CN113151583A - 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151583A CN113151583A CN202011591473.5A CN202011591473A CN113151583A CN 113151583 A CN113151583 A CN 113151583A CN 202011591473 A CN202011591473 A CN 202011591473A CN 113151583 A CN113151583 A CN 113151583A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- reaction reagent
- sample
- swab
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 76
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- -1 NP40 Polymers 0.000 description 1
- 206010028748 Nasal obstruction Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108091006367 SARS-CoV-2 Spike Subunit S2 Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种可直接扩增含SARS CoV‑2病毒样本的检测试剂盒,包括样本处理液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、阴性对照、阳性对照以及内标;其中,所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂;所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs;所述反应试剂B包括如SEQ ID NO.1‑6所示的引物探针组;所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij;所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括:Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor;还涉及一种采用如上述检测试剂盒的直接扩增检测方法。本发明操作简单,无需专业且繁琐的抽提试剂和抽提仪器,快速裂解样本并直接用于检测,有效缩短样本处理流程,减少PCR检测所用时间,快速提供核酸检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,尤其涉及一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样 本的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
2019-nCoV感染者临床症状以发热、乏力、干咳为主要表现,鼻塞、流涕等 上呼吸道症状少见,会出现缺氧低氧状态。部分患者多在一周后出现呼吸困难, 严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒 和出凝血功能障碍。
当前市面上有大量的新型冠状病毒检测试剂盒,主要有荧光-PCR法、联合 探针锚定聚合测序法、恒温扩增芯片法、磁微粒化学发光法、杂交捕获免疫荧光 法、胶体金法等。
上述所有试剂盒大部分以鼻咽拭子、鼻拭子或前鼻拭子为检测对象,通过对 待测样本中新型冠状病毒RNA的提取,扩增实现检测;此外胶体金法以血液样 本为检测对象,直接进行抗原抗体的检测。
当前以新冠状病毒RNA为检测对象的试剂盒均需要对病毒RNA模板使用 特定的试剂盒先进行RNA核酸的提取,无法直接扩增检测;以新型冠状病毒抗 原抗体为检测对象的试剂盒虽可直接使用血液进行检测,但检测灵敏度远低于以 RNA为检测对象的试剂盒,且为有创伤采集。
因此,亟需一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测 方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
本发明的第一方面是提供一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测 试剂盒,包括样本处理液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反 应试剂B、反应试剂C、阴性对照、阳性对照以及内标;
样本处理液可快速灭活病毒,并在常温或加热状态下裂解病毒,释放病毒核 酸;热启动抗抑制DNA聚合酶是以野生型DNA聚合酶为原料,采用基因改造 技术对DNA聚合酶的特定位点进行突变改造,并对改造后的聚合酶进行抗抑制 检测,最终筛选出具有高效抗抑制性能的DNA聚合酶,并采用化学修饰的方法 对该DNA聚合酶进行修饰,从而获得的;反应试剂A为扩增所需的盐溶液;反 应试剂B为检测所用的引物探针组;反应试剂C为PCR增强剂,可有效抵抗新 型冠状病毒样本中的抑制剂,配合专用的PCR扩增体系,可高效检测样本中核 酸。
其中,所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂;
所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs;
所述反应试剂B包括:
所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij;
所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括:Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor。
优选地,所述样本处理液包括2mM-20mM的EDTA、0.1%-10%的SDS以 及去垢剂。
