继续冷冻干燥即得到冻干微球成品。
上述步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：
冻干阶段 隔板(℃) 冷阱(℃) 真空度(Pa) 时间(hours)
放入样品 -50 -70 Off 1
开启真空 -50 -70 13 2
第一阶段干燥 -46 -70 13 2
-36 -70 13 10
-25 -70 13 2
-10 -70 13 2
第二阶段干燥 0 -70 13 1
20 -70 13 7
实施例2一种RNA扩增反应微球的制备方法
试剂：(体积为500μL)
Figure BDA0002484418430000061
Figure BDA0002484418430000071
制备方法包括以下步骤：
(1)制备冻干保护剂：取海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、香菇多糖和蔗糖置于容器中混合均匀；
(2)制备逆转录聚合酶链反应试剂：将缓冲液、引物、探针和dNTPs置于容器中混合均匀；
(3)将步骤(1)中制备的冻干保护剂与步骤(2)中制备的反应试剂混合均匀后加入酶混合液，制备成冻干试剂；
(4)使用移液枪吸取步骤(3)中制备的冻干试剂，然后一滴滴滴入液氮中进行冻干，制成微球，将冻干彻底的微球转移到预冻好的冷冻干燥机中继续冷冻干燥即得到冻干微球成品。
上述步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：
冻干阶段 隔板(℃) 冷阱(℃) 真空度(Pa) 时间(hours)
放入样品 -50 -70 Off 1
开启真空 -50 -70 13 2
第一阶段干燥 -46 -70 13 2
-36 -70 13 10
-25 -70 13 2
-10 -70 13 2
第二阶段干燥 0 -70 13 1
20 -70 13 7
实施例3一种RNA扩增反应微球的制备方法
试剂：(体积为500μL)
Figure BDA0002484418430000072
Figure BDA0002484418430000081
制备方法包括以下步骤：
(1)制备冻干保护剂：取海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、香菇多糖和蔗糖置于容器中混合均匀；
(2)制备逆转录聚合酶链反应试剂：将缓冲液、引物、探针、dNTPs和酶混合均匀；
(3)将步骤(1)中制备的冻干保护剂与步骤(2)中制备的反应试剂混合均匀后加入酶混合液，制备成冻干试剂；
(4)使用移液枪吸取步骤(3)中制备的冻干试剂，然后一滴滴滴入液氮中进行冻干，制成微球，将冻干彻底的微球转移到预冻好的冷冻干燥机中继续冷冻干燥即得到冻干微球成品。
上述步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：
冻干阶段 隔板(℃) 冷阱(℃) 真空度(Pa) 时间(hours)
放入样品 -50 -70 Off 1
开启真空 -50 -70 13 2
第一阶段干燥 -46 -70 13 2
-36 -70 13 10
-25 -70 13 2
-10 -70 13 2
第二阶段干燥 0 -70 13 1
20 -70 13 7
实施例4一种RNA扩增防疫体系反应微球的制备方法
试剂：(体积为500μL)
Figure BDA0002484418430000082
Figure BDA0002484418430000091
制备方法包括以下步骤：
(1)制备冻干保护剂：取海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、香菇多糖和蔗糖置于容器中混合均匀；
(2)制备逆转录聚合酶链反应试剂：将缓冲液、引物、探针和dNTPs混合均匀；
(3)将步骤(1)中制备的冻干保护剂与步骤(2)中制备的反应试剂混合均匀后加入酶混合液，制备成冻干试剂；
(4)使用移液枪吸取步骤(3)中制备的冻干试剂，然后一滴滴滴入液氮中进行冻干，制成微球，将冻干彻底的微球转移到预冻好的冷冻干燥机中继续冷冻干燥即得到冻干微球成品。
上述步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：
冻干阶段 隔板(℃) 冷阱(℃) 真空度(Pa) 时间(hours)
放入样品 -50 -70 Off 1
开启真空 -50 -70 13 2
第一阶段干燥 -46 -70 13 2
-36 -70 13 10
-25 -70 13 2
-10 -70 13 2
第二阶段干燥 0 -70 13 1
20 -70 13 7
对比例1
与实施例1的区别在于：冻干保护剂中海藻糖与甘露醇的浓度比为5：1，即海藻糖的浓度为12.5％，甘露醇的浓度为2.5％；其他操作及步骤与实施例1相同。
对比例2
与实施例4的区别在于：冻干保护剂中海藻糖、蔗糖和香菇多糖的浓度比为0.5：1：1，即海藻糖的浓度为2.8％、蔗糖浓度为5.6％和香菇多糖浓度为5.6％；其他操作及步骤与实施例4相同。
对比例3
与实施例4的区别在于：冻干保护剂中海藻糖、蔗糖和香菇多糖的浓度比为26：1：1，即海藻糖的浓度为13％、蔗糖浓度为0.5％和香菇多糖浓度为0.5％，其他操作及步骤与实施例4相同。
对比例4
与实施例4的区别在于：冻干保护剂只含有海藻糖，其他操作及步骤与实施例4相同。
对比例5
与实施例4的区别在于：冻干保护剂只含有蔗糖和香菇多糖，其他操作及步骤与实施例4相同。
试验例1检测实施例1-4以及对比例1-5制备的冻干微球的完整性
经观察：实施例1-4制备的微球，外观为球形，表面光滑，分散性好，完整性好，大小均匀；
对比例1-5制备的微球，外观为球形，表面较光滑，分散性较好，完整性较好，大小分布不均匀。
试验例2检测实施例1-4以及对比例1-5制备的冻干试剂的稳定性
(1)加速实验方法：
