CN111989410A

CN111989410A - 基于pcr的病毒快速检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN111989410A
Application number: CN202080001546.2A
Authority: CN
Inventors: 王春香; 郭金海; 肖欢欢
Original assignee: Cowin Biosciences Co ltd
Current assignee: Cowin Biosciences Co ltd
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2020-11-24
Also published as: US10975418B1; WO2022000152A1

Abstract

本发明提供病毒保保液，核酸扩增反应制剂(可以为冻干粉末形式)，基于qPCR的通过核酸扩增检测病毒的方法和PCR试剂盒。该病毒保存溶液可以在室温下长时间保存病毒样品并防止RNA降解。样品溶液可直接与核酸扩增反应制剂混合用于qPCR扩增，而无需进行病毒核酸提取步骤，可快速，高灵敏度检测病毒。

Description

基于PCR的病毒快速检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种病毒保存液、核酸扩增反应液、核酸PCR扩增方法、PCR扩增试剂盒。

背景技术

目前，常用的病毒RNA检测方法通常包括三个步骤：1)采集受试者的病毒样本并将样本转移到实验室；2)通过硅胶膜柱或磁珠吸附从病毒样本中提取病毒RNA；3)进行RT-PCR扩增和荧光定量检测(结果可以根据Ct值进行解释)。

在这种方法中，RNA提取试剂盒通常与病毒样品保存试剂盒及RT-qPCR检测试剂盒是相互分开的。另外，采集的样本中常含有RT-PCR聚合酶抑制剂，如果直接与PCR试剂混合，会阻碍核酸扩增。另外，通常情况下，病毒保存液需要在2-8度的条件下储存和运输，而常规RT-qPCR的检测试剂盒一般为液体制剂，需要-20摄氏度保存，且在运输过程中也需要冷藏(如用干冰)。病毒提取和PCR操作需要严格的生物安全标准以及实验室技术人员的经验和技能。最终的检测结果通常需要数小时才能得到。

总的来说，上述传统的检测方法繁琐、复杂，容易出错。它们的低效率会严重限制社会对紧急情况，如SARS-CoV-2病毒的爆发时的响应速度和有效地应对，并可能导致我们所不希望对隔离和治疗感染患者的延迟。

因此，本领域需要改进和简化的病毒RNA保存、提取和检测的配方、试剂盒和方法，以提高效率并降低出错概率。

发明内容

本发明提供了一种病毒保存液、核酸扩增反应制剂(可以为冻干粉形式)、基于qPCR的利用病毒保存液和核酸扩增反应制剂通过核酸扩增检测病毒的方法，以及含包括病毒保存液和核酸扩增反应制剂的PCR试剂盒。本发明的病毒保存液可以在室温下长时间保存病毒样品并防止RNA降解。该病毒保存液适于保存含有RNA病毒的病毒样品，例如冠状病毒，尤其是SARS-CoV-2病毒。样品溶液可直接与核酸扩增反应制剂联用，无需任何病毒核酸提取步骤而进行qPCR扩增，实现快速、高灵敏度的病毒检测。

一方面，本发明提供一种病毒保存液，其包含牛血清白蛋白(BSA)、鱼胶、表面活性剂、pH缓冲液，该病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间，例如，pH值8.0。pH缓冲液可包含TrisHCl。在一些实施例中，病毒保存液可进一步含KCl或MgCl₂中的至少一种，或两者都包含。在一些实施例中，病毒保存液可进一步含二甲基亚砜(DMSO)和甘油中的至少一种或两者都包含。病毒保存液还可以进一步包含在PCR反应中抑制Taq DNA聚合酶抑制剂的抑制剂。

在病毒保存液的一些实施例中，pH缓冲液包含Tris-HCl，并且在该溶液的总量中，Tris-HCl的摩尔浓度在10mM到200mM之间，BSA的质量浓度在1μg/μl到10μg/μl之间，鱼胶的质量百分比浓度在0.1％到2％之间。在一些实施例中，所述病毒保存液还包括KCl、MgCl₂、DMSO和甘油，并且在该溶液的总量中，其中KCl的摩尔浓度在10mM到200mM之间，MgCl₂的摩尔浓度在1.5到6mM之间，DMSO的体积百分比在0.1％到5％之间，甘油的体积百分比在1％～10％之间。