优选地,所述去垢剂包括0.01%-5%的Tween20、0.01%-5%的NP40或 0.01%-5%的Triton X100中的一种或多种。
优选地,所述样本处理液包括1mM的EDTA、0.5%的SDS以及1.5%的 Tween20。
优选地,所述反应试剂A包括50mM的Tris、30mM的硫酸铵、4mM的氯 化镁以及2mM的dNTPs。
优选地,所述引物探针组中每条引物为300nM,每条探针为150nM。
优选地,所述反应试剂C包括0.01mg/mL-1mg/mL的BSA、0.02%-10%的明 胶以及0.01%-5%的Brij。
优选地,所述反应试剂C包括0.05mg/mL的BSA、0.05%的明胶以及0.02% 的Brij。
所述反应试剂C中的Brij也可替换为其他去垢剂,例如:Tween20、NP40 或TritonX100等。
本发明的第二方面是提供一种采用如上述检测试剂盒的直接扩增检测方法, 步骤包括:
取样本拭子、阴性对照拭子或阳性对照拭子中的一种,放入含400μL样本 处理液的样本管中,剧烈震荡10-120s后,丢弃拭子,再次剧烈震荡10-120s, 取5μL采用直接扩增法进行检测;
其中,所述检测时的PCR反应过程为:
所述检测时的PCR反应体系包括:
优选地,所述剧烈震荡的时长为30s。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:
本发明通过样本处理液快速灭活并释放病毒核酸,并利用PCR直接扩增技 术,快速富集并扩增目的区域,以用于确定待检样本中是否有新型冠状病毒 RNA;该试剂盒操作简单,无需专业且繁琐的抽提试剂和抽提仪器,快速裂解样 本并直接用于检测,有效缩短样本处理流程,减少PCR检测所用时间,快速提 供核酸检测结果。
附图说明
图1为本发明实施例1的内标扩增曲线;
图2为本发明实施例2的内标扩增曲线。
具体实施方式
提供一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒,包括样本处理 液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、 阴性对照、阳性对照以及内标;
样本处理液可快速灭活病毒,并在常温或加热状态下裂解病毒,释放病毒核 酸;热启动抗抑制DNA聚合酶是以野生型DNA聚合酶为原料,采用基因改造 技术对DNA聚合酶的特定位点进行突变改造,并对改造后的聚合酶进行抗抑制 检测,最终筛选出具有高效抗抑制性能的DNA聚合酶,并采用化学修饰的方法 对该DNA聚合酶进行修饰,从而获得的;反应试剂A为扩增所需的盐溶液;反 应试剂B为检测所用的引物探针组;反应试剂C为PCR增强剂,可有效抵抗新 型冠状病毒样本中的抑制剂,配合专用的PCR扩增体系,可高效检测样本中核 酸。
其中,所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂;
所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs;
所述反应试剂B包括:
所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij;
所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括:Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor。
优选地,所述样本处理液包括2mM-20mM的EDTA、0.1%-10%的SDS以 及去垢剂。
优选地,所述去垢剂包括0.01%-5%的Tween20、0.01%-5%的NP40或 0.01%-5%的Triton X100中的一种或多种。
优选地,所述样本处理液包括1mM的EDTA、0.5%的SDS以及1.5%的 Tween20。
优选地,所述反应试剂A包括50mM的Tris、30mM的硫酸铵、4mM的氯 化镁以及2mM的dNTPs。
优选地,所述引物探针组中每条引物为300nM,每条探针为150nM。
优选地,所述反应试剂C包括0.01mg/mL-1mg/mL的BSA、0.02%-10%的明 胶以及0.01%-5%的Brij。
优选地,所述反应试剂C包括0.05mg/mL的BSA、0.05%的明胶以及0.02% 的Brij。
再提供一种采用如上述检测试剂盒的直接扩增检测方法,步骤包括:
取样本拭子、阴性对照拭子或阳性对照拭子中的一种,放入含400μL样本 处理液的样本管中,剧烈震荡10-120s后,丢弃拭子,再次剧烈震荡10-120s, 取5μL采用直接扩增法进行检测;
其中,所述检测时的PCR反应过程为:
所述检测时的PCR反应体系包括:
优选地,所述剧烈震荡的时长为30s。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全 部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳 动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可 以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为本发明的限 定。
实施例1
取新型冠状病毒阴性患者鼻咽拭子10例,放入含400μL样本处理液的样本 管中,剧烈震荡30s后,丢弃拭子,再次剧烈震荡30s,取5μL采用上述直接扩 增方法进行检测,检测结果均为阴性。
其中,所采用的PCR仪器为ABI 7500,内标扩增曲线如图1所示,待检样 本中N和ORF1ab均未检出。
实施例2
取新型冠状病毒阴性患者咽拭子10例,放入含400μL样本处理液的样本管 中,剧烈震荡30s后,丢弃拭子,再次剧烈震荡30s,取5μL采用上述直接扩增 方法进行检测,检测结果均为阴性。
其中,所采用的PCR仪器为ABI 7500,内标扩增曲线如图2所示,待检样 本中N和ORF1ab基因均未检出。
实施例3
将阴性鼻咽拭子的样本处理液混合并与新型冠状病毒灭活病毒培养物 (NR-52287)混合后处理,分别配制成不同浓度,3倍浓度倍