KR102021605B1 - 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법 - Google Patents

다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조 하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 동결건조물에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 높은 농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 동결건조에 매우 효과적이다. 본 발명에 의해 제공되는 동결건조물은 특이도 및 민감도 측면에서 모두 우수한 특성을 나타내며, 동결건조전 액상 제형과 동등한 능력을 나타낼 뿐만 아니라, 놀라운 저장 안정성을 보인다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 동결건조물은 진단분야에 매우 유용하다.

Description

다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법
본 발명은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조 하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 동결건조물에 관한 것이다.
분자진단은 일반적으로 환자의 감염원, 유전병, 암 또는 유전자 변이 등을 측정하기 위한 핵산의 분석을 의미한다. 분자진단은 혈액, 뇨, 타액 등 인체에서 유래된 샘플에서 특정 유전물질의 검출 또는 정량을 통하여 질병 또는 병원체의 유무, 또는 유전질환 등의 발병 가능성을 진단한다. 분자진단 프로세스는 대체적으로 핵산 샘플의 체외 증폭을 수반하며, PCR 및 real-time PCR은 지금까지 핵산 샘플의 체외 증폭 방법으로 가장 많이 사용되는 방법이다.
중합효소 연쇄반응(이하,“PCR"이라 한다)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링 및 핵산 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다 (Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354). PCR에 이용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 DNA 주형의 반대쪽 가닥에 어닐링 되도록 디자인된다. 핵산 중합효소에 의해 프라이머는 연장되며 그 연장 생성물은 다음 과정에서 다른 프라이머를 위한 주형 가닥으로 작용한다. PCR 증폭 과정은 DNA 단편의 지수적 증가를 초래한다. 전통적인 PCR을 수행하기 위하여는 기본적으로 두 개의 프라이머, 폴리머라제 효소 및 증폭 대상 핵산 주형이 필요하다.
핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 이용되는 다양한 방법에서 필수적인 과정이며, 이에 다양한 증폭 방법이 제시되었다. PCR 외에 핵산을 증폭하기 위한 다른 방법으로는 LCR(Ligase Chain Reaction), GLCR(gap filling LCR), Q-beta(Q-beta replicase amplification), SDA(Strand Displacement Amplification), 3SR(self-sustained sequence replication), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification) 또는 RCA(Rolling-Circle Amplification) 등의 방법이 알려져 있다.
전형적인 PCR 방법에 대하여 새롭고 발전된 방법이 제안되었다. 멀티플렉스 PCR은 하나의 반응을 통하여 동시에 복수의 타겟을 증폭하기 위하여 개발되었으며, 실시간 PCR은 실시간으로 타겟 핵산의 증폭 반응을 정성적, 정량적으로 분석하기 위하여 개발되었다.
실시간 PCR은 타겟 핵산의 증폭이 증폭 반응의 측정과 함께 실시간으로 이루어져 타겟 핵산을 검출하는 PCR 기반의 기술 중 하나이다.
전형적인 PCR 기술에 의하면, 증폭이 종료된 후 반응 결과물을 꺼내어, 타겟 핵산의 존재 또는 농도를 측정하였다. 이와는 다르게, 실시간 PCR 기술은 타겟 핵산의 존재 또는 농도를 실시간으로 측정할 수 있다. 실시간 PCR 기술은 일반적으로 타겟 핵산과 혼성화하는 표지된 프로브를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산의 혼성화 방법과 관련된 기술로는 Molecular beacon 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology 14:303 (1996)), Hybridization probe 방법(Bernad et al, Clin Chem 46:147 (2000)) 및 Lux 방법(U.S. Pat. No. 7,537,886) 등이 있다. TaqMan 방법은 이중 표지된 프로브의 혼성화 및 DNA 폴리머라제의 5’nuclease 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용하는 방법으로 당업계에서 널리 이용되고 있는 방법이다(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호). 이러한 실시간 검출 방법은 증폭반응과 검출을 하나의 튜브에서 수행 하는 homogeneous 분석법으로, 추가적인 조작이 필요 없으며, carry-over 오염 가능성이 없다.
효소는 실온의 수용액 상태에서는 불안정하다. 따라서 동결상태로 보관하거나, 액체상태로 -20℃에서 안정화제 등을 이용하여 보관한다. 이러한 보관 방법에도 불구하고, 사용시 잦은 해동 및 상온에서의 취급에 의해 활성이 낮아진다.
프라이머는 실온의 수용액 상태에 보관되면 다른 프라이머와 부분적 결합(partial annealing)을 통하여 프라이머 다이머를 형성할 수 있다. PCR 반응용액 혼합물을 실온에 방치한 후 약 30분이 경과하면, 특이적인 PCR 산물의 형성이 저해되며, 때로는 목적하는 산물이 전혀 형성될 수 없는 상태가 된다. 또한 수 시간 내지 수 일 동안 실온에 방치하는 경우 특이적인 PCR 산물이 전혀 형성되지 않게 된다.
한편 현재 대부분의 PCR 기반 진단제품은 액상 시약 형태로 제공되며, 보관은 -20℃에 보관 되어야 한다. 따라서, 보관 및 유통을 위하여 많은 비용이 소요된다.
또한 다양한 진단기술에 적용되고 있는 PCR 기술은 매우 정교한 테크닉을 요구한다. 전통적인 PCR 방법은 다수의 마이크로튜브 또는 멀티웰 플레이트에 프라이머, 폴리머라제, dNTP, 반응버퍼, 염화마그네슘 등을 단계별로 투여하여 혼합물을 제조하고, 각 튜브마다 증폭대상 핵산 주형을 첨가하여 반응시킨다. 폴리머라제 및 dNTP 등 일부 시약은 -20℃에 보관하여야 하며, 프로브, 프라이머 등 나머지 시약들도 냉소 보관 하여야 한다. PCR 기반의 진단 실험은 이와 같이 엄격한 보관 및 취급이 요구되는 다양한 시약을 각각 미량 분주하는 것이 필요하다. 이와 같이, PCR을 응용한 분자진단 방법은 복잡하고 매우 정교한 단계에 따라 수행되어야 하므로 그 방법을 실행하기 위하여는 매우 숙련된 기술자의 기술을 필요로 하며, 위와 같은 방법을 실행하는 과정에서 실험상 오류로 인하여 위음성 결과가 나오기도 하고, carry-over 오염에 의해 위양성 결과가 나오기도 한다.
이러한 단점을 극복하기 위하여 PCR master mix의 건조된 형태가 개발되었다. 건조 기술은 크게 두 가지로 구분된다. 첫 번째로 대기압 조건에서 실온 또는 고온으로 건조하는 자연건조(air drying) 방법이 있으며, 두 번째로 시료를 동결시킨 후 용매 분자를 동결된 시료로부터 액체상태를 통하지 않고, 승화를 통하여 제거하는 동결건조(lyophilization) 방법이 있다. 동결건조 기술은 건조전 동결과정 및 건조 과정을 포함하며, 이로서 고체상태에서 바로 수분을 제거하여 건조에 따른 구조적 변형을 최소화한다.
동결건조는 우선 액상의 용액을 얼리는 과정이 필요하며, 바람직하게는 급속 냉동(quick-frozen)방법에 의한다. 동결된 샘플은 고진공(high vacuum) 공정을 통하여 빙점 이하에서 냉동상태의 용매를 승화시킨다(1차 건조). 이후 온도를 점차 상승시켜 잔량의 용매를 추가로 제거한다(2차 건조). 그 결과 동결건조된 산물은 건조된 결정 또는 분말 상태가 된다. 최종 동결건조된 산물은 통상 동결된 물질과 동일 모양 및 크기의 다공성 케이크(cake) 형태로 만들어진다.
동결건조 제품의 특징은 케이크의 형태 및 구조에 영향을 받으므로, 높은 품질의 동결건조물을 얻기 위하여는 케이크의 형태 및 구조가 양호하여야 한다. 붕괴된 케이크는 재구성(재수화) 하여 활성을 복원하는 것이 어렵거나 불가능 할 수 있으므로 동결건조 케이크는 붕괴되지 않아야 한다. 또한 케이크의 물리적 구조는 너무 느슨하거나 연하지 않아야 한다.
