CN112048545B - 一种冻干保护剂、pcr扩增试剂及其冻干方法和应用 - Google Patents

一种冻干保护剂、pcr扩增试剂及其冻干方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物技术诊断检测领域，提供了一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用，该PCR扩增试剂包括扩增反应体系和冻干保护剂；其中，冻干保护剂包括如下组分：甘油、海藻糖、蔗糖、吐温‑80、右旋糖酐‑40、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸钠、抑菌剂、叔丁醇。本发明提供的冻干保护剂，可与荧光PCR需要用到的组分制备在一起，也可搭配任意PCR检测所需引物和探针，并进行冻干以制得PCR扩增试剂；该PCR扩增试剂不仅能够实现常温运输及保存，且在使用时只需用ddH2O溶解，然后加入样本核酸即可，具有操作方便的优点。

Description

一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术诊断检测领域，尤其涉及一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。荧光定量PCR技术是目前诊断检测领域最常使用的检测方法，因为此方法灵敏性高，特异性强，简单快速，可在几小时内出检测结果。其反应的必要条件包括：荧光PCR反应体系、引物和探针。
其中，荧光PCR反应缓冲系统组成成分通常为化学试剂、水，这一类试剂在储存过程中较为稳定；引物、探针、dNTP为通过化学方法合成的试剂，需要低温保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果；Taq酶为通过基因表达方法得到的一种活性蛋白，需要低温保存以保持其活性；若将酶、dNTP、引物探针混合在一起保存，在液体状态下引物探针会结合形成二聚体结构，从而影响扩增效果。
目前市场上荧光定量PCR类产品的组份通常为：PCR反应液，酶，阳性对照和阴性对照。其中，PCR反应液包含荧光PCR反应缓冲系统、引物、探针、dNTP；酶包含Taq酶、UNG酶。这种形式的产品操作方法繁琐，使用前需人为配制，且PCR产品需要冷冻-20℃保存，首先必须先将试剂盒回温，再将反应缓冲液和酶按照试剂盒推荐比例混合均匀再分装至PCR反应管中，然后再加入样本，冻融次数越多，酶活性越容易降解。由于酶的用量通常较少(≤1μL)、为了使酶稳定，酶液内有甘油成分，较粘稠，配制误差较大、反应重复性不好，也容易产生交叉污染。而且试剂需要低温(-20℃以下)保存，产品储存及运输的成本较高。
所以，为了满足临床需求，急需发明一种使用方便、且不需要低温保存及运输的可冻干的荧光PCR检测扩增试剂。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种冻干保护剂，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种冻干保护剂，其包括如下浓度的组分：甘油3～7wt％、海藻糖80～120mg/mL、蔗糖80～120mg/mL、吐温-80 0.3～0.7wt％、右旋糖酐-40 3～7mmol/L、甘氨酸5～15mg/mL、组氨酸5～15mg/mL、谷氨酸钠0.5～1.5wt％、抑菌剂0.1～0.5wt％、叔丁醇0.5～1.5wt％。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：甘油4～6wt％、海藻糖90～110mg/mL、蔗糖90～110mg/mL、吐温-80 0.4～0.6wt％、右旋糖酐-404～6mmol/L、甘氨酸8～12mg/mL、组氨酸8～12mg/mL、谷氨酸钠0.8～1.2wt％、抑菌剂0.1～0.3wt％、叔丁醇0.8～1.2wt％。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述抑菌剂包括甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮；所述甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的质量比为(2～4):1。