另一方面，本发明提供一种核酸扩增反应溶液，其包含M-MLV逆转录酶(MMLV)、TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和荧光探针。核酸扩增反应溶液可进一步包含KCl和/或MgCl₂、pH缓冲剂，例如Tris-HCl，以使溶液的pH保持在约8.0-8.5。所述核酸扩增反应溶液可进一步包括聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。

本发明还提供了一种通过冷冻干燥本文所述的核酸扩增反应溶液制备的冻干粉末。为了得到这种冻干粉末，核酸扩增反应液可以首先添加一种冻干保护剂，例如糖和/或PEG6000。

再一方面，提供了一种制备用于PCR扩增的病毒样本的方法。该方法包括将病毒样品首先与本文所述病毒保存液混合，然后再加入本文所述的核酸扩增反应溶液，或核酸扩增反应溶液冻干粉，从而获得PCR样品溶液。当病毒是RNA病毒、优选冠状病毒、更优选SARS-CoV-2病毒时，该方法可进一步包括对PCR样品溶液进行qPCR。qPCR的热循环条件包括：逆转录反应：45℃-60℃，优选50℃-55℃，0.5min-10min，优选0.5min-1min；热变性反应：94℃-99℃，1s-60s；扩增反应：94℃-99℃2s-5s，55℃-60℃10s-45s，优选10s-30s，进行多个循环，优选至少35个循环，或至少40个循环。

还有一方面，本发明提供了一种PCR扩增试剂盒，其包括存储在第一容器(例如一个小瓶)中的病毒保存液和在第二容器中如本文所述的核酸扩增反应制剂(溶液，或优选冻干粉末)。对于检测冠状病毒，例如SARS-CoV-2病毒，所述核酸扩增反应制剂可以包括适于其扩增和检测的引物和探针。该试剂盒进一步还可以包括含有已知核酸的阳性对照品，该已知核酸包含靶标的序列特征，以及含有不包含靶标序列特征的已知核酸的阴性对照品。

具体实施方式

本发明提供了病毒核酸保存液、核酸扩增反应制剂、含有病毒核酸保存液和核酸扩增反应制剂的试剂盒，以及制备和对病毒核酸进行PCR扩增的相关方法，能够快速，高灵敏度，准确地检测人类受试者的病毒感染情况。

如本文所述，本发明的所有溶液(病毒保存液和核酸扩增反应溶液)都是水基的，这意味着除了明确提供或提及的成分外，其余的成分是水。在本文所述的所有组合物(溶液、冻干粉末)中，所述组合物的任何成分的量/浓度/百分比系指所述组分在总组合物中的最终数量/浓度/百分比。

一方面，本发明提供了一种病毒保存液，其包含pH缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、鱼胶和表面活性剂，所述病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间，例如在约8.0。

在病毒保存液的一些实施例中，BSA的质量浓度可为1–10μg/μl，例如1–5μg/μl，并且鱼胶的质量百分比浓度可为0.1％–2％，例如，0.1％–1％。

pH缓冲液可包括Tris HCl缓冲液，其在总病毒保存液中的量为10mM–200mM。

在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括氯化钾和/或氯化镁。氯化镁离子浓度可直接关系DNA聚合酶的活性和DNA双链的解链温度，对反应的特异性及产物有显著影响。如下文所述，KCl和/或MgCl₂也可包括在核酸扩增反应制备中。在病毒保存液中，KCl的摩尔浓度为10mM–100mM，MgCl₂的摩尔浓度为1.5mM–6mM。在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括可抑制细菌生长的防腐剂，例如叠氮化钠(NaN₃)、硫柳汞、抗生素、生物杀伤剂(如pro-clin300等)，和/或一种或多种螯合剂，例如EDTA、CDTA、HEDTA、EGTA和EDDA等，其可保护RNA不被降解。在一些实施例中，NaN₃的浓度为溶液的0.01–0.1％(w/v)。在一些实施例中，EDTA的浓度可为0.1–5mM。

