CN114752662A - 一种荧光pcr冻干保护剂及其应用 - Google Patents

一种荧光pcr冻干保护剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种荧光PCR冻干保护剂及其应用，所述冻干保护剂包括D‑海藻糖、PEG8000、D‑山梨醇；本发明提供的冻干保护剂，可与荧光PCR试剂混合后进行冻干，以制得冻干剂型的PCR扩增试剂；该冻干试剂能够实现4℃运输及保存，在使用时只需加入无RNA酶水溶解试剂，再加入核酸样本即可，无需额外加入任何组分，可以解决现有冻干体系中不能含有甘油的问题，且冻干后成型光滑、性能变化小、稳定性好。

Description

一种荧光PCR冻干保护剂及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种荧光PCR冻干保护剂及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术自1983年问世以来，在诸多领域的诊断和研究中得到了广泛的应用。
荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR)技术1993年由Higuchi等人最先报道，已广泛应用于等位基因的差异分析、基因特异剪接变体的表达分析等。该技术对实验空间和人员操作的要求相对较低，尤为适用于核酸分子的临床检测。但荧光定量PCR试剂对于保存和运输条件要求苛刻，其关键组分核酸聚合酶易受温度变化的影响，因此出现了使用冻干保护剂将荧光定量PCR试剂进行真空冷冻干燥(简称冻干)处理的应用。
荧光PCR试剂冻干后，冻干体系失去水分，蛋白质等组分不会发生变性或失去生物活力，干燥后的产品能够在4℃或室温长期保存，但市面上的冻干方法皆适用于不含甘油反应体系的冻干，核酸聚合酶原料又往往保存在含有甘油的缓冲液中，随着荧光定量核酸诊断技术逐步成为医学基础检测中的核心技术，开发一种适用于含甘油冻干保护体系的冻干保护剂及冻干方法迫在眉睫。
发明内容
针对上述提出的问题，本发明提供了一种荧光PCR冻干保护剂及其应用。
本发明具体通过以下技术方案予以实现：
一种荧光PCR冻干保护剂，包括D-海藻糖、PEG8000、D-山梨醇。
进一步的，各组分浓度为：100～500mM D-海藻糖、0～2.5mM PEG8000、 0～80mMD-山梨醇。
作为优选方案，所述冻干保护剂由以下组成：300mM D-海藻糖、1mM 聚乙二醇8000、20D-山梨醇，溶剂为无菌超纯水。
上述荧光PCR冻干保护剂应用于含甘油的冻干保护体系。
上述荧光PCR冻干保护剂的冻干条件如下：
1)预冻阶段：-45℃预冻2h；
2)干燥阶段：层板温度23～22℃条件下，抽真空至0～13Pa，保持13h。
本发明提供的冻干保护剂，可与荧光PCR试剂混合后进行冻干，以制得冻干剂型的PCR扩增试剂。该冻干试剂能够实现4℃运输及保存，在使用时只需加入无RNA酶水溶解试剂，再加入核酸样本即可，无需额外加入任何组分。
相比于现有技术，该冻干试剂具有如下优点：
1.保护剂成分简单，节约成本；
2.冷冻干燥程序简便，无需进行繁琐的操作；
3.冻干前后试剂性能变化小，不影响荧光PCR的扩增反应，且适用于含甘油PCR扩增体系的冻干。
附图说明
图1为实施例1制得冻干的外观示意图；
图2为实施例1新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图3为实施例1冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图4为实施例2制得冻干的外观示意图；
图5为实施例2新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图6为实施例2冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图7为实施例3制得冻干的外观示意图；
图8为实施例3新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图9为实施例3冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图10为实施例4制得冻干的外观示意图；
图11为实施例4新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图12为实施例4冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图13为实施例5制得冻干的外观示意图；
图14为实施例5新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图15为实施例5冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图16为实施例6制得冻干的外观示意图；
图17为实施例6新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图18为实施例6冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图19为实施例2制得冻干的外观示意图；
图20为实施例2新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图21为实施例2冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图22为实施例8制得冻干的外观示意图；
图23为实施例8新制冻干的扩增曲线图(即存放0天)；
图24为实施例8冻干2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图；
图25为对比例1中新配制液体试剂的扩增曲线图(即存放0天)；
图26为对比例1中配制后液体试剂2～8℃条件下存放30d后的扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种荧光PCR冻干保护剂，各组分浓度为：100～500mM D-海藻糖、0～2.5mM PEG8000、0～80mM D-山梨醇。
冻干保护剂的原料：D-海藻糖购自北京索莱宝科技有限公司、PEG8000 购自阿拉丁、D-山梨醇购自国药集团化学试剂有限公司。
将冻干保护剂按照上述配方进行混合预配成贮存液(配制成的贮存液定义为2.5倍浓度)，并使用0.22μm水系无菌滤膜进行过滤除菌，保存在 2～8℃条件下待用。使用时依据配制的PCR反应液体积，添加相应量的贮存液，使最终体系中贮存液降为1倍浓度。
贮存液冻干保护剂各组分用量，如下表1所示：
表1
组分 用量/g
D-海藻糖 9.46～42.29
D-山梨醇 0～3.64
PEG8000 0～5
无菌超纯水 定容至100mL
使用配制好的冻干保护剂的贮存液配制10μL荧光PCR冻干反应体系 (即冻干试剂)，体系中各组分用量如下表2所示：
表2
Figure BDA0003520434520000041
Figure BDA0003520434520000051
PCR酶系TAKARA TaqTM Hot Start Version购自宝生物工程(大连) 有限公司。TAKARA TaqTM Hot Start Version包含TaKaRa Taq HS，10×PCR Buffer、dNTP Mixture。