本发明实施例的另一目的在于提供一种PCR扩增试剂，其包括扩增反应体系以及上述的冻干保护剂。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述扩增反应体系包括热启动酶、UNG酶和dNTP。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述PCR扩增试剂包括如下浓度的组分：热启动酶0.02～0.06U/μL、UNG酶0.0001～0.0005U/μL、dNTP 150～250μmol/L、甘油3～7wt％、海藻糖80～120mg/mL、蔗糖80～120mg/mL、吐温-80 0.3～0.7wt％、右旋糖酐-40 3～7mmol/L、甘氨酸5～15mg/mL、组氨酸5～15mg/mL、谷氨酸钠0.5～1.5wt％、抑菌剂0.1～0.5wt％、叔丁醇0.5～1.5wt％。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述PCR扩增试剂包括如下浓度的组分：热启动酶0.03～0.05U/μL、UNG酶0.0001～0.0003U/μL、dNTP 180～220μmol/L、甘油4～6wt％、海藻糖90～110mg/mL、蔗糖90～110mg/mL、吐温-80 0.4～0.6wt％、右旋糖酐-40 4～6mmol/L、甘氨酸8～12mg/mL、组氨酸8～12mg/mL、谷氨酸钠0.8～1.2wt％、抑菌剂0.1～0.3wt％、叔丁醇0.8～1.2wt％。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述热启动酶为热启动Taq酶。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述PCR扩增试剂的冻干方法，其包括以下步骤：
取扩增反应体系和冻干保护剂，配制得到PCR扩增试剂；
将PCR扩增试剂置于-30～-20℃的温度下进行于预冻处理1～3h后，再以0.8～1.2℃/min的速率降至-50～-40℃进行冻结处理1～3h；
将冻结处理后PCR扩增试剂置于5～15Pa的真空环境下进行处理1～3h，接着以0.3～0.7℃/min速率升至-40～-35℃保持5～7h后，再以0.3～0.7℃/min速率升至-30～-25℃保持3～5h，然后将PCR扩增试剂的温度升至20～30℃，得到冻干处理后的PCR扩增试剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述冻干方法制得的PCR扩增试剂。
本发明实施例的另一目的在于提供上述PCR扩增试剂在荧光PCR检测中的应用。
本发明实施例提供的一种冻干保护剂，可与荧光PCR需要用到的组分制备在一起，也可搭配任意PCR检测所需引物和探针，并进行冻干以制得PCR扩增试剂；该PCR扩增试剂不仅能够实现常温运输及保存，且在使用时只需用ddH2O溶解，然后加入样本核酸即可。相比于现有技术，该PCR扩增试剂具有以下优点：1、运输和操作方便、稳定可靠。减少使用操作步骤，提高试剂稳定性可靠性；3、实现常温保存及运输，减少运输成本；4、可搭配各种引物探针进行冻干。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的冻干方法的冻干曲线图。
图2为经本发明实施例1提供的冻干方法冻干得到的分装在西林瓶中的PCR扩增试剂的外观图。
图3为经本发明实施例1提供的冻干方法冻干得到的分装在八连管中的PCR扩增试剂的外观图。
图4为阳性样品用不同复溶时间复溶的PCR扩增试剂进行检测的CT值对比图。
图5为各样品用阳性样品用不同复溶时间复溶的PCR扩增试剂进行检测的CT均值对比图。
图6为阳性样品用不同储存时间的PCR扩增试剂进行检测的CT值对比图。
图7为各样品用阳性样品用不同储存时间的PCR扩增试剂进行检测的CT均值对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种可冻干的PCR扩增试剂，其冻干方法包括以下步骤：
S1、配制PCR扩增试剂，使得PCR扩增试剂中各组分的终浓度如下：扩增缓冲液1X，热启动酶0.04U/μL、UNG酶0.0002U/μL、dNTP 200μmol/L、甘油5wt％、海藻糖100mg/mL、蔗糖100mg/mL、吐温-80 0.5wt％、右旋糖酐-40 5mmol/L、甘氨酸10mg/mL、组氨酸10mg/mL、谷氨酸钠1wt％、抑菌剂0.2wt％、叔丁醇1wt％。其中，PCR扩增试剂的溶剂为DEPC水；热启动酶为热启动Taq酶；扩增缓冲液可以采用市售pH为8.3的Tris缓冲液；抑菌剂中包括质量比为3:1的甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮，具体可以采用市售的PC-300Plus，其还有烷基羧酸稳定剂和改性丙二醇溶剂。