동결건조된 물질은 동결건조 대상 물질의 성질, 동결건조 프로세스에 따라 동결건조 산물의 안정성 및 재구성시 활성이 크게 변한다. 성공적인 동결건조를 위하여 동결건조 대상 물질에 따라 다양한 안정화제, 안정화 방법 등이 개발되었다. Frank 등은 항동해제(cryoprotectant)로 탄수화물을 사용하여 물질의 안정성 및 저장성을 향상시키는 것에 관하여 개시하고 있다(미국 특허 5,098,893). 그러나 상기 방법의 건조 과정은 대기압에 가까운 압력조건에서 상온 또는 가온 상태로 이루어진다. 1980년대 초반 American Type Culture Collection은 항동해제로 락토오스가 포함된 동결건조 DNA를 판매하였다. Roser는 자유 아미노기(free amino), 이미노기(imino), 또는 구아니디노기 측쇄(guanidino side chains)을 가지는 생물학적 샘플에 비환원 탄수화물 첨가제 및 밀라드 반응(Maillard reaction)의 저해제를 첨가하여 자유 아미노기와 반응성 카르보닐 그룹의 응집을 막아 안정화 시키는 방법에 대하여 개시하고 있다(미국 특허 5,955,448). De Luca 등은 셀로비오스를 안정화제로 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 동결건조 조성물을 개시하고 있다(미국 공개공보 2012/0064536). Perry 등은 글리세롤이 실질적으로 포함되지 아니한 것을 특징으로 하며, 형광 염료가 결합된 뉴클레오티드 및 Taq DNA 폴리머라제를 포함하는 건조 조성물을 개시하고 있다(미국 특허 7,407,747). 또한 Rajeev 등은 수크로스 및 글리신을 첨가제로 포함하는 로타바이러스 백신 동결건조 조성물을 개시하고 있으며(미국 특허 8,795,686), Fumitomo 등은 첨가제로 트레할로스, 핵산 및 금속염을 포함하는 역전사효소 동결건조 조성물을 개시하고 있다(미국 특허 5,935,834).
실시간 검출 방법은 증폭을 위한 프라이머 뿐만 아니라, 검출을 위한 표지된 프라이머 또는 프로브를 필요로 한다. 멀티플렉스 PCR용 PCR 반응 혼합물은 복수의 타겟을 동시에 증폭시키기 위한 적어도 2쌍의 프라이머를 포함한다. 멀티플렉스 PCR과 같은 복수 타겟 핵산 증폭을 위한 조성물에는 타겟 수에 비례하여 올리고뉴클레오티드가 높은 비율 또는 농도로 포함된다. 복수의 타겟을 동시에 검출하기 위하여, 실시간 PCR 기술 및 멀티플렉스 PCR 기술이 결합된 실시간 다중 중합효소 연쇄반응(real-time multiplex PCR) 기술이 개발되었다.
고농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 동결건조 케이크가 잘 형성되지 않는 문제가 있다. 만일 동결건조 케이크가 형성이 되어도, 바람직하지 않은 모양과 구조의 동결건조 케이크가 만들어 지는 문제가 발생한다.
따라서 고농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 증폭반응용 조성물을 동결건조 할 수 있는 새로운 방법이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이러한 배경에서, 본 발명자들은 올리고뉴클레오티드의 농도가 높아지는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 안정적으로 동결건조 하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력 하였다. 본 발명자들은 동결건조를 위하여 추가되는 각종 첨가제의 종류 및 농도를 조절하거나, 동결건조 시간, 온도 등 동결건조 조건을 조절함으로써 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조하기 위한 최적의 조건을 확립하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 고농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 동결건조를 위하여 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 사용하는 경우 동결건조 케이크의 형성이 안정적으로 이루어지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 동결건조용 제형을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조 하기 위한 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
전술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) (i) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 (ii) 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 제형을 제공하는 단계 및 (b) 상기 제형을 동결건조 하는 단계를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 제공한다.
또한 본 발명은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 동결건조용 제형을 제공한다.
또한 본 발명은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조 하기 위한 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제의 용도를 제공한다.
Ⅰ. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법을 제공한다.
(a) (i) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 (ii) 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 제형을 제공하는 단계; 및
(b) 상기 제형을 동결건조 하는 단계.
본 발명자들은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 안정적으로 동결건조 하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자들은 동결건조를 위하여 추가되는 각종 첨가제의 종류 및 농도를 조절하거나, 동결건조 시간, 온도 등 동결건조 조건을 조절하여 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 위한 최적의 동결건조 방법을 모색하였다. 본 발명자들은 고농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 동결건조를 위하여 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 사용하는 경우 동결건조 케이크의 형성이 안정적으로 이루어지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 동결건조 케이크 형성에서의 문제가 올리고뉴클레오티드의 농도가 높아지면 빈번하게 나타나는 것을 처음으로 밝혀내었다. 본 발명은 이러한 문제를 폴리소르베이트를 첨가제로 사용하는 것으로 해결하는 새로운 접근법을 제공한다.
이하, 본 발명의 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a): (i) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 (ii) 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형의 제공
본 발명의 방법에 따르면, 우선 상기 (a) 단계에서는 (i) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 (ii) 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “제형”(formulation)은 화합물, 원소, 분자와 같은 성분(compound)이 둘 이상 혼합된 혼합물을 의미한다. 본 발명의 제형은 동결건조용 제형이다. 상기 제형은 고형 제형 및 액상 제형을 포함하며, 특히 액상 제형(liquid formulation)일 수 있다. 상기 액상 제형은 액체 상태의 제형을 의미한다. 상기 액상 제형은 모든 종류의 용액, 고형 파티클이 액상에 분산된 현탁액 및 이들의 조합, 액체 방울(liquid droplets)이 액체에 분산된 에멀젼 또는 시럽을 포함한다. 상기 액체는 친수성 또는 친유성일 수 있다. 용액(solution)은 본 액상 제형 (liquid formulation)의 일 구현예이다.
제형은 동결건조 대상물인 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물(composition) 및 폴리소르베이트가 포함된 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 제형을 제공하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 상기 제형은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 첨가제를 각각 제조하여 혼합하는 방법으로 제공될 수 있으며, 상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 첨가제에 포함되는 구성 물질을 함께 혼합하는 방법으로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물”은 동결건조될 대상물을 의미하며, 타겟 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 효소(예컨대, 핵산 중합 효소, 핵산 절단 효소, 절단효소활성을 가지는 중합효소 등) 및 기타 증폭 반응에 필요한 다른 성분(프로브, 완충제, 금속 이온, dNTP, 염 등)을 포함할 수 있으며, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟”, “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열”또는 “타겟 서열”은 증폭 및/또는 검출하고자 하는 핵산서열을 의미한다. 타겟 핵산서열은 이중 가닥뿐 만 아니라 단일 가닥을 포함하며, 분석하고자 하는 시료 내에 처음부터 존재하는 경우뿐 만 아니라, 반응 과정에서 새롭게 생성되는 서열도 타겟 핵산서열이 될 수 있다.
타겟 핵산서열은 DNA(gDNA 또는 cDNA), RNA 또는 그들의 혼성체(키메라 핵산)일 수 있다. 상기 분자는 이중쇄 또는 단일쇄 형태일 수 있다. 출발 물질로서의 핵산이 이중쇄인 경우, 두쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리를 이루기 위한 일반적인 방법들은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
mRNA가 타겟 핵산서열인 경우에는, 역전사 단계가 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고 dT 프라이머를 사용하거나, 랜덤 프라이머 혹은 타겟 특정적인 프라이머가 이용된다.
타겟 핵산서열은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 상기 핵산서열은 자연적으로 유도되거나, 재조합에 의해 생성(recombinantly produced), 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 따라서, 타겟 핵산서열은 자연적으로 발생된 것뿐 만 아니라 인위적인 핵산서열들을 포함하며, 알려진 서열이나 알려지지 않은 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “다중타겟 핵산서열 증폭반응”(multiple target nucleic acid sequence amplification reaction)은 둘 이상의 타겟 핵산서열을 하나의 반응용기에서 동시에 증폭하는 반응을 의미한다.
타겟 핵산서열을 증폭하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction (PCR)), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction, Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호), GLCR (gap filling LCR, WO 90/01069, 유럽특허 제439,182호 및 WO 93/00447), Q-beta (Q-beta replicase amplification, Cahill P, et al., Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), 미국특허 제5,556,751호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification (SDA), Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); 유럽특허 제497,272호), 염기순서기반증폭(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991)), 전사 매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA), Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); 미국특허 제5,888,779호), 또는 롤링서클 증폭(rolling circle amplification, RCA; Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:1733217336(2005))일 수 있다. 본 발명의 증폭반응은 상기 기재된 다양한 방법에 의한 증폭반응을 모두 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 타겟 핵산서열의 증폭 방법은 중합효소연쇄반응(PCR) 방법이다.
본 발명의 일 구현예에 다르면, 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함한다.