将配制好的多重PCR冻干反应体系按10uL/T分装到PCR八联管中，将PCR放入八联管架并放入冻干托盘中。
为实现荧光PCR通用保护剂在荧光PCR检测中的应用，其冻干条件为：
1)预冻阶段：-45℃预冻2h；
2)干燥阶段：层板温度23～22℃条件下，抽真空至0～13Pa，保持13h。
对比例1
本对比例中冻干试剂的配置方法参照上表2，且将表2中的冻干保护剂替换为无菌超纯水(即本对比例制备的冻干试剂不含冻干保护剂)。
新配制及配制后2～8℃条件下存放30d，使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，扩增曲线如图12-18所示。
实施例1
取D-海藻糖9.46g、D-山梨醇3.64g、PEG8000 1g，使用无菌超纯水定容至100mL后0.22μL无菌滤膜过滤除菌。根据上表2配制冻干试剂，并使用上述冷冻干燥程序进行冻干。
1)冻干外观
参照附图1所示，从图中可以看出，冻干产物皱缩。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图2-3所示，从图中可以看出，保护剂具备一定保护能力，但对于低浓度模板的扩增能力较弱。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为18.92 g、D-山梨醇用量为2.28g、PEG8000用量为3g。
1)冻干外观
参照附图4所示，从图中可以看出，冻干产物皱缩。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图5-6所示，从图中可以看出，保护剂具备一定保护能力，扩增曲线线型较好，但荧光信号值较液体试剂稍弱。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为18.92 g、D-山梨醇用量为0.46g、PEG8000用量为4g。
1)冻干外观
参照附图2所示，从图中可以看出，冻干产物塌陷并皱缩。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图8-9所示，从图中可以看出，保护剂具备一定保护能力，但存放30d后最大荧光信号减弱。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为 28.32g、D-山梨醇用量为0.91g、PEG8000用量为2g。
1)冻干外观
参照附图10所示，从图中可以看出，冻干产物外观理想，结构致密，一致性良好。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图11-12所示，从图中可以看出，保护剂保护性能良好，冻干试剂与液体试剂扩增结果无明显差别，存放30d后扩增效果未发生明显变化。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为 32.83g、D-山梨醇用量为0.46g、PEG8000用量为5g。
1)冻干外观
参照附图13所示，从图中可以看出，冻干产物外观理想，结构致密，一致性良好。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图14-15所示，从图中可以看出，保护剂具备保护能力，对于低浓度模板的扩增信号较弱。
实施例6
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为 42.29g、D-山梨醇用量为0.91g、PEG8000用量为2g。
1)冻干外观
参照附图16所示，从图中可以看出，冻干产物外观理想，结构致密，一致性良好。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图12-18所示，从图中可以看出，保护剂具备保护能力，扩增曲线线型较差。
实施例7
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为28.32g、D-山梨醇用量为0.91g、不添加PEG8000。
1)冻干外观
参照附图19所示，从图中可以看出，冻干产物一致性较差，个别孔内出现底部塌陷现象。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图20-21所示，从图中可以看出，保护剂具备保护能力，扩增曲线线型较差。
实施例8
本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，D-海藻糖用量为28.32 g、PEG8000用量为2g、不含D-山梨醇。
1)冻干外观
参照附图22所示，从图中可以看出，冻干产物出现塌陷及脱皮现象。
2)PCR性能比较
使用高浓度模板及低浓度模板上机测试，参照附图23-24所示，从图中可以看出，保护剂具备保护能力，扩增曲线线型较好，但最大荧光信号较液体试剂稍弱。
实施例1-8的冻干保护剂中各组分浓度，如下表所示：
组别 D-海藻糖 D-山梨醇 PEG8000
实施例1 100mM 80mM 0.5mM
实施例2 200mM 50mM 1.5mM
实施例3 200mM 10mM 2mM
实施例4 300mM 20mM 1mM
实施例5 400mM 10mM 2.5mM
实施例6 500mM 20mM 2.5mM
实施例2 300mM 20mM 0mM
实施例8 300mM 0mM 1mM
综上所述，本荧光PCR通用冻干保护剂组成简单，冷冻干燥程序简便，能够对冻干PCR试剂起到保护及赋形作用，不影响荧光PCR的扩增反应。使用优化的冻干保护剂冻干后外观成型致密，冻干前后试剂性能变化小，冻干后的产物稳定性好。
从以上实施例可以得出，实施例1-3制得的冻干外观较差，成型不均一，出现严重塌缩现象，但冻干保护剂仍旧可以起到保护效果；实施例4-6制得的冻干外观理想，PCR检测性能上表现良好，其中，实施例4的荧光PCR 检测性能表现最优，与液体试剂表现无明显差别；实施例2-8制得的冻干部分孔出现塌缩、脱皮现象，扩增性能尚可，但扩增检测曲线的线型较差或最大荧光信号值较弱。
上列实施例，对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步详 细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并 不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种荧光PCR冻干保护剂，其特征在于，包括D-海藻糖、PEG8000、D-山梨醇。
2.根据权利要求1所述的一种荧光PCR冻干保护剂，其特征在于，各组分浓度为：100～500mM D-海藻糖、0～2.5mM PEG8000、0～80mM D-山梨醇。
3.一种荧光PCR冻干保护剂的应用，其特征在于，所述荧光PCR冻干保护剂应用于含甘油的冻干保护体系中。
4.根据权利要求3所述的荧光PCR冻干保护剂的应用，其特征在于，其冻干条件如下：
1)预冻阶段：-45℃预冻2h；
2)干燥阶段：层板温度23～22℃条件下，抽真空至0～13Pa，保持13h。
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