S2、将上述配制的PCR扩增试剂按照20μL/管分装到0.2mL的PCR八连管中或分装到西林瓶中。
S3、将分装好的试剂放入已预冷的4℃冻干机中，并置于-25℃的温度下进行预冻处理2h后，再以1℃/min的速率降至-45℃进行冻结处理2h。
S4、将冷阱预冷至-45℃以下，开启真空泵，将冻干机的气压控制到10Pa，以对冻结处理后PCR扩增试剂进行处理2h，接着以0.5℃/min速率将冻干机的温度升至-40℃保持6h后，再以0.5℃/min速率升至-30℃保持4h，然后将冻干机的温度升至25℃，待PCR扩增试剂的温度升至25℃保持2h，即可得到冻干处理后的PCR扩增试剂，其分装到西林瓶中的外观如附图2所示，分装到八连管中的外观如附图3所示，冻干形态尚好。其中，该实施例的具体冻干曲线如附图1所示。本发明实施例通过“冷冻—一次干燥—二次干燥”的分段式升温真空处理，相较于传统的固定温度冻干方法，能够显著加快冻干过程、提高样品的干燥度；在后两段采用二次干燥的方法，25℃干燥，使得样品高于环境温度，能够保证无法在冻干机内部压盖的样品，在冻干完成后取出来盖盖子的过程中不受环境湿度影响，延长冻干粉保存期，保证冻干的稳定性。
实施例2
该实施例提供了一种可冻干的PCR扩增试剂，其冻干方法包括以下步骤：
S1、配制PCR扩增试剂，使得PCR扩增试剂中各组分的终浓度如下：扩增缓冲液1X，热启动酶0.02U/μL、UNG酶0.0001U/μL、dNTP 150μmol/L、甘油3wt％、海藻糖80mg/mL、蔗糖80mg/mL、吐温-80 0.3wt％、右旋糖酐-40 3mmol/L、甘氨酸5mg/mL、组氨酸5mg/mL、谷氨酸钠0.5wt％、抑菌剂0.1wt％、叔丁醇0.5wt％。其中，PCR扩增试剂的溶剂为DEPC水；酶为热启动Taq酶；扩增缓冲液可以采用市售pH为8.3的Tris缓冲液；抑菌剂中包括质量比为2:1的甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮，其还有烷基羧酸稳定剂和改性丙二醇溶剂。
S2、将上述配制的PCR扩增试剂按照20μL/管分装到0.2mL的PCR八连管中；需要说明的是，如果需要大包装，可分装到西林瓶中。
S3、将分装好的试剂放入已预冷的4℃冻干机中，并置于-30℃的温度下进行于预冻处理1h后，再以0.8℃/min的速率降至-50℃进行冻结处理1h。
S4、将冷阱预冷至-50℃以下，开启真空泵，将冻干机的气压控制到5Pa，以对冻结处理后PCR扩增试剂进行处理1h，接着以0.3℃/min速率将冻干机的温度升至-40℃保持5h后，再以0.3℃/min速率升至-30℃保持3h，然后将冻干机的温度升至20℃，待PCR扩增试剂的温度升至20℃保持2h，即可得到冻干处理后的PCR扩增试剂。
实施例3
该实施例提供了一种可冻干的PCR扩增试剂，其冻干方法包括以下步骤：
S1、配制PCR扩增试剂，使得PCR扩增试剂中各组分的终浓度如下：扩增缓冲液1X，热启动酶0.06U/μL、UNG酶0.0005U/μL、dNTP 250μmol/L、甘油7wt％、海藻糖120mg/mL、蔗糖120mg/mL、吐温-80 0.7wt％、右旋糖酐-40 7mmol/L、甘氨酸15mg/mL、组氨酸15mg/mL、谷氨酸钠1.5wt％、抑菌剂0.5wt％、叔丁醇1.5wt％。其中，PCR扩增试剂的溶剂为DEPC水；酶为热启动Taq酶；扩增缓冲液可以采用市售pH为8.3的Tris缓冲液；抑菌剂中包括质量比为4:1的甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮，其还有烷基羧酸稳定剂和改性丙二醇溶剂。
S2、将上述配制的PCR扩增试剂按照20μL/管分装到0.2mL的PCR八连管中；需要说明的是，如果需要大包装，可分装到西林瓶中。
S3、将分装好的试剂放入已预冷的4℃冻干机中，并置于-20℃的温度下进行于预冻处理3h后，再以1.2℃/min的速率降至-40℃进行冻结处理3h。