在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括二甲基亚砜和/或甘油。二甲基亚砜和甘油能促进核酸二级结构的打开，特别适用于GC含量高、二级结构复杂的模板扩增。二甲基亚砜的体积百分比可为0.1％-5％。甘油的体积百分比可为1％-10％。

在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括用于使病毒样本中可能存在的聚合酶抑制剂的抑制作用失活或降低的试剂，例如T4 gp32蛋白、亚精胺、PEG6000等。

在一些实施例中，表面活性剂可包含十二烷基硫酸钠(SDS)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)、NP-40(CAS号：9016-45-9)和Triton-100(CAS号：9002-93-1)中的一种或多种。在一些实施例中，这些表面活性剂每种浓度为0.01–0.1％(w/v)。

在一些实施例中，病毒保存液可包含以下成分(在溶液总量中)：Tris HCl，10–200mM；二甲基亚砜(v/v)，0.1％–5％；甘油(v/v)，1％–10％；BSA，1–10μg/μl；鱼胶：0.1％–2％(w/w)。

另一方面，本发明提供了一种核酸扩增反应溶液，其包括M-MLV逆转录酶(MMLV)、Taq DNA聚合酶、dNTP、适用于扩增目标核酸的PCR引物和适用于qPCR检测的荧光探针。

用核酸扩增反应液中的MMLV将RNA反向转录成cDNA。所选用的MMLV对抑制剂有很强的抗抑制性，可以用于加速反转录反应。Taq DNA聚合酶以靶序列为模板，与引物特异配对，在5′至3′方向合成DNA链。优选地，使用仅在高温下可激活的抗体修饰的Taq DNA聚合酶。

在一些实施例中，核酸扩增反应溶液可进一步包括KCl和MgCl₂。在一个实施例中，核酸扩增反应溶液中KCl的浓度可为10–200mM。

在一些实施例中，特别是如果核酸扩增反应溶液可能要随后冻干以制备冻干粉，则该溶液可包括糖(例如海藻糖、蔗糖)。糖可以保护逆转录酶和Taq DNA聚合酶在冻干过程中不发生变性或其他功能丧失(如下文所述)，并且可以提高酶的热稳定性和活性。

在一些实施例中，核酸扩增反应溶液可包括其它冻干保护剂，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甘露醇、山梨醇、卵磷脂和硫代硫酸钠。

在一些实施例中，核酸扩增反应溶液可进一步包括聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温-20)。

在一些实施例中，核酸扩增反应溶液可包括以下成分：MMLV，1–50U/μl；Taq DNA聚合酶，0.1–3U/μl；KCl，10–200mM；dNTP，0.05–0.5mM；引物0.05–0.5μM；探针0.05–0.5μM。在一些实施例中，核酸扩增反应溶液还可以包括糖，例如，海藻糖和/或蔗糖和聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。例如，海藻糖的质量浓度可以在1％到10％之间，蔗糖的质量浓度可以在1％到10％之间，聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯的质量浓度在0.005％到0.2％之间。

本文所述的核酸扩增反应液的量/浓度是指该溶液与预定量的病毒保存液(含病毒样品)混合并准备好进行qPCR扩增后这些成分的量/浓度。如本文所用，一单位(U)TaqDNA聚合酶定义为在65℃下60分钟内催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)加入酸可沉淀DNA链中所需的酶量。一单位(U)MMLV定义为：使用poly(A)为模板oligo(dT)为引物在37℃ 10分钟内将1nmol dTTP加入链中的酶量。

核酸扩增反应液中的引物和荧光探针可根据病毒的核酸设计或选择。例如，对于SARS-CoV-2病毒，可以使用基于ORF1ab和/或核衣壳蛋白基因(N基因)的引物序列。

为了便于储存和运输，可以将本文所述的核酸扩增反应溶液冻干以获得冻干粉末形式的制剂。这种冻干粉末形式的核酸扩增反应制剂可以在室温下储存和运输，同时保持良好的稳定性，而不会在较长时间内(例如，至少六个月)出现任何显著降解或功效下降。