본 발명의 효소는 핵산 중합효소, 핵산 절단효소, 핵산 절단효소 활성을 가지는 핵산 중합효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 효소일 수 있다. 상기 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소일 수 있으며, 일반적인 핵산 중합효소, 호열성 핵산 중합효소, 재조합 핵산 중합효소, 변형된 핵산 중합효소 또는 핫 스타트(hot start) 핵산 중합효소일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 다중타겟 핵산서열 증폭반응에 필요한 핵산서열의 집합을 말하는 것으로 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 핵산서열 증폭에 필요한 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머(primer)는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오티드와 핵산 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 프라이머 쌍을 포함한다. 특히 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물에 포함된 올리고뉴클레오티드는 적어도 3개, 4개 또는 5개 이상의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 적어도 3개, 4개 5개 이상의 프라이머 쌍을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 최소 3개 이상의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 최소 3쌍 이상의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함한다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도의 길이를 가져야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 이에 의하여 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 프라이머는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오티드(DPO, dual priming oligonucleotide) 구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이도를 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 증폭을 위한 프라이머에 추가하여 검출에 필요한 추가적인 올리고뉴클레오티드(e.g. 프로브, 내부 컨트롤(internal control)용 핵산 서열)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프로브(probe)는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자이다.
바람직하게는, 프라이머 및 프로브는 디옥시리보뉴클레오티드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머 및 프로브는 자연(naturally occurring) dNMPs(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오티드 또는 비-자연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 및 프로브는 PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 또는 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 WO 98/22489, WO 98/39352 및 WO 99/14226호)를 포함할 수 있다.
타겟 핵산서열은 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 첨가제를 포함하는 본 발명의 제형은 최소한 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 21μM, 22 μM, 23 μM, 24 μM, 25 μM, 26 μM, 27 μM, 28 μM, 29 μM 또는 30 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 제형은 최대 10 mM, 1 mM, 500 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM 또는 50 μM 이하의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 제형은 2 μM 내지 10 mM, 2 μM 내지 1 mM, 2 μM 내지 500 μM, 2 μM 내지 100 μM, 2 μM 내지 90 μM, 2 μM 내지 80 μM, 2 μM 내지 70 μM, 2 μM 내지 60 μM, 2 μM 내지 50 μM, 3 μM 내지 50 μM, 4 μM 내지 50 μM 또는 5 μM 내지 50 μM의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 상기 기재한 효소 및 올리고뉴클레오티드 외에 증폭반응에 필요한 다른 성분을 포함할 수 있다.
단백질, 핵산 등 생물학적 활성 물질은 협소한 pH 범위에서 최적의 안정성을 나타낸다. 따라서 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 제조하기 위하여 최적의 활성을 위한 적정 pH를 유지시키기 위하여 완충제(buffering agent)가 필요하다.
본 발명에서 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 증폭반응을 위한 적절한 완충제를 포함할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 아니하나 예를 들어, 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, HEPES, 아미노산 또는 이들의 혼합물 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 트리스, 특히 트리스 염산염(Tris-HCl) 버퍼를 포함할 수 있다.
택일적으로 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 완중제를 포함하지 않을 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물은 단계 (a)에서 완충제가 포함되지 아니한 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물이 사용되는 경우 월등히 높은 안정성을 나타내었다.
본 발명의 조성물은 효소가 적절한 활성을 보일 수 있게 하기 위하여 보조인자(cofactor)로서 금속 2가 이온을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 MgCl2를 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 그 외 dNTP, 각종 염을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “첨가제”는 상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조를 위하여 추가되는 물질 또는 물질들의 집합을 의미한다.
한편 본 발명의 첨가제는 폴리소르베이트를 포함한다. 본 발명자들은 폴리소르베이트가 높은 농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 성공적으로 동결건조 하는데 상당히 유용하다는 것을 발견하였고, 이는 본 발명 명세서에서 최초로 공개되는 것이다.
폴리소르베이트는 의약 또는 식품 분야의 첨가제로 사용되는 계면활성제 또는 유화제의 일종이다. 폴리소르베이트는 지방산과 에스테르 결합을 한, 페길화된(PEGylated) 소르비탄에서 유래한다. 폴리소르베이트는 CanarcelTM, AlkestTM, TweenTM 등의 상업 브랜드 이름으로도 불린다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 또는 폴리소르베이트 80일 수 있다. 어미의 숫자는 결합된 지방산의 종류를 의미하는 것으로, 20은 모노라우레이트, 40은 모노팔미테이트, 60은 모노스테아레이트를 의미하며, 80은 모노올레이트를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20이며, 상기 폴리소르베이트 20은 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate) 또는 트윈20(Tween 20)이라고 불린다.
상기 폴리소르베이트의 농도는 동결건조 대상인 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 내의 올리고뉴클레오티드의 농도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 본 발명 제형은 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 적어도 0.0012%(w/v), 0.0013%(w/v), 0.0014%(w/v), 0.0015%(w/v), 0.0025 %(w/v) 또는 0.005 %(w/v) 이상의 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명 제형은 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.05%(w/v) 이하의 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명 제형은 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012-0.9 %(w/v), 0.0012-0.8 %(w/v), 0.0012-0.7 %(w/v), 0.0012- 0.6 %(w/v), 0.0012-0.5 %(w/v), 0.0012-0.4 %(w/v), 0.0012-0.3 %(w/v), 0.0012-0.2 %(w/v), 0.0012-0.1 %(w/v) 또는 0.0012-0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트를 포함할 수 있으며, 특히 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012-0.5 %(w/v), 0.0012-0.1 %(w/v) or 0.0012-0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.
또한, 폴리소르베이트의 농도는 올리고뉴클레오티드 외 다른 성분에 따라서도 달리질 수 있다. 예를 들어 폴리소르베이트는 제형에 0.01 %(w/v), 0.02 %(w/v) 또는 0.05 %(w/v) 이상의 비율로 포함될 수 있다. 폴리소르베이트는 제형에 10 %(w/v), 9 %(w/v), 8 %(w/v), 7 %(w/v), 6 %(w/v), 5 %(w/v), 4 %(w/v), 3 %(w/v), 2 %(w/v), 1 %(w/v) 또는 0.5 %(w/v)이하의 비율로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 첨가제에는 폴리소르베이트 외에 동결건조를 위한 다른 물질이 포함될 수 있다. 예를 들어 상기 첨가제는 계면활성제 및/또는 항동해제가 포함될 수 있다.
항동해제(Cryoprotectant)는 동결건조 진행 과정 동안 단백질 등의 구조를 유지하는 등의 역할을 하는 물질을 말한다. 상기 항동해제로는 알디톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물과 같은 당알콜(sugar alcohol) 또는 알돈산, 우론산, 알다르산 및 이들의 혼합물과 같은 당산(sugar acid)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 항동해제는 탄수화물(Carbohydrate) 일 수 있다. 적절한 탄수화물은 두 개 이상의 수산기를 가진 케톤 또는 알데하이드이다. 상기 탄수화물은 환형 또는 선형인 것을 포함하며, 예를 들어 알도오스, 케토오스, 아미노 당, 알디톨, 이노시톨, 알돈산, 우론산, 알다르산, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
탄수화물은 또한 단당류, 이당류(특히 비환원성 이당류), 또는 다당류일 수 있다. 적절한 탄수화물은 예를 들어, 글리세르알데하이드, 아라비노오스, 자일로스, 펜토오스, 리보스, 갈락토오스, 글루코오스, 헥소오스, 아이도스, 만노오스, 탈로오스, 헵토오스, 프록토오스, 글루콘산, 소르비톨, 락토오스, 만니톨, 메틸 알파 글루코피라노사이드, 말토오스, 이소아스코르브산, 아스코르브산, 락톤, 아라비노스, 알로오스, 알토오스, 글루쿠론산, 글루카르산, 갈락투론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 수크로스, 트레할로스, 뉴라민산 또는 이들의 유도체일 수 있다. 적절한 다당류는 예를 들어, 아라비난, 프룩탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 자일란, 레반, 푸코이단, 카라기난, 갈락토카롤로오스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀르란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로오스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라틴, 콘드로틴, 더마탄, 히알루론산, 잔탄검 또는 전분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서 본 발명의 탄수화물은 수크로스, 글루코스, 락토오스 또는 트레할로스이다.