S4、将冷阱预冷至-40℃以下，开启真空泵，将冻干机的气压控制到15Pa，以对冻结处理后PCR扩增试剂进行处理3h，接着以0.7℃/min速率将冻干机的温度升至-35℃保持7h后，再以0.7℃/min速率升至-25℃保持5h，然后将冻干机的温度升至30℃，待PCR扩增试剂的温度升至30℃保持2h，即可得到冻干处理后的PCR扩增试剂。
实施例4
该实施例提供了一种可冻干的PCR扩增试剂，其冻干方法包括以下步骤：
S1、配制PCR扩增试剂，使得PCR扩增试剂中各组分的终浓度如下：扩增缓冲液1X，热启动酶0.03U/μL、UNG酶0.0001U/μL、dNTP 180μmol/L、甘油4wt％、海藻糖90mg/mL、蔗糖90mg/mL、吐温-80 0.4wt％、右旋糖酐-40 4mmol/L、甘氨酸8mg/mL、组氨酸8mg/mL、谷氨酸钠0.8wt％、抑菌剂0.1wt％、叔丁醇0.8wt％。其中，PCR扩增试剂的溶剂为DEPC水；酶为热启动Taq酶；扩增缓冲液可以采用市售pH为8.3的Tris缓冲液；抑菌剂中包括质量比为3:1的甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮，具体可以采用市售的PC-300Plus，其还有烷基羧酸稳定剂和改性丙二醇溶剂。另外，PCR扩增试剂中还可以根据实际需求添加引物和探针。
S2、将上述配制的PCR扩增试剂按照20μL/管分装到0.2mL的PCR八连管中；需要说明的是，如果需要大包装，可分装到西林瓶中。
S3、将分装好的试剂放入已预冷的4℃冻干机中，并置于-25℃的温度下进行于预冻处理2h后，再以1℃/min的速率降至-45℃进行冻结处理2h。
S4、将冷阱预冷至-45℃以下，开启真空泵，将冻干机的气压控制到10Pa，以对冻结处理后PCR扩增试剂进行处理2h，接着以0.5℃/min速率将冻干机的温度升至-40℃保持6h后，再以0.5℃/min速率升至-30℃保持4h，然后将冻干机的温度升至25℃，待PCR扩增试剂的温度升至25℃保持2h，即可得到冻干处理后的PCR扩增试剂。
实施例5
该实施例提供了一种可冻干的PCR扩增试剂，其冻干方法包括以下步骤：
S1、配制PCR扩增试剂，使得PCR扩增试剂中各组分的终浓度如下：扩增缓冲液1X，热启动酶0.05U/μL、UNG酶0.0003U/μL、dNTP 220μmol/L、甘油6wt％、海藻糖110mg/mL、蔗糖110mg/mL、吐温-80 0.6wt％、右旋糖酐-40 6mmol/L、甘氨酸12mg/mL、组氨酸12mg/mL、谷氨酸钠1.2wt％、抑菌剂0.3wt％、叔丁醇1.2wt％。其中，PCR扩增试剂的溶剂为DEPC水；酶为热启动Taq酶；扩增缓冲液可以采用市售pH为8.3的Tris缓冲液；抑菌剂中包括质量比为3:1的甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮，具体可以采用市售的PC-300Plus，其还有烷基羧酸稳定剂和改性丙二醇溶剂。另外，PCR扩增试剂中还可以根据实际需求添加引物和探针。
S2、将上述配制的PCR扩增试剂按照20μL/管分装到0.2mL的PCR八连管中；需要说明的是，如果需要大包装，可分装到西林瓶中。
S3、将分装好的试剂放入已预冷的4℃冻干机中，并置于-25℃的温度下进行于预冻处理2h后，再以1℃/min的速率降至-45℃进行冻结处理2h。
S4、将冷阱预冷至-45℃以下，开启真空泵，将冻干机的气压控制到10Pa，以对冻结处理后PCR扩增试剂进行处理2h，接着以0.5℃/min速率将冻干机的温度升至-40℃保持6h后，再以0.5℃/min速率升至-30℃保持4h，然后将冻干机的温度升至25℃，待PCR扩增试剂的温度升至25℃保持2h，即可得到冻干处理后的PCR扩增试剂。
实验例：
一、试验材料
1、实施例1得到的冻干处理后的PCR扩增试剂；
2、不同类型阳性核酸样品；阳性标准品，初始病毒含量5.8×103，stepone plus仪器测定CT值24.32。
二、试验方法与结果
1、稳定性重复性实验
1.1、将上述实施例1冻干得到的装在八连管中的PCR扩增试剂置于常温储存0d、7d、14d、28d后，再用20μL/T的ddH2O进行复溶，并分别用于荧光PCR检测阳性标准品、血样、组织样和唾液，其检测得到的CT值如表1、图4～5所示。
表1
Figure BDA0002675864470000101
1.2、将上述实施例1冻干得到的装在西林瓶中的PCR扩增试剂用ddH2O进行复溶后，再置于-20℃储存0d、7d、14d、28d，储存后分别用于荧光PCR检测阳性标准品、血样、组织样和唾液，其检测得到的CT值如表2、图6～7所示。
