CN113151583A - 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可直接扩增含SARS CoV‑2病毒样本的检测试剂盒，包括样本处理液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、阴性对照、阳性对照以及内标；其中，所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂；所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs；所述反应试剂B包括如SEQ ID NO.1‑6所示的引物探针组；所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij；所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括：Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor；还涉及一种采用如上述检测试剂盒的直接扩增检测方法。本发明操作简单，无需专业且繁琐的抽提试剂和抽提仪器，快速裂解样本并直接用于检测，有效缩短样本处理流程，减少PCR检测所用时间，快速提供核酸检测结果。

Description

一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检 测方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样 本的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
2019-nCoV感染者临床症状以发热、乏力、干咳为主要表现，鼻塞、流涕等 上呼吸道症状少见，会出现缺氧低氧状态。部分患者多在一周后出现呼吸困难， 严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒 和出凝血功能障碍。
当前市面上有大量的新型冠状病毒检测试剂盒，主要有荧光-PCR法、联合 探针锚定聚合测序法、恒温扩增芯片法、磁微粒化学发光法、杂交捕获免疫荧光 法、胶体金法等。
上述所有试剂盒大部分以鼻咽拭子、鼻拭子或前鼻拭子为检测对象，通过对 待测样本中新型冠状病毒RNA的提取，扩增实现检测；此外胶体金法以血液样 本为检测对象，直接进行抗原抗体的检测。
当前以新冠状病毒RNA为检测对象的试剂盒均需要对病毒RNA模板使用 特定的试剂盒先进行RNA核酸的提取，无法直接扩增检测；以新型冠状病毒抗 原抗体为检测对象的试剂盒虽可直接使用血液进行检测，但检测灵敏度远低于以 RNA为检测对象的试剂盒，且为有创伤采集。
因此，亟需一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测 方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测 试剂盒，包括样本处理液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反 应试剂B、反应试剂C、阴性对照、阳性对照以及内标；
样本处理液可快速灭活病毒，并在常温或加热状态下裂解病毒，释放病毒核 酸；热启动抗抑制DNA聚合酶是以野生型DNA聚合酶为原料，采用基因改造 技术对DNA聚合酶的特定位点进行突变改造，并对改造后的聚合酶进行抗抑制 检测，最终筛选出具有高效抗抑制性能的DNA聚合酶，并采用化学修饰的方法 对该DNA聚合酶进行修饰，从而获得的；反应试剂A为扩增所需的盐溶液；反 应试剂B为检测所用的引物探针组；反应试剂C为PCR增强剂，可有效抵抗新 型冠状病毒样本中的抑制剂，配合专用的PCR扩增体系，可高效检测样本中核 酸。
其中，所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂；
所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs；
所述反应试剂B包括：
Figure BDA0002867109840000021
所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij；
所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括：Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor。
优选地，所述样本处理液包括2mM-20mM的EDTA、0.1％-10％的SDS以 及去垢剂。
优选地，所述去垢剂包括0.01％-5％的Tween20、0.01％-5％的NP40或 0.01％-5％的Triton X100中的一种或多种。
优选地，所述样本处理液包括1mM的EDTA、0.5％的SDS以及1.5％的 Tween20。
优选地，所述反应试剂A包括50mM的Tris、30mM的硫酸铵、4mM的氯 化镁以及2mM的dNTPs。
优选地，所述引物探针组中每条引物为300nM，每条探针为150nM。
优选地，所述反应试剂C包括0.01mg/mL-1mg/mL的BSA、0.02％-10％的明 胶以及0.01％-5％的Brij。
优选地，所述反应试剂C包括0.05mg/mL的BSA、0.05％的明胶以及0.02％ 的Brij。
所述反应试剂C中的Brij也可替换为其他去垢剂，例如：Tween20、NP40 或TritonX100等。
本发明的第二方面是提供一种采用如上述检测试剂盒的直接扩增检测方法， 步骤包括：
取样本拭子、阴性对照拭子或阳性对照拭子中的一种，放入含400μL样本 处理液的样本管中，剧烈震荡10-120s后，丢弃拭子，再次剧烈震荡10-120s， 取5μL采用直接扩增法进行检测；
其中，所述检测时的PCR反应过程为：
Figure BDA0002867109840000031