본 발명의 일 구현예에서 항동해제는 이당류 또는 당알콜일 수 있으며, 상기 이당류는 특히 비환원성 이당류일 수 있으며, 예를 들어 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스, 말토스 및 락토오스로 구성된 군으로부터 선택되는 비환원성 이당류 또는 만니톨 또는 소르비톨의 당알콜 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 항동해제는 트레할로스이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 첨가제는 트레할로스(trehalose) 를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 트레할로스는 상기 제형에 1 %(w/v), 2 %(w/v), 3 %(w/v), 4 %(w/v), 5 %(w/v), 6 %(w/v), 7 %(w/v), 8 %(w/v), 9 %(w/v) 또는 10 %(w/v)이상 포함될 수 있다. 또한 트레할로스는 상기 제형에 30 %(w/v), 25 %(w/v), 24 %(w/v), 23 %(w/v), 22 %(w/v), 21 %(w/v), 20 %(w/v) 또는 19 %(w/v) 이하로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 트레할로스는 상기 제형에 5 %(w/v) 내지 30 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 5 %(w/v) 내지 30 %(w/v), 10 %(w/v) 내지 30 %(w/v), 10 %(w/v) 내지 25 %(w/v) 또는 10 %(w/v) 내지 20 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 첨가제는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 추가적으로 포함한다. "폴리에틸렌글리콜" 또는 "PEG"는 일반식 H(OCH2CH2)nOH (n은 4 이상임)로 표시되는 분지쇄 또는 직쇄로서, 에틸렌옥시드와 물의 축합 중합체 혼합물을 의미한다. 폴리에틸렌글리콜은 CarbowaxTM 라는 상업 브랜드 이름으로도 불린다. PEG는 그의 중량 평균 분자량을 나타내는 숫자 접미어와 함께 사용된다. 예를 들어, PEG5,000은 총 중량 평균 분자량이 약 5,000인 폴리에틸렌글리콜을 의미하고, PEG12,000은 총 중량 평균 분자량이 약 12,000인 폴리에틸렌글리콜을 의미하며, PEG20,000은 총 중량 평균 분자량이 약 20,000인 폴리에틸렌글리콜을 의미한다.
본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 총 중량 평균 분자량이 200 내지 50,000일 수 있으며, 예를 들어 상기 총 중량 평균 분자량은 200 내지 50,000, 200 내지 30,000, 2,000 내지 30,000, 2,000 내지 10,000, 4,000 내지 10,000, 6,000 내지 10,000 또는 7,000 내지 9,000 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 총 중량 평균 분자량이 7,000 내지 9,000이며, 더욱 구체적으로 본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 PEG 8000이다.
본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 상기 제형에 0.0001 %(w/v), 0.001 %(w/v), 0.01 %(w/v), 0.1 %(w/v), 0.2 %(w/v), 0.3 %(w/v), 0.4 %(w/v), 0.5 %(w/v), 0.6 %(w/v), 0.7 %(w/v), 0.8 %(w/v), 0.9 %(w/v) 또는 1 %(w/v) 이상 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 상기 제형에 10 %(w/v), 9 %(w/v), 8 %(w/v), 7 %(w/v), 6 %(w/v), 5 %(w/v), 4 %(w/v), 3 %(w/v) 또는 2 %(w/v) 이하로 포함될 수 있다.
본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 상기 제형에 0.0001 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어 0.0001 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 0.0001 %(w/v) 내지 5%(w/v), 0.0001 %(w/v) 내지 2%(w/v), 0.001 %(w/v) 내지 2%(w/v), 0.01 %(w/v) 내지 2%(w/v) 또는 0.1 %(w/v) 내지 2 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 첨가제는 폴리소르베이트로 구성되며, 또는 폴리소르베이트를 포함한다. 또한 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 첨가제는 폴리소르베이트 뿐만 아니라, 트레할로스 및/또는 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 첨가제는 폴리소르베이트 20, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜 8,000을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계는
올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물; 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공하는 단계이며, 상기 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 0.01 내지 5%(w/v)의 폴리소르베이트를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계는
올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물; 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공하는 단계이며, 상기 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 상기 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012 내지 0.5%(w/v)의 비율로 폴리소르베이트를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계는
올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물; 및 폴리소르베이트, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공하는 단계이며, 상기 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 0.0001 내지 10%(w/v)의 폴리에틸렌글리콜을 포함하며, 상기 제형은 5 내지 30%(w/v)의 트레할로스를 포함하며, 상기 제형은 0.01 내지 5%(w/v)의 폴리소르베이트를 포함한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계는
올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물; 및 폴리소르베이트, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공하는 단계이며, 상기 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 0.0001 내지 10%(w/v)의 폴리에틸렌글리콜을 포함하며, 상기 제형은 5 내지 30%(w/v)의 트레할로스를 포함하며, 상기 제형은 상기 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012 내지 0.5%(w/v)의 비율로 폴리소르베이트를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계는
올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물; 및 폴리소르베이트, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공하는 단계이며, 상기 제형은 2 내지 50 μM의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 0.1 내지 2%(w/v)의 폴리에틸렌글리콜을 포함하며, 상기 제형은 10 내지 20%(w/v)의 트레할로스를 포함하며, 상기 제형은 상기 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012 내지 0.5%(w/v)의 비율로 폴리소르베이트를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계는
올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물; 및 폴리소르베이트, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제;를 포함하는 제형을 제공하는 단계이며, 상기 제형은 2 내지 50 μM의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 0.1 내지 2%(w/v)의 폴리에틸렌글리콜을 포함하며, 상기 제형은 10 내지 20%(w/v)의 트레할로스를 포함하며, 상기 제형은 상기 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012 내지 0.5%(w/v)의 비율로 폴리소르베이트를 포함하며, 상기 제형은 완충제(buffering agent)를 포함하지 않는다.
단계 (b): 제공된 제형의 동결건조
상기 (b) 단계에서는, 상기 (a)단계를 통하여 제공된, 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 제형을 동결건조한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동결건조는 상기 제형을 얼린 후, 이를 건조하는 방법에 의한다. 상기 동결 및 건조는 각각 수 개의 단계로 실시될 수 있으며, 각 단계는 선택적으로 감압하에서 실시 할 수 있다.
일반적으로 동결건조 방법의 특정 온도 및 온도 범위는 동결건조 장치의 선반 온도(shelf temperature)를 지칭한다. 상기 선반 온도는 동결건조 하는 동안 선반을 통과하는 냉각제의 제어 온도를 지칭한다. 동결건조물의 온도는 선반온도, 챔버 압력 및 승화 속도에 따라 달라질 수 있다.
상기 (b) 단계의 동결건조는 동결단계, 1차 건조단계 및 2차 건조 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 동결단계는 -20℃ 이하에서 수행될 수 있으며, 상기 온도는 예를 들어 -20℃, -25℃, -30℃, -35℃, -40℃, -45℃ 또는 -50℃ 이하일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 동결단계는 -80℃ 이상에서 수행될 수 있으며, 상기 온도는 예를 들어 -80℃, -70℃, -65℃, -60℃ 또는 -55℃ 이상 일 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 동결단계는 -20℃ 내지 -80℃, -35℃ 내지 -70℃, -35℃ 내지 -65℃, -35℃ 내지 -60℃, -40℃ 내지 -60℃, -40℃ 내지 -55℃, -45℃ 내지 -60℃, -45℃ 내지 -55℃ 또는 -50℃ 내지 -55℃에서 수행될 수 있다.
다른 구현예에서 상기 동결단계는 적어도 1시간 이상 수행될 수 있으며, 상기 시간은 예를 들어 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 10시간 또는 15시간 이상 일 수 있다. 다른 구현예에서 상기 동결단계는 96시간 이하로 수행될 수 있으며, 상기 시간은 예를 들어 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 26시간 또는 24시간 이하일 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명의 동결단계의 시간은 예를 들어 1 내지 96시간, 2 내지 84시간, 5 내지 72시간, 10 내지 60시간, 10 내지 48시간, 10 내지 36시간, 10 내지 26시간, 12 내지 48시간, 12 내지 24시간일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 단계 (a)에서 제공된 제형을 -20 내지 -80℃로 1 내지 96시간 동안 동결시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 단계 (a)에서 제공된 제형을 -35 내지 -60℃로 10 내지 26시간 동안 동결시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 단계 (a)에서 제공된 제형을 -40 내지 -55℃로 12 내지 24시간 동안 동결시키는 단계를 포함할 수 있다.
1차 건조단계는 상기 동결단계에서 동결된 제형으로부터 용매를 제거하는 단계이다. 상기 용매의 제거는 승화에 의해 이루어진다. 상기 승화를 촉진시키기 위하여, 상기 1차 건조단계는 건조기에서 건조기 내부의 기압을 얼음의 증기압 이하로 저하시키기 위하여 감압과 함께 이루어지며, 열을 가하여 동결단계보다 높은 온도에서 진행된다. 용어 “용매”는 적어도 일부 물질을 용해할 수 있는 동질의 액상물질(결합 가능한 물을 포함함)을 의미한다. 본 발명의 용매는 이에 제한되지 않으나, 물 또는 물과 다른 용매(예를 들어 알코올)의 공용매(cosolvent)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서 상기 1차 건조단계의 온도는 동결단계의 온도보다 3℃ 이상 높을 수 있으며, 예를 들어 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃ 또는 20℃ 이상 높을 수 있다. 다른 구현예에서 상기 1차 건조단계의 온도는 동결단계의 온도보다 60℃ 이하의 차이로 높을 수 있으며, 예를 들어 60℃, 55℃, 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 30℃ 이하의 차이로 높을 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 1차 건조단계의 온도는 동결단계의 온도보다 예를 들어 3℃ 내지 60℃, 4℃ 내지 55℃, 5℃ 내지 50℃, 5℃ 내지 45℃, 10℃ 내지 40℃, 15℃ 내지 35℃, 20℃ 내지 30℃ 높을 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 1차 건조단계 온도는 -15℃ 이하일 수 있으며, 예를 들어 -15℃, -20℃, -25℃ 또는 -30℃ 이하일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 1차 건조단계 온도는 -60℃ 이상일 수 있으며, 예를 들어 -60℃, -55℃, -50℃, -45℃, -40℃ 또는 -35℃ 이상 일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법의 1차 건조단계의 온도는 예를 들어, -15 내지 -60℃, -15 내지 -55℃, -20 내지 -50℃, -20 내지 -45℃, -25 내지 -45℃, -25 내지 -40℃ 또는 -30 내지 -35℃일 수 있다.