将制备的微球放入西林瓶中，置于温度为45±2℃的环境中放置3周，每7天测试上机一次；测试结果见下表1。
上机检测浓度为107/μL的体外转录RNA，上机程序为：55℃10min；95℃预变性1min；95℃变性10s；60℃退火35s，共40个循环。
表1加速实验测试结果
Figure BDA0002484418430000101
Figure BDA0002484418430000111
根据上表1的检测数据可以看出，本发明实施例1-4制备的冻干试剂微球在55±2℃的环境中放置3周后其检测的Ct值与实施例1-4制备的反应试剂未冻干时(0天)检测的Ct值相比变化不大，说明本发明制备的冻干保护剂能够提高反应试剂的稳定性，冻干试剂可以长期保存；而对比例1-5改变试剂中组分的质量比，或冻干时反应试剂与冻干试剂的质量比不在本发明保护范围内时，其放置3周后其Ct值出现明显变化，说明实施例制备的冻干试剂稳定性较差，不适于长期保存。
(2)常温实验方法：
将制备的微球放入西林瓶重，置于温度为24±2℃的环境中放置6个月，每个月最后一天上机测试一次，测试结果见下表2。
上机检测浓度为107/μL的体外转录RNA，上机程序为：55℃10min；95℃预变性1min；95℃变性10s；60℃退火35s，共40个循环。
表2常温试验检测数据
Figure BDA0002484418430000112
根据上表2的检测数据可以看出，本发明实施例1-4制备的冻干试剂微球在24±2℃的环境中放置6个月后其检测的Ct值与实施例1-4制备的反应试剂未冻干时(0天)检测的Ct值相比变化不大，说明本发明制备的冻干保护剂能够提高反应试剂的稳定性，冻干试剂可以长期保存；而对比例1-5改变试剂中组分的质量比，或冻干时反应试剂与冻干试剂的质量比不在本发明保护范围内时，其放置6个月后其Ct值出现明显变化，说明实施例制备的冻干试剂稳定性较差，不适于长期保存。
试验例3检测实施例1-4以及对比例1-5制备的冻干试剂的灵敏性
检测方法：
上机检测浓度为103-107/μL的体外转录RNA，上机程序为：55℃10min；95℃预变性1min；95℃变性10s；60℃退火35s，共40个循环，测试结果见下表3。
表3
Figure BDA0002484418430000121
根据上表3以及附图2和4的检测结果可以看出，本发明实施例1-4制备的冻干试剂微球上机测试时的灵敏性较对比例1-5灵敏性提高；根据附图1-4的检测结果可以看出本发明制备的冻干试剂微球较未冻干的试剂及对比例制备的试剂检测无明显差异，说明冻干后的试剂稳定性仍较好，可以长期保存。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种RNA扩增反应试剂的冻干保护剂，其特征在于：所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖5-20％、甘露醇5-15％、牛血清白蛋白0.5-5mg/mL、表面活性剂0.05-0.5％、消泡剂0.01-0.05％。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖12-15％、甘露醇12-13％、牛血清白蛋白1-3mg/mL、表面活性剂0.2-0.3％、消泡剂0.02-0.03％。
3.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的冻干保护剂包括以下组分：海藻糖12％、甘露醇12％、牛血清白蛋白1mg/mL、表面活性剂0.2％、消泡剂0.024％。
4.根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的海藻糖与甘露醇的浓度比为0.5-2：1。
5.根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的冻干保护剂还包括：香菇多糖和蔗糖。
6.根据权利要求5所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的蔗糖的浓度为1-5％，所述的香菇多糖的浓度为1-5％。
7.根据权利要求5所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的海藻糖、蔗糖和香菇多糖的浓度比为4-12：1：1。
8.根据权利要求7所述的冻干保护剂，其特征在于：所述的海藻糖、蔗糖和香菇多糖的浓度比为5：1：1。
9.如权利要求1-8任一项所述的冻干保护剂制备RNA扩增反应试剂微球的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备冻干保护剂：取配方用量的海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、香菇多糖和蔗糖混合均匀；
(2)制备反应试剂：将缓冲液、引物、探针、dNTPs和DEPCH20混合均匀；
(3)将步骤(1)中制备的冻干保护剂与步骤(2)中制备的反应试剂混合均匀后加入酶混合液，制备成冻干试剂；
(4)吸取步骤(3)中制备的冻干试剂，然后滴入液氮中进行冻干，制成微球，将冻干彻底的微球转移到预冻好的冷冻干燥机中继续冷冻干燥即得到冻干微球成品。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻干燥机的冻干程序为：放入样品后，隔板温度下降到-45℃－-55℃，冷阱温度下降到-65℃－-75℃，保持0.5-1.5小时；开启真空，真空度为10-15Pa，保持1-3小时；第一次升华阶段：保持真空度为10-15Pa，冷阱温度为-65℃－-75℃，同时温度开始升至-10℃－-12℃，保持时间为15-16小时；第二次升华阶段：继续保持真空度为10-15Pa，冷阱温度为-65℃－-75℃，温度升至15-20℃，保持时间7-8小时。
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