核酸扩增反应液及其冻干粉形式统称为核酸扩增反应制剂。

在另一方面，本发明提供一种制备用于PCR扩增的病毒样本的方法。病毒样品可与本文所述的病毒保存液和核酸扩增反应制剂混合，且无需进一步提取或其他处理步骤，将其放置在适合qPCR仪器的适当反应板/容器中进行扩增。病毒保存液和核酸扩增反应制剂的联合作用可使扩增反应在30分钟内完成，例如在仅仅15分钟内完成。这大大缩短了病毒检测的时间，并可对严重疫情的情况下社会对病毒感染控制的反应策略产生重大影响，这个时候快速诊断起着关键作用。

在操作中，可以顺序或同时进行混合。例如，可以用咽拭子从受试者身上采集病毒样本，将拭子浸入病毒保存液中，摇匀混合，然后将该病毒保存液(装载病毒样本)与核酸扩增反应制剂混合。病毒样本也可首先保存在另一传统病毒收集溶液中，例如，Hanks平衡盐溶液或生理盐水，随后，收集溶液与本发明的病毒保存液混合，然后与核酸扩增反应制剂混合。该方法还可以包括在qPCR(或实时PCR)仪器上对含有样品的混合溶液进行PCR扩增，例如Applied Biosystems 7500实时PCR系统(ABI 7500)。

在另一方面，本发明提供了一种用于保存和扩增病毒核酸的试剂盒。该试剂盒包括存储在第一容器(例如小瓶)中的如本文所述的病毒保存液和在第二容器中如本文所述的核酸扩增反应制剂(溶液，或优选冻干粉)。该试剂盒还可以包括含有已知核酸的阳性对照品，该已知核酸包含靶标的序列特征，以及含有不包含靶标序列特征的已知核酸的阴性对照品。

本发明的组合物、溶液、试剂盒和方法特别适用于检测RNA病毒，优选冠状病毒，更优选SARS-CoV-2病毒。例如，RNA病毒的qPCR扩增的热循环条件可以如下：

·反转录：45℃–60℃(例如，50℃–55℃)，持续0.5分钟–10分钟(最好是为了加快实验，0.5分钟–1分钟)。

·热变性：94℃–99℃，10s–60s(例如，98℃下10s)；

·扩增反应：94℃–99℃，1s–10s(例如98℃1s)，55℃–60℃10s–45s(例如，58℃15s–30s)，多个循环(例如至少30个循环，典型的40到45个循环)

整个PCR扩增过程可在仅20-30分钟内完成，在某些情况下，15分钟或更短。

实施例

实施例1：不同病毒保存液的比较

以IBV病毒(鸡传染性支气管炎病毒，一种冠状病毒)为对照品，将不同稀释度的传染性支气管炎病毒保存在不同的病毒保存液中，然后将这些样品分别分为两份：一份用于直接PCR检测，另一份先提取病毒RNA，然后再对RNA进行PCR检测。我们比较了不同保存液的保存效果和灵敏度。

材料：

我们测试并比较了以下保存溶液：

保存液A:NaOH(20mmol/L)、表面活性剂(0.5％[w/v])、DMSO(5％[v/v])；蔗糖(8％[w/v])、Chelex-100(0.9％[w/v])。

保存液B：β-巯基乙醇(10mmol/L-15mmol/L)，8-羟基喹啉(0.05mol/L-0.1mol/L，醋酸钠(2mol/L-5mol/L)，十二烷基肌氨酸钠(5％-10％[w/v])，异硫氰酸胍(10％-15％[w/v])，Tris-HCl(0.01mol/L-0.05mol/L)，EDTA(0.01mol/L-0.05mol/L)，triton-100(0.1％-0.5％[v/v])，甘油(3％-8％[v/v])、叠氮化钠(0.08％-0.1％[w/v])。

保存溶液C：本发明的示例溶液(pH 8.0)，见表1：

表1

此外，还使用了其他保存溶液进行比较，包括1×PBS(10mM)；1/2×PBS，通过对1×PBS稀释2倍获得；1/4×PBS，通过对1×PBS稀释4倍获得。

操作流程：

制备IBV病毒，将IBV病毒稀释至1×10⁸拷贝/ml作为储备液。然后以1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/ml为模板，采用不同稀释倍数稀释制备了以下系列的溶液，作为模板直接扩增(不需要提取RNA步骤)。同时，在每个稀释水平取200μl溶液提取RNA(用50μl无RNA酶水洗脱，与直接扩增相比去除PCR反应抑制剂)，然后将其用作非直接扩增模板。