상기 1차 건조단계는 0 내지 200 mTorr 또는 50 mTorr 내지 100 mTorr의 압력 하에서 실시될 수 있다.
1차 건조단계는 동결상태의 용매가 실질적으로 모두 제거되기에 충분한 시간 동안 실시될 수 있다. 일 구현예에서 상기 1차 건조단계의 시간은 적어도 6시간 이상 일 수 있으며, 예를 들어 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 45시간 또는 48시간 이상 일 수 있다. 다른 구현예에서 상기 1차 건조단계의 시간은 96시간 이하 일 수 있으며, 예를 들어 96시간, 84시간, 75시간, 72시간 또는 60시간 이하일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 1차 건조단계의 시간은 예를 들어 6 내지 96시간, 12 내지 84시간, 24 내지 75시간, 36 내지 75시간, 45 내지 75시간, 48 내지 72시간 또는 48 내지 60시간일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 동결단계의 수득물을 -15 내지 -60℃에서 6 내지 96시간 동안 1차 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 동결단계의 수득물을 -25 내지 -45℃에서 45 내지 75시간 동안 1차 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 1차 건조시간을 48시간 동안 지속한 군에 비하여 60시간 지속한 군의 동결건조 케이크의 상태가 더 양호한 것을 확인하였다. 따라서 상기 (b) 단계는 상기 동결단계의 수득물을 -25 내지 -35℃에서 50 내지 72시간 동안 1차 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
2차 건조단계는 상기 1차 건조단계에서 건조된 결과물로부터 용매를 추가로 제거하는 단계이다. 상기 2차 건조단계는 0℃보다 높은 온도에서 진행된다.
일 구현예에서 상기 2차 건조단계의 온도는 0℃ 이상일 수 있으며, 예를 들어 0℃, 5℃, 10℃ 또는 15℃ 이상일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 2차 건조단계의 온도는 100℃ 이하일 수 있으며, 예를 들어 100℃, 50℃, 40℃, 30℃, 25℃ 또는 20℃ 이하 일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법의 2차 건조단계의 온도는 예를 들어, 0 내지 100℃, 5 내지 50℃, 10 내지 40℃, 10 내지 30℃, 15 내지 30℃, 18 내지 22℃ 또는 15 내지 25℃ 일 수 있다.
상기 2차 건조단계는 0 내지 200 mTorr 또는 50 mTorr 내지 100 mTorr의 압력 하에서 실시될 수 있다.
2차 건조단계는 1차 건조단계 후 동결건조된 결과물에서 잔류 용매 양을 최종 수준으로 감소하기에 충분한 시간 동안 실시될 수 있다. 구현예에서, 2차 건조단계의 최종 잔류 용매 양은 동결건조물의 중량 대비 예를 들어 10%(w/w) 이하, 9%(w/w) 이하, 8%(w/w) 이하, 7%(w/w) 이하, 6%(w/w) 이하, 5%(w/w) 이하, 4%(w/w) 이하, 3%(w/w) 이하, 2%(w/w) 이하, 1%(w/w) 이하, 0.8%(w/w) 이하, 0.6%(w/w) 이하, 0.5%(w/w) 이하, 0.2%(w/w) 이하 및 0.1%(w/w) 이하이다.
일 구현예에서 상기 2차 건조단계의 시간은 적어도 0.1시간 이상 일 수 있으며, 예를 들어 0.1시간, 0.5시간 또는 1시간 이상 일 수 있다. 다른 구현예에서 상기 2차 건조단계의 시간은 48시간 이하 일 수 있으며, 예를 들어 48시간, 36시간, 24시간, 12시간, 6시간, 4시간, 3시간 또는 2시간 이하일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 2차 건조단계의 시간은 예를 들어 0.1 내지 48시간, 0.1 내지 36시간, 0.5 내지 48시간, 0.5 내지 24시간, 0.5 내지 12시간, 0.5 내지 6시간, 0.5 내지 4시간, 0.5 내지 3시간 또는 0.5 내지 2시간일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 1차 건조단계의 수득물을 0 내지 100℃에서 0.5 내지 48시간 동안 2차 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 상기 1차 건조단계의 수득물을 18 내지 22℃에서 0.5 내지 3시간 동안 건조시키거나 또는 15 내지 25℃에서 0.5 내지 4시간 동안 2차 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 동결건조는 다음의 단계로서 실시될 수 있다:
(i) 단계 (a)에서 제공된 제형을 -20 내지 -80℃에서 1 내지 96시간 동안 동결시키는 단계:
(ⅱ) 상기 단계 (i)의 수득물을 -15 내지 -60℃에서 6 내지 96시간 동안 1차 건조시키는 단계: 및
(ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 수득물을 0 내지 100℃에서 0.5 내지 48시간 동안 2차 건조시키는 단계.
상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물은 잔류 용매 함량이 동결건조물 총 중량 대비 10%(w/w)미만이다. 일 구현예에 의하면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물의 잔류 수분함량은 예를 들어 동결건조물 총 중량 대비 0.1 내지 10%(w/w) 또는 1 내지 10%(w/w)일 수 있다.
II. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 동결건조물
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 제공한다.
상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물이란 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물이 동결건조된 결과물을 말한다. 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물은 본 발명의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 동결건조물은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함한다. 상기 동결건조물은 본 발명의 방법에 의해 제조되었으므로, 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물이 높은 농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하더라도 개선된 장기 안정성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 동결건조물은 장기간 보관에서 이의 초기 상태 또는 무결성을 유지할 수 있으며, 재구성(reconstitution)시 높은 활성 복원율을 나타낸다.
상기 본 발명의 동결건조물은 완충제(buffering agent)가 없는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물로부터 생산될 수 있다. 이 경우, 동결건조물의 안정성이 향상된다. 완충제가 없는 조성물의 동결건조물은 물 보다는 완충제를 사용하여 재구성 될 수 있다.
III. 동결건조용 제형
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 동결건조용 제형을 제공한다.
동결건조용 제형이란 동결건조 공정을 위하여 동결건조 대상과 이를 동결건조 시키기 위하여 필요한 첨가제가 함께 혼합되어 있는 혼합 제형을 말한다. 본 발명의 제형은 액상 제형과 고형 제형을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 동결건조용 제형은 액상 제형일 수 있다.
상기 본 발명의 동결건조용 제형은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물과 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 동결건조용 제형은 상술한 본 발명의 “Ⅰ. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법”에서 설명한 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물과 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하므로, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 동결건조용 제형에 포함되는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물과 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제는 상기 동결건조 방법에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 동결건조용 제형은 최소 3개 이상의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 최소 3쌍 이상의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함할 수 있다. 상기 효소는 핵산 중합효소, 핵산 절단효소, 핵산 절단효소 활성을 가지는 중합효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 동결건조용 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명 동결건조용 제형의 올리고뉴클레오티드 및 효소에 관하여는 상기 동결건조 방법에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 동결건조용 제형의 상기 첨가제는 비환원성 이당류(예컨대, 트레할로스)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 상기 첨가제는 폴리에틸렌글리콜을 추가적으로 포함할 수 있다. 비환원성 이당류 및 폴리에틸렌글리콜은 상술한 “Ⅰ. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법”에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 동결건조용 제형의 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20일 수 있다. 본 발명의 동결건조용 제형은 0.01 내지 5%(w/v)의 폴리소르베이트를 포함할 수 있다. 또는 본 발명의 동결건조용 제형은 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012 내지 0.5%(w/v)의 비율로 폴리소르베이트를 포함할 수 있다. 본 발명의 동결건조용 제형은 동결건조물의 더 높은 안정성을 위하여 완충제(buffering agent)를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 동결건조용 제형은 동결건조 케이크가 잘 형성되어 동결건조물의 품질이 우수하며, 제조시 불량율이 매우 낮다. 따라서 장기 보관시 안정성이 우수하며, 재복원시 활성이 우수하다.
IV. 폴리소르베이트의 신규한 용도
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조 하기 위한 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제의 용도를 제공한다.