Figure BDA0002867109840000041
所述检测时的PCR反应体系包括：
Figure BDA0002867109840000042
优选地，所述剧烈震荡的时长为30s。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明通过样本处理液快速灭活并释放病毒核酸，并利用PCR直接扩增技 术，快速富集并扩增目的区域，以用于确定待检样本中是否有新型冠状病毒 RNA；该试剂盒操作简单，无需专业且繁琐的抽提试剂和抽提仪器，快速裂解样 本并直接用于检测，有效缩短样本处理流程，减少PCR检测所用时间，快速提 供核酸检测结果。
附图说明
图1为本发明实施例1的内标扩增曲线；
图2为本发明实施例2的内标扩增曲线。
具体实施方式
提供一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒，包括样本处理 液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、 阴性对照、阳性对照以及内标；
样本处理液可快速灭活病毒，并在常温或加热状态下裂解病毒，释放病毒核 酸；热启动抗抑制DNA聚合酶是以野生型DNA聚合酶为原料，采用基因改造 技术对DNA聚合酶的特定位点进行突变改造，并对改造后的聚合酶进行抗抑制 检测，最终筛选出具有高效抗抑制性能的DNA聚合酶，并采用化学修饰的方法 对该DNA聚合酶进行修饰，从而获得的；反应试剂A为扩增所需的盐溶液；反 应试剂B为检测所用的引物探针组；反应试剂C为PCR增强剂，可有效抵抗新 型冠状病毒样本中的抑制剂，配合专用的PCR扩增体系，可高效检测样本中核 酸。
其中，所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂；
所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs；
所述反应试剂B包括：
Figure BDA0002867109840000051
所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij；
所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括：Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor。
优选地，所述样本处理液包括2mM-20mM的EDTA、0.1％-10％的SDS以 及去垢剂。
优选地，所述去垢剂包括0.01％-5％的Tween20、0.01％-5％的NP40或 0.01％-5％的Triton X100中的一种或多种。
优选地，所述样本处理液包括1mM的EDTA、0.5％的SDS以及1.5％的 Tween20。
优选地，所述反应试剂A包括50mM的Tris、30mM的硫酸铵、4mM的氯 化镁以及2mM的dNTPs。
优选地，所述引物探针组中每条引物为300nM，每条探针为150nM。
优选地，所述反应试剂C包括0.01mg/mL-1mg/mL的BSA、0.02％-10％的明 胶以及0.01％-5％的Brij。
优选地，所述反应试剂C包括0.05mg/mL的BSA、0.05％的明胶以及0.02％ 的Brij。
再提供一种采用如上述检测试剂盒的直接扩增检测方法，步骤包括：
取样本拭子、阴性对照拭子或阳性对照拭子中的一种，放入含400μL样本 处理液的样本管中，剧烈震荡10-120s后，丢弃拭子，再次剧烈震荡10-120s， 取5μL采用直接扩增法进行检测；
其中，所述检测时的PCR反应过程为：
Figure BDA0002867109840000061
所述检测时的PCR反应体系包括：
Figure BDA0002867109840000062
优选地，所述剧烈震荡的时长为30s。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全 部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳 动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可 以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限 定。
实施例1
取新型冠状病毒阴性患者鼻咽拭子10例，放入含400μL样本处理液的样本 管中，剧烈震荡30s后，丢弃拭子，再次剧烈震荡30s，取5μL采用上述直接扩 增方法进行检测，检测结果均为阴性。
其中，所采用的PCR仪器为ABI 7500，内标扩增曲线如图1所示，待检样 本中N和ORF1ab均未检出。
实施例2
取新型冠状病毒阴性患者咽拭子10例，放入含400μL样本处理液的样本管 中，剧烈震荡30s后，丢弃拭子，再次剧烈震荡30s，取5μL采用上述直接扩增 方法进行检测，检测结果均为阴性。
其中，所采用的PCR仪器为ABI 7500，内标扩增曲线如图2所示，待检样 本中N和ORF1ab基因均未检出。
实施例3
将阴性鼻咽拭子的样本处理液混合并与新型冠状病毒灭活病毒培养物 (NR-52287)混合后处理，分别配制成不同浓度，3倍浓度倍比稀释，用于初步 摸索样本直接扩增法的检测限，并最终通过20从重复检测确定最低检测限，20 次重复检测阳性率需≥95％，经确认检测限即LoD定义为1.1E+04cp/mL。
其中，所采用的PCR仪器为Thermo的QuantStudio Dx 96。
3倍浓度倍比稀释摸索检测限数据如下：
表1
Figure BDA0002867109840000071
Figure BDA0002867109840000081
其中，N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
20次重复试验验证检测限数据如下(检出率≥95％)：
表2
Figure BDA0002867109840000082