用IBV病毒特异性引物/探针进行PCR检测。

下表总结了用于直接扩增的试剂。

表2

组份	体积(总量50μL)
		4×onestep TaqMan Buffer	12.5
dNTP(10mM)	2
		IBV引物/探针(10μM)	2
Taq DNA聚合酶(5U/μl)	1
		MMLV(200U/μl)	2
模板	30.5

经RNA提取再扩增(或两步法)的试剂如下表所示：

表3

组份	体积(总量50μL)
		4×onestep TaqMan Buffer	12.5
dNTP(10mM)	2
		Taq DNA聚合酶(5U/μl)	1
MMLV(200U/μl)	2
		IBV引物/探针(10μM)	2
模板	8
		ddH<sub>2</sub>O	22.5

PCR反应热循环条件:

表4

在ABI 7500的软件界面上，将阈值设置为10000，将基线设置为6–20个循环。结果(Ct值)如下表所示：

表5

结果

从这些实验结果可以看出，本发明的病毒保存液(溶液C)可用于直接扩增检测，其灵敏度甚至高于非直接扩增组(提取的RNA作为模板)。此外，在所比较的不同配方中，本发明的病毒保存液对病毒核酸的保存效果最好。对于直接扩增，保存液C的Ct值比保存液A和B低6-7，相当于灵敏度高64-128倍。

实施例2：病毒核酸检测试剂盒及qPCR扩增

本实施例提供一种新的冠状病毒(SARS-CoV-2)样本的核酸扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括(1)SARS-CoV-2保存液，(2)SARS-CoV-2PCR扩增反应冻干粉，(3)阳性对照；和(4)阴性对照。

材料准备：

(1)SARS-CoV-2保存液(pH 8.0)按下表配制：

表6

试剂	终浓度
		NaOH	10–200mM
Tris.HCl	10–200mM
		KCl(2M)	10–100mM
MgCl<sub>2</sub>(1M)	1.5–6mM
		DMSO	1–5％(v/v)
甘油	1–10％(v/v)
		BSA	1–5ug/ul
鱼明胶	0.1–1％(w/w)

(2)SARS-CoV-2核酸扩增反应冻干粉:

根据SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因的RNA序列设计引物和探针如下：

ORF1ab-F：5'-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3'(SEQ ID NO:1),

ORF1ab-R:5'-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3'(SEQ ID NO:2),

ORF1ab-P:5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'(SEQ ID NO:3)；

N-F:5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'(SEQ ID NO:4)；

N-R:5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'(SEQ ID NO:5)；

N-P:5'-ROX-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ2-3'(SEQ ID NO:6).

以人ACTB基因作为内参照基因，引物探针序列如下:

ACTB-F:5'-CCATCCTGCGTCTGGACCT-3'(SEQ ID NO:7)；

ACTB-R:5'-CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG-3'(SEQ ID NO:8)；

ACTB-P:5'-VIC-ACTACCTCATGAAGATCCT-MGB-3'(SEQ ID NO:9).

根据下表所示配方制备25μL(pH 8.0)的溶液:

表7

然后用冻干机将溶液冻干，得到冻干粉。

(3)SARS-CoV-2阳性对照：

这种阳性对照是由两种假病毒混合获得的：一种含有RdRP基因附近的序列(NC_:13242-16236)，另一种含有N基因的全长序列(NC_—045512:28274-29533)。用(1)中的病毒保存液稀释假病毒，使其拷贝数浓度为10⁴拷贝/ml。