올리고뉴클레오티드를 포함하는 동결건조 조성물 제조에 있어, 올리고뉴클레오티드가 동결건조 케이크 형성에 영향을 미친다. 특히 높은 농도의 올리고뉴클레오티드는 본 발명자가 밝혀낸 바와 같이 케이크 형성에 부정적인 영향을 미친다. 따라서 이러한 문제점의 해결을 위한 폴리소르베이트의 새로운 용도는 신규한 것이며, 기존 기술에 비하여 자명하지 않다.
V. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 키트
본 발명의 또 다른 양태에 다르면, 본 발명은 본 발명의 동결건조물을 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 “I. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법”에 의해 제조된 동결건조물을 포함한다.
본 발명의 키트에 포함된 동결건조물은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물과 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함한다. 상기 첨가제는 트레할로스 및/또는 폴리에틸렌글리콜을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트의 동결건조물은 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 제형을 동결건조하여 제조될 수 있다. 상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 적어도 3개의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 적어도 3개의 프라이머쌍 및 효소를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 제형에 적어도 2 μM 이상의 농도로 포함될 수 있다. 상기 폴리소르베이트는 상기 제형에 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0012 내지 0.5 %(w/v)의 비율로 포함될 수 있다.
본 발명 키트의 동결건조물은 다음의 단계로 제조될 수 있다.
(i) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하는 제형을 -20 내지 -80℃로 1 내지 96시간 동안 동결시키는 단계;
(ⅱ) 상기 단계 (i)의 수득물을 -15 내지 -60℃로 6 내지 96시간 동안 1차 건조시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 수득물을 0 내지 100℃로 0.5 내지 48시간 동안 2차 건조시키는 단계.
이와 같이 제조된 동결건조물은 높은 농도의 올리고뉴클레오티드가 포함되어 있어도, 장기간의 저장이 가능하며, 재구성시 높은 활성을 나타낸다.
본 발명 키트의 동결건조물은 상술한 본 발명의 “Ⅰ. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법”에서 설명한 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물과 폴리소르베이트를 포함하는 첨가제를 포함하므로, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 키트는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부가적인 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 부가적인 시약은 예를 들어 상기 동결건조물을 재구성하기 위한 적절한 희석제를 포함할 수 있다. 상기 부가적인 시약은 액체성분 또는 고체성분일 수 있다. 상기 부가적인 시약은 상기 동결건조물과 별개의 용기에 존재하거나, 동일한 용기에 구분되어 또는 혼재되어 존재할 수 있다. 또한 상기 키트는 키트의 구성성분을 사용하기 위한 지시서를 더 포함할 수 있다. 상기 지지서는 키트의 용기에 인쇄 또는 부착되거나, 그의 성분에 패키징 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 포함하고 있으므로, 실온 보관 및 유통이 가능하다. 또한 본 발명의 키트는 다중타겟 핵산서열 증폭반응을 위한 실험공정을 매우 단순화 시킬 수 있어, 오염, 실험자에 의한 실험 오류 등의 위험이 적고, 신속한 실험이 가능하다.
본 발명의 키트에 포함된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물은 완충제(buffering agent)를 포함하지 않을 수 있다. 이 경우, 완충제는 희석제로 본 발명의 키트에 포함되거나 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 용약하면 다음과 같다.
(a) 본 발명은 고농도의 올리고뉴클레오티드가 포함되는 조성물을 동결건조 하는 경우 동결건조 케이크 형성이 잘 되지 않는다는 새로이 밝혀낸 사실을 기반으로 제안된 것이다. 본 발명자는 폴리소르베이트가 이러한 문제를 해결할 수 있음을 밝혀내었다. 동결건조를 위한 첨가제의 구성요소로 포함된 폴리소르베이트는 고농도의 올리고뉴클레오티드에 의한 동결건조 케이크 품질 저하를 억제하여 고농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 동결건조물의 품질을 향상시키는 효과가 있다. 본 발명의 동결건조물은 본 발명의 방법에 의해 제조되어, 동결건조 케이크 형성이 안정적으로 이루어졌기 때문에 재복원(reconstitution) 가능한 보존 기간 길고, 동결건조물을 재복원 하였을 경우 액상 제형의 활성을 매우 높은 비율로 유지하는 이점이 있다.
(b) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조 하기 위한 첨가제로서의 폴리소르베이트의 용도는 다중타겟 핵산서열 증폭반응뿐만 아니라, 고농도 핵산 서열을 포함하는 다양한 종류의 재료의 동결건조에 적용이 가능하다. 나아가 이러한 폴리소르베이트의 신규한 용도는 고농도의 핵산 서열, 효소 및 버퍼, 염 및 금속이온 등 다양한 미량 성분이 포함된 조성물의 동결건조에 적용이 가능하다.
(c) 일구현예에서, 본 발명의 동결건조물은 목적하는 용도(예를 들어 병원균 검출 등)에 필요한 모든 구성요소를 하나의 tube에 넣고 동결건조 시켰으므로, 이를 사용하는 실험이 단순화 되며, 이로서 1) 실험자에 의한 오류 가능성이 감소하고, 2) 검사시간이 단축되며, 3) 검사 시스템의 자동화가 매우 용이하다.
도 1은 동결건조용 제형 내의 올리고뉴클레오티드의 농도에 따른 본 발명의 동결건조 조성물의 동결건조 결과를 나타낸다.
도 2는 동결건조용 제형 내의 폴리소르베이트(Tween20)의 농도에 따른 본 발명의 동결건조 조성물의 동결건조 결과를 나타낸다.
도 3은 1차 건조를 48시간 한 경우 동결건조 결과를 나타낸다.
도 4는 1차 건조를 60시간 한 경우 동결건조 결과를 나타낸다.
실시예 1: 다양한 올리고뉴클레오티드 농도별 동결건조물 제조 시험
다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법에 있어, 올리고뉴클레오티드의 농도가 동결건조 케이크 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다양한 농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 제조하였다.
올리고뉴클레오티드는 성매개감염 원인균 진단용 시약인 STI-7 Anyplex II(Seegene, 대한민국 서울)에 사용되는 토탈 올리고뉴클레오티드 혼합물(TOM)을 사용하였다.
올리고뉴클레오티드(TOM), Taq DNA 중합효소, MgCl2, dNTP 및 Tris-HCl을 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물에 폴리소르베이트(Tween 20), 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제를 물과 함께 혼합하여 30 μl 최종 부피의 동결건조용 제형을 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 농도에 따라 4개의 그룹으로 나누어 제조하였으며, 각 그룹마다 Tween 20이 0.0057 또는 0.057%(w/v)의 농도로 포함된 동결건조용 제형을 각각 제조하였다.
상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조용 제형은 다음의 표 1과 같은 조성을 각각 포함한다.
동결건조용 제형 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2
증폭반응용
조성물		 TOM (μM) 5 5 10 10 20 20 40 40
Taq DNA polymerase (unit) 1 1 1 1 1 1 1 1
MgCl2 (mM) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
dNTP (mM) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Tris-HCl (mM) 20 20 20 20 20 20 20 20
첨가제 Tween20 (%(w/v)) 0.0057 0.057 0.0057 0.057 0.0057 0.057 0.0057 0.057
Trehalose (%(w/v)) 18.15 18.15 18.15 18.15 18.15 18.15 18.15 18.15
Polyethylene glycol (%(w/v)) 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65
TOM 1 μM 당 Tween20의 비율 (%(w/v)) 0.00114 0.0114 0.00057 0.0057 0.000285 0.00285 0.000142 0.00142
상기 제조된 동결건조용 제형의 동결건조는 VirTis Advantage plus (Warminster, PA)로 수행되었다. 먼저 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조용 제형을 -55℃에서 24시간 동안 냉동시켰다. 이를 -30℃에서 48시간 동안 1차 건조하고, 이후 온도를 20℃까지 상승시켜 30분간 2차 건조하여 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 제조하였다. 동결건조는 100mTorr의 압력에서 수행되었다.
올리고뉴클레오티드 농도를 달리하여 제조된 동결건조물의 외형을 관찰하였다. 도 1은 올리고뉴클레오티드 농도별 동결건조물의 상태를 관찰한 결과이다. 도 1에서 보는 바와 같이, Tween 20의 농도가 0.0057%(w/v)로 조절된 군(A1, B1, C1, D1)은 올리고뉴클레오티드의 최종농도가 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM 인 모든 군에서 투명한 층과 수축된 케이크 형태를 나타내는 것을 확인하였다. 반면, Tween 20의 농도가 0.057%(w/v)로 조절된 군(A2, B2, C2, D2)은 케이크 형성이 잘 이루어지는 것을 확인하였다.
실시예 1의 결과는 고농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물을 동결건조하기 위하여는 일정 수준의 폴리소르베이트가 포함되어야 한다는 것을 보여준다.
실시예 2: 폴리소르베이트 농도별 동결건조물 제조 시험
폴리소르베이트 농도가 동결건조용 제형의 동결건조에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 폴리소르베이트 농도를 달리하여 동결건조용 제형을 제조하고 이를 동결건조하였다.