Figure BDA0002867109840000091
Figure BDA0002867109840000101
其中，N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
实施例4
取新型冠状病毒阳性患者鼻咽拭子10例(浓度不低于直扩试剂盒LoD，即 1.1E+04cp/mL)，放入含400μL样本处理液的样本管中，剧烈震荡30s后，丢弃 拭子，再次剧烈震荡30s，取5μL采用上述直接扩增方法进行检测，检测结果均 为阳性。
其中，所采用的PCR仪器为Thermo的QuantStudio Dx 96。
表3
Figure BDA0002867109840000102
Figure BDA0002867109840000111
其中，N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
实施例5
取新型冠状病毒阳性患者鼻拭子10例(浓度不低于直扩试剂盒LoD，即 1.1E+04cp/mL)，放入含400μL样本处理液的样本管中，剧烈震荡30s后，丢弃 拭子，再次剧烈震荡30s，取5μL采用直接扩增方法进行检测，检测结果均为阳 性。
其中，所采用的PCR仪器为Thermo的QuantStudio Dx 96。
表4
样本编号 IC Ct N Ct ORF1ab Ct 结论
S1 32.70 33.42 33.30 SARS-CoV-2阳性
S2 34.26 34.40 36.40 SARS-CoV-2阳性
S3 34.28 35.00 36.41 SARS-CoV-2阳性
S4 34.25 34.39 36.56 SARS-CoV-2阳性
S5 34.04 34.19 33.40 SARS-CoV-2阳性
S6 33.67 34.74 33.64 SARS-CoV-2阳性
S7 33.75 33.90 33.14 SARS-CoV-2阳性
S8 36.94 37.18 38.14 SARS-CoV-2阳性
S9 36.81 37.63 / SARS-CoV-2阳性
S10 36.96 36.69 38.86 SARS-CoV-2阳性
注：N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护 范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内 容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保 护范围内。
序列表
<110> 苏州新波生物技术有限公司
<120> 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims (10)

1.一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒，其特征在于，包括样本处理液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、阴性对照、阳性对照以及内标；
其中，所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂；
所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs；
所述反应试剂B包括如SEQ ID NO.1-6所示的引物探针组；
所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij；
所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括：Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括2mM-20mM的EDTA、0.1％-10％的SDS以及去垢剂。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述去垢剂包括0.01％-5％的Tween20、0.01％-5％的NP40或0.01％-5％的Triton X100中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括1mM的EDTA、0.5％的SDS以及1.5％的Tween20。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂A包括50mM的Tris、30mM的硫酸铵、4mM的氯化镁以及2mM的dNTPs。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针组中每条引物为300nM，每条探针为150nM。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂C包括0.01mg/mL-1mg/mL的BSA、0.02％-10％的明胶以及0.01％-5％的Brij。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂C包括0.05mg/mL的BSA、0.05％的明胶以及0.02％的Brij。
9.一种采用如权利要求1-8任一项所述检测试剂盒的直接扩增检测方法，其特征在于，步骤包括：
取样本拭子、阴性对照拭子或阳性对照拭子中的一种，放入含400μL样本处理液的样本管中，剧烈震荡10-120s后，丢弃拭子，再次剧烈震荡10-120s，取5μL采用直接扩增法进行检测；
其中，所述检测时的PCR反应过程为：
Figure FDA0002867109830000021
所述检测时的PCR反应体系包括：
Figure FDA0002867109830000022
10.根据权利要求1所述的直接扩增检测方法，其特征在于，所述剧烈震荡的时长为30s。
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