(4)SARS-CoV-2阴性对照：

阴性对照是一种带有内标ACTB基因的假病毒，不携带SARS-CoV-2RNA的序列。病毒保存液中RNA拷贝数浓度调为10⁴拷贝/ml。

测试步骤

将试剂盒中的SARS-CoV-2PCR扩增反应冻干粉、SARS-CoV-2阳性对照和SARS-CoV-2阴性对照品在室温下混合，低速离心10秒。

总反应次数为待测样品数加2(如果样本数为n，则反应总数为N＝n+2)。

将待检样品(病毒保存液中的实际SARS-CoV-2病毒，25μl)、SARS-CoV-2阳性质控品和SARS-CoV-2阴性质控品各25μl加入SARS-CoV-2PCR扩增反应冻干粉中。将膜封严或盖上PCR反应管盖，立即低速离心反应管。将PCR反应管转移到ABI 7500PCR系统的样品容器中，记录样品编号。下单。打开“反应参数”窗口，设置循环条件。反应程序参数如下表所示：

表8

根据扩增曲线的线型和Ct值对结果进行解释。ORF1ab基因的报告荧光为FAM，N基因的报告荧光为ROX，内部质控基因的报告荧光为VIC。

有效性判定：

只有同时满足以下条件1)、2)、3)时，该实验视为有效，否则视为无效：

(1)阳性质控：FAM和ROX通道具有典型的S型扩增曲线，Ct值<37；VIC通道具有典型的S型扩增曲线，Ct值<37。

(2)阴性质控：FAM、ROX通道值Ct>37或无Ct值，线型为直线或轻微倾斜的斜线，无典型的S型扩增曲线。VIC通道呈典型的S型扩增曲线，CT值<37。

(3)待测样品：VIC通道具有典型的S型扩增曲线。

样品测试结果判定

PCR扩增反应结束后，测试样品的结果自动保存，并根据分析图像调整基线的起始值、结束值和阈值。检测结果可在报告窗口中读取，并根据下表进行解释。

表9

SARS-CoV-2检测试剂盒及荧光PCR扩增

评估本发明的病毒核酸检测试剂盒(含测试样品、阳性对照品和阴性对照品)的性能。本程序使用7个样品，如下表所示。

表10

检测方法：本发明试剂盒不需要核酸提取步骤，用咽拭子采集样品并保存在病毒保存液中，即可立即进行PCR扩增反应。

PCR反应体系制备：在PCR扩增冻干粉中加入25μl含病毒样品的病毒保存液。

PCR扩增条件如下表所示：

表11

试验结果：阈值设置为10000，基线设置为6-15个周期，Ct值汇总如下表。

表12

	样本1	样本2	样本3	样本4	样本5	阳性对照	阴性对照
								FAM(ORF)	31.34	32.68	34.23	35.75	37.49	25.65	N/A
VIC	27.2	27.59	27.41	27.72	27.49	27.61	27.65
								ROX(N)	29.33	30.53	31.35	32.77	33.4	28.94	N/A

试验结果表明，本发明试剂盒通过按直接扩增法进行病毒检测，可成功检测稀释160倍的阳性样品。

尽管已经通过本发明的特定实施例的描述说明了本发明，并且尽管已经相当详细地描述了实施例，但是其并不旨在将所附权利要求的范围以任何方式限制于这些细节中。本文讨论的各种特征可以单独使用或以任何组合使用。其他优点和修改对本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明在其更广泛的方面不限于所描述的具体制剂，试剂盒和方法以及说明性实施例。因此，可以在不脱离本发明总体构思的范围或精神的情况下做各种修改调整。

序列表

<110> 江苏康为世纪生物科技有限公司

<120> 基于PCR的病毒快速检测方法及其试剂盒

<130> CWN-001

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ccatcctgcg tctggacct 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ccgtggtggt gaagctgtag 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

actacctcat gaagatcct 19

Claims

1.一种病毒保存液，包括：

牛血清白蛋白、鱼明胶、表面活性剂、pH缓冲液，所述病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间。

2.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述pH缓冲剂包含Tris HCl。

3.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含一种螯合剂，优选EDTA。

4.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含防腐剂，较佳为NaN₃。

5.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含：二甲基亚砜及甘油。

6.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含：在PCR反应中抑制Taq DNA聚合酶抑制剂的抑制成分。

7.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述pH缓冲液包含Tris HCl，且在该溶液之总量中：