올리고뉴클레오티드(TOM), Taq DNA 중합효소, MgCl2, dNTP 및 Tris-HCl을 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물에 폴리소르베이트(Tween 20), 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제를 물과 함께 혼합하여 30 μl 최종 부피의 동결건조용 제형을 제조하였다. 첨가제의 Tween 20의 농도에 따라 5개의 그룹으로 나누어 제조하였다.
제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조용 제형은 다음 표 2와 같은 조성을 각각 포함한다.
동결건조용 제형 A B C D E
증폭반응용
조성물		 TOM (μM) 10 10 10 10 10
Taq DNA polymerase (unit) 1 1 1 1 1
MgCl2 (mM) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
dNTP (mM) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Tris-HCl (mM) 20 20 20 20 20
첨가제 Tween20 (%(w/v)) 0.0057 0.057 0.11 0.28 0.57
Trehalose (%(w/v)) 18.15 18.15 18.15 18.15 18.15
Polyethylene glycol (%(w/v)) 1.65 1.65 1.65 1.65 1.65
TOM 1 μM 당 Tween20의 비율 (%(w/v)) 0.00057 0.0057 0.011 0.028 0.057
동결건조물의 제조 프로세스는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행되었다.
폴리소르베이트(tween 20) 농도를 달리하여 제조된 동결건조물의 외형을 관찰하였다. 도 2는 폴리소르베이트 농도별 동결건조물의 상태를 관찰한 결과이다. 도 2에서 보는 바와 같이, Tween 20의 농도를 0.057%(w/v) 이상으로 조절한 군(B~E)은 케이크가 정상적으로 형성되었으나, 0.0057%(w/v)로 조절한 군(A)은 케이크의 아래 부분에 투명한 층이 형성되는 것을 확인하였다(도 2의 circle line 참조). 추가적으로 Tween 20의 농도가 0.57%(w/v)인 그룹(E)의 경우 케이크 형성은 정상적으로 되나, 이후 부스러짐이 빈번하게 나타나는 것을 확인하였다.
이러한 결과들은 일정 수준 이상의 폴리소르베이트가 포함되어야 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 과정에서 케이크가 잘 형성됨을 보여준다.
실시예 3: 건조 시간이 동결건조물에 미치는 영향 분석
건조시간에 따른 동결건조물의 변화를 알아보기 위하여 1차 건조시간을 달리하여 동결건조물을 제조하였다.
다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조용 제형은 상기 실시예 2의 A, B, C 그룹과 동일하게 제조하였다. 제조된 동결건조용 제형을 1차 건조 시간에 따라 두 개 군으로 나누어, 하기 표 3과 같은 공정으로 건조시간을 달리하여 동결건조를 실시하였다.
48 시간군 60 시간군
단계 온도(℃) 시간(시간) 온도(℃) 시간(시간)
동결 -55 24 -55 12
1차건조 -30 48 -30 60
2차건조 20 0.5 20 2
압력은 모두 동일하게 100 mTorr로 하여 실험하였다.
상기 동결건조 공정에 의해 제조된 동결건조물의 외형을 관찰하였다. 도 3은 1차 건조를 48시간 동안 수행한 동결건조물의 결과 사진이며, 도 4는 건조를 60시간 동안 수행한 동결건조물의 결과 사진이다.
도 3에서 보는 바와 같이, 1차 건조를 48시간 수행한 경우 Tween 20이 0.057%(w/v) 또는 0.11%(w/v) 농도로 포함된 군은 케이크가 잘 형성되는 반면, Tween 20이 0.0057%(w/v) 농도로 포함된 군은 형성된 케이크가 다소 투명한 형상을 나타내며(도 3의 circle line 참조), 일부는 케이크 형성이 되지 않는 경우까지 발생하는 것을 확인하였다(도 3의 circle line 참조).
1차 건조 시간을 60시간까지 연장을 한 경우, Tween 20이 0.0057% 농도로 포함된 군은 48시간 건조시 나타나는 케이크 형성상의 문제점이 감소하였으나, 여전히 일부 케이크 아랫부분에 케이크가 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 4의 circle line 참조). 0.057%(w/v) 및 0.11%(w/v) 농도로 포함된 군은 48시간 건조 경우와 동일하게 케이크가 잘 형성되는 것을 확인하였다(도 4 참조).
따라서 고농도 올리고뉴클레오티드를 포함하는 동결건조용 제형의 경우 충분한 농도의 폴리소르베이트(Tween 20)가 포함되어야 케이크가 잘 형성되며, 1차 건조 시간을 충분히 확보하는 것이 동결건조물 품질 향상에 도움이 되는 것을 확인하였다.
실시예 4: 동결건조물의 성능 평가
실시예 3에서 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물이 목적한 병원균 검출 능력을 유지하고 있는지를 시험하였다. 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 증류수로 재구성(reconstitution) 한 후, 병원균 DNA 주형을 넣고 반응을 진행시켜 발생하는 검출 신호를 측정하였다. 측정된 검출 신호를 반응 혼합물의 액상 제품을 사용하여 검출을 진행한 검출 신호와 비교하였다.
실시예 3에서 제조된 동결건조물 중 Tween 20의 농도가 0.0057% 및 0.057%인 동결건조물을 선택하여 실험을 진행하였다. 샘플은 3개 군으로 나누어 검출대상 병원균 DNA 주형이 반응당 각각 10, 100, 1000 copy가 되도록 하여 실험하였다. 동결건조물이 들어 있는 PCR 튜브에 5 μl의 plasmid DNA 혼합물(7개의 성매개감염 원인 유전자와 내부 대조군)을 첨가하고, RNase-free water로 최종 부피가 30 μl이 되도록 조정하였다. 상기 반응 혼합물을 담고 있는 PCR 튜브를 CFX96™ Real-time PCR System(Bio-Rad, 미국)에 위치시켰다. 실시간 중합효소연쇄반응은 Uracil-DNA glycosylase (UDG) system이 적용되어 있어 50℃에서 4분간 진행한 뒤 95℃에서 15분 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50회 반복하였다. 실시간 신호 검출을 위해 50번째 증폭 사이클 이후, 55℃부터 85℃까지 5초 마다 0.5℃씩 온도를 올려가며 실시간으로 시그널 검출을 진행하였다.
대조군으로는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 하지 않은 액상 제형을 사용하였다. 상기 액상 제형은 실시예 2의 B그룹과 동일한 성분 및 농도를 가지도록 제조하였다. 제조된 대조군에 상기 실험에 사용된 것과 동일한 샘플 DNA를 첨가하고 동일 조건으로 반응시켜 발생신호 검출을 수행하였다.
표 4는 각 실험군의 신호 검출 세기를 정리 및 비교 한 것이다. 실험 결과, 표 4에서 보는 바와 같이, 0.057%(w/v)의 Tween 20을 포함하는 동결건조 군(10X_Tablet으로 기재됨)의 경우 0.0057%(w/v)의 Tween 20을 포함하는 동결건조 군(1X_Tablet으로 기재됨)에 비하여 형광신호의 강도가 우수한 것을 확인하였다.
특히 샘플 DNA의 농도가 낮은 경우(102 및 101 copy/reaction)에는 1X_Tablet은 형광신호의 강도가 급격히 감소하는데 비하여, 10X_Tablet 은 비교적 일정한 형광신호 강도를 유지하는 것을 확인하였다.
이러한 결과들은 본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물이 목적하는 병원균 검출능력을 유지하고 있음을 보여준다.
Figure 112017085295618-pct00001
1X Tablet: Tween20이 0.0057%(w/v) 포함된 동결건조물; 10X Tablet: Tween20이 0.057%(w/v) 포함된 동결건조물; Liquid: 동결건조물질과 동일한 성분 및 농도를 포함한 동결건조 하지 않은 기존의 액상 제형; 평균: 평균 형광 강도; Ratio: Liquid 실험군 대비 tablet군의 형광 강도 비율
실시예 5: 동결건조물의 특성 시험
본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물이 진단용으로 사용되기에 적절한지 확인하기 위하여, 본 발명 동결건조물의 민감도 및 특이도를 측정하고, 액상 제형과의 동등성을 확인하였다. 동결건조용 제형은 최종부피 30 μl의 조성물로 TOM 10 μM, Tween20 0.057%(w/v), Taq DNA 중합효소 1 unit, MgCl2 2.5 mM, dNTP 0.3 mM, Tris-HCl 20 mM, 트레할로스 18.3%(w/v) 및 폴리에틸렌 글리콜 1.65%(w/v)를 포함한다. 동결건조용 제형 제조 및 동결건조 방법은 실시예 3의 60시간군과 동일한 방법으로 수행하였다.