表2
Figure BDA0002675864470000102
Figure BDA0002675864470000111
1.3、将上述实施例1冻干得到的装在八连管和西林瓶中的PCR扩增试剂置于37℃温度下储存3d、7d后，再用ddH2O进行复溶，并分别用于荧光PCR检测阳性标准品、血样、组织样和唾液，其检测得到的CT值如表3所示。
表3
Figure BDA0002675864470000112
从上表1～3可以看出，本发明实施例提供的PCR扩增试剂经过冻干处理后仍然保持着优良的稳定性、重复性以及耐老化性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
取扩增反应体系和冻干保护剂，配制得到PCR扩增试剂；
将PCR扩增试剂置于-30~-20℃的温度下进行预冻处理1~3h后，再以0.8~1.2℃/min的速率降至-50~-40℃进行冻结处理1~3h；
将冻结处理后PCR扩增试剂置于5~15Pa的真空环境下进行处理1~3h，接着以0.3~0.7℃/min速率升至-40~-35℃保持5~7h后，再以0.3~0.7℃/min速率升至-30~-25℃保持3~5h，然后将PCR扩增试剂的温度升至20~30℃，得到冻干处理后的PCR扩增试剂；
所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：甘油3~7wt%、海藻糖80~120mg/mL、蔗糖80~120mg/mL、吐温-80 0.3~0.7wt%、右旋糖酐-40 3~7mmol/L、甘氨酸5~15mg/mL、组氨酸5~15mg/mL、谷氨酸钠0.5~1.5wt%、抑菌剂0.1~0.5wt%、叔丁醇0.5~1.5wt%。
2.根据权利要求1所述的一种PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：甘油4~6wt%、海藻糖90~110mg/mL、蔗糖90~110mg/mL、吐温-80 0.4~0.6wt%、右旋糖酐-40 4~6mmol/L、甘氨酸8~12mg/mL、组氨酸8~12mg/mL、谷氨酸钠0.8~1.2wt%、抑菌剂0.1~0.3wt%、叔丁醇0.8~1.2wt%。
3.根据权利要求1或2所述的一种PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于，所述抑菌剂包括甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮；所述甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的质量比为(2~4):1。
4.根据权利要求1所述的一种PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于，所述扩增反应体系包括热启动酶、UNG酶和dNTP。
5.根据权利要求4所述的一种PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括如下浓度的组分：热启动酶0.02~0.06U/μL、UNG酶0.0001~0.0005U/μL、dNTP 150~250μmol/L、甘油3~7wt%、海藻糖80~120mg/mL、蔗糖80~120mg/mL、吐温-80 0.3~0.7wt%、右旋糖酐-40 3~7mmol/L、甘氨酸5~15mg/mL、组氨酸5~15mg/mL、谷氨酸钠0.5~1.5wt%、抑菌剂0.1~0.5wt%、叔丁醇0.5~1.5wt%。
6.根据权利要求4所述的一种PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括如下浓度的组分：热启动酶0.03~0.05U/μL、UNG酶0.0001~0.0003U/μL、dNTP 180~220μmol/L、甘油4~6wt%、海藻糖90~110mg/mL、蔗糖90~110mg/mL、吐温-80 0.4~0.6wt%、右旋糖酐-40 4~6mmol/L、甘氨酸8~12mg/mL、组氨酸8~12mg/mL、谷氨酸钠0.8~1.2wt%、抑菌剂0.1~0.3wt%、叔丁醇0.8~1.2wt%。
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