Tris-HCl的摩尔浓度在10mM到200mM之间，

牛血清白蛋白的质量浓度在1μg/μl到10μg/μl之间，并且

鱼明胶的质量百分比浓度在0.1％～2％之间。

8.根据权利要求7所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含二甲基亚砜及甘油，且在该溶液之总量中：

二甲基亚砜的体积百分比在0.1％到5％之间，

甘油的体积百分比在1％到10％之间。

9.一种核酸扩增反应溶液，包括：

M-MLV逆转录酶(MMLV)、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和荧光探针。

10.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含KCl。

11.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含MgCl₂。

12.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。

13.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含pH缓冲液。

14.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含KCl及聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，其中在该溶液已重配后并准备好进行qPCR反应的溶液总量中：

dNTP的浓度在0.05mM到0.5mM之间，

引物的浓度在0.05μM和0.5μM之间，

荧光探针的浓度为0.05μM和0.5μM之间，

MMLV的浓度在1U/μl和50U/μl之间，并且

Taq DNA聚合酶的浓度在0.1U/μl～3U/μl之间。

15.根据权利要求14所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含至少一种糖。

16.根据权利要求15所述的核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述至少一种糖包括海藻糖或蔗糖，所述核酸扩增反应溶液进一步包含聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，当在所述溶液重配后并准备好进行qPCR反应时：

海藻糖的重量浓度在1％到10％之间，

蔗糖的重量浓度可以在1％到10％之间，并且

聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯的质量浓度在0.005％到0.2％之间。

17.根据权利要求9-14中任一权利要求所述的核酸扩增反应溶液与冻干保护剂冻干制备的冻干粉末。

18.根据权利要求17所述的冻干粉末，其特征在于，所述冻干保护剂包含至少一种糖。

19.根据权利要求17所述冻干粉末，其特征在于，所述冻干保护剂包含PEG。

20.根据权利要求9-16中任一权利要求所述的核酸扩增反应溶液冻干制备的冻干粉。

21.一种用于对RNA病毒样本中的核酸进行PCR扩增的冻干粉末，其特征在于，所述冻干粉包括：MMLV、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、荧光探针。

22.根据权利要求21所述冻干粉，其特征在于，所述冻干粉还包含：Tris HCl、氯化钾、海藻糖及蔗糖中至少一种或两者，及可选的，PEG6000或聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。

23.一种用于制备病毒扩增的样品的方法，包括步骤：

将病毒样本与以下组分混合：

(1)如权利要求1-8中任一权利要求所述病毒保存液，以及

(2)如权利要求9-16中任一权利要求所述核酸扩增反应溶液，或

如权利要求17-22中任一权利要求所述冻干粉，

从而获得PCR样品溶液。

24.根据权利要求23所述方法，其特征在于，所述PCR样本溶液中：

dNTP的浓度在0.05mM到0.5mM之间，

引物的浓度在0.05μM和0.5μM之间，

荧光探针的浓度为0.05μM和0.5μM，

MMLV的浓度在1U/μl和50U/μl之间，并且

Taq DNA聚合酶的浓度在0.1U/μl～3U/μl之间。

25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述病毒样本包括RNA病毒，优选冠状病毒、更优选SARS-CoV-2病毒，所述方法还包括：

对PCR样品溶液进行qPCR反应。

26.根据权利要求25所述方法，其特征在于，所述qPCR的热循环条件包括：

反转录反应：45℃～60℃，优选50℃～55℃，0.5min～10min，优选0.5min～1min；

热变性反应：94℃-99℃，10s-60s；

PCR扩增反应：94℃–99℃1s–10s，55℃–60℃10s–45s，优选10s–30s，多个循环，优选至少35个循环，或至少40个循环。

27.一种PCR扩增试剂盒，包括：

(a)如权利要求1-8中任一权利要求所述的病毒保存液，其储存于第一容器中；及

(b)(b1)根据权利要求9-16中任一权利要求所述的核酸扩增反应溶液和(b2)根据权利要求17-22中任一权利要求所述的冻干粉末二者中的一种，储存在第二个单独的容器中。

28.如权利要求27所述PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒适于检测靶RNA病毒、特别适于检测冠状病毒，更适合于检测SARS-CoV-2病毒。