<5-1. 민감도 분석>
민감도(sensitivity)는 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 동결건조물의 검출 한도(limit of detection, LoD)를 분석하는 방법으로 수행되었다. 총 7개의 성매개성 원인 유전자 plasmid DNA를 사용하였다. 이 중 NG와 CT는 각 두 개의 타겟 부위(target region)을 가지고 있다(NG-NGp, NGm; CT-CTc, CTg).
각 병원균 DNA의 카피수를 분광측광기(spectrophotometer)를 이용한 흡광도 측정을 통하여 계산한 후, 카피수가 105 내지 101이 되도록 50mM의 Tris-EDTA (pH 8.0)를 이용하여 차례로 희석하였다. 희석된 DNA 샘플을 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물을 이용하여 검출을 수행하였다. 검출은 각 유전자별로 8번 반복 수행되었다.
표 5는 동결건조물의 민감도를 분석한 결과를 정리한 것이다. 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물은 검출대상 DNA가 50 copies/reaction인 경우까지 안정적으로 검출하는 것을 확인하였다.
Copies/ rxn Target
UU UP MG MH NGp NGm CTc CTg TV IC
105 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8
103 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8
102 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8
50 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8
10 2/8 4/8 6/8 3/8 7/8 6/8 5/8 5/8 3/8 7/8
Chlamydia trachomatis(CT) / Neisseria gonorrhoeae(NG) / Trichomonas vaginalis(TV) / Mycoplasma hominis(MH) / Mycoplasma genitalium(MG) / Ureaplasma urealyticum(UU) / Ureaplasma parvum(UP) / 내부 대조군(IC: internal control)
<5-2. 특이도 분석>
본 발명의 동결건조물의 특이성을 확인하기 위하여 검출대상이 아닌 병원균을 검사대상으로 하여 검출시험을 하였다.
먼저, 검출 대상 병원균이 아닌 37종의 다양한 박테리아 및 바이러스 병원균의 핵산을 추출하였다. 상기 제조된 본 발명의 동결건조물을 증류수로 재구성 한 후 상기 추출된 37 종의 핵산을 104 copies/reaction이 되도록 수화된 동결건조물에 첨가한 후, 30 μl이 되도록 잔량을 물을 추가하였다. 실시예 4에서와 동일한 방법으로 반응을 진행 한 후 양성 반응이 나타난 케이스(case)가 있는지 확인하였다. 검출은 각 유전자별로 2번 반복 수행되었다.
표 6은 동결건조물의 특이도를 분석한 결과를 정리한 것이다. 실험 결과, 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 동결건조물의 검출대상이 아닌 37종의 다른 균종의 핵산은 모두 검출되지 않는 것을 확인하였다.
No. Organism No. of positive No. Organism No. of positive
1 Acinetobacter baumannii 0/2 20 Hepatitis B virus (HBV) 0/2
2 Acinetobacter schindleri 0/2 21 Hepatitis C virus (HCV) 0/2
3 Atopobium vaginae 0/2 22 HSV1 0/2
4 Bacteroides fragilis 0/2 23 HSV2 0/2
5 Candida albicans 0/2 24 Human Papilloma Virus 16 0/2
6 Candida dubliniensis 0/2 25 Human Papilloma Virus 18 0/2
7 Candida glabrata 0/2 26 Neisseria cinerea 0/2
8 Candida parapsilosis 0/2 27 Neisseria meningitidis 0/2
9 Candida tropicalis 0/2 28 Neisseria mucosa 0/2
10 Chlamydophila pneumoniae 0/2 29 Neisseria perflava 0/2
11 Clostridium difficile 0/2 30 Neisseria sicca 0/2
12 Clostridium perfringens 0/2 31 Salmonella enteritidis 0/2
13 Cytomegalovirus ( CMV ) 0/2 32 Staphylococcus aureus 0/2
14 Enterococcus avium 0/2 33 Streptococcus agalactiae 0/2
15 Epstein Barr Virus 0/2 34 Streptococcus pneumoniae 0/2
16 Escherichia coli 0/2 35 Vibrio parahaemolyticus 0/2
17 Gardnerella vaginalis 0/2 36 Yersinia enterocolitica 0/2
18 Haemophilus ducreyi 0/2 37 Pseudomonas aeruginosa 0/2
19 Haemophilus influenza 0/2
<5-3. 동결건조 시험의 동등성 분석>
본 발명의 동결건조물이 기존의 액상 제품과 동일한 결과를 나타내는지 알아보았다.
기존의 액상 제형은 본 발명의 동결건조물과 동일한 표적핵산을 검출하는 액상 제형으로 된 전통적인 진단 제품이다.
DNA 주형은 184건의 genital swap 샘플로부터 Qiagen DNA mini kit(Gaithersburg, 미국)을 이용하여 추출하였다. 실시간 PCR 및 신호 검출은 앞서 설명한 바와 동일하게 수행하였다.
실험 결과 표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 동결건조물은 기존의 액상 제품에 비하여 94.3% 내지 100%의 민감도, 99.4% 내지 100%의 특이도를 보이는 것으로 확인되어 액상 제품과 비교 시 동일한 성능을 유지함을 증명하였다.
Figure 112017085295618-pct00002
<5-4. 동결건조물의 안정성 시험>
상기 제조한 동결건조물이 들어 있는 8-strip PCR 튜브를 알루미늄 파우치에 흡습제와 함께 밀봉하여 일정기간 보관한 후, 검출활성을 확인하는 방법으로 안정성을 분석하였다. 저장은 4℃에서 수행되었으며, 검출 능력 분석은 저장 후 0, 3, 6, 9 및 12개월째에 수행되었다.
동결건조물은 재구성 후 병원균 DNA 주형 (100copies/reaction)을 넣고 반응을 수행하였다. 발생된 신호는 멜팅 피크 높이가 미리 정해진 기준 높이 (reference height) 이상인지 여부로 분석하였다.
표 8은 본 발명 동결 건조물의 안정성 분석 결과를 요약한 것이다. 결과들은 2회 반복 실험의 평균값이다. 표 8에서 보는 바와 같이 본 발명의 동결건조물은 저장 후 12개월까지 기준 활성(reference activity) 이상으로 활성을 유지하고 있는 것을 확인하였다.
Target UU UP MG MH NG CT IC TV
Reference height
(melt peak)		 120 140 100 50 200 180 110 90


Storage term
(month)

 0 265.3 308.3 194.3 78.5 437.3 373.0 135.4 122.2
3 239.9 271.0 193.3 165.0 459.4 407.4 145.2 131.9
6 171.9 215.2 168.1 228.2 419.5 347.1 125.6 114.9
9 216.0 239.8 162.7 236.3 412.3 363.0 124.6 95.9
12 181.3 231.7 159.5 161.06 401.7 328.1 138.3 100.7
이와 같이 실시예 5를 통하여, 본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물은 민감도 및 특이도가 충분히 우수하고, 액상 제형과 동등한 검출능력을 나타낼 수 있으며, 저장 안정성이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 방법에 의해 제조된 동결건조물이 진단용으로 사용되기에 적합함을 보여준다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.

Claims (22)

  1. 다음의 단계를 포함하는 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조 방법:
    (a) (i) 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 (ii) 폴리소르베이트 20, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제를 포함하는 제형을 제공하는 단계로서; 상기 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 상기 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0057 내지 0.028 %(w/v)의 비율로 상기 폴리소르베이트 20을 포함하고; 및
    (b) 상기 제형을 동결건조 하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 (i) 최소 3개 이상의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 최소 3쌍 이상의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 (ii) 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서, 상기 효소는 핵산 중합 효소, 핵산 절단 효소, 절단효소 활성을 가지는 핵산 중합효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 상기 단계 (a)에서 제공된 제형을 -20 내지 -80℃에서 1 내지 96시간 동안 동결시키는 단계;
    (ⅱ) 상기 단계 (i)의 수득물을 -15 내지 -60℃에서 6 내지 96시간 동안 1차 건조시키는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 수득물을 0 내지 100℃에서 0.5 내지 48시간 동안 2차 건조시키는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (ii)의 상기 1차 건조는 -25 내지 -35℃에서 50 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항, 제2항, 제6항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물의 동결건조물.
  13. 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물 및 폴리소르베이트 20, 트레할로스 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 첨가제를 포함하는 동결건조용 제형에 있어서, 상기 제형은 2 μM 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제형은 상기 올리고뉴클레오티드 1 μM 당 0.0057 내지 0.028 %(w/v)의 비율로 상기 폴리소르베이트 20을 포함하는 것을 특징으로 하는 제형
  14. 제13항에 있어서, 상기 다중타겟 핵산서열 증폭반응용 조성물은 최소 3개 이상의 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 최소 3쌍 이상의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제14항에 있어서, 상기 효소는 핵산 중합효소, 핵산 절단효소, 핵산 절단효소 활성을 가지는 중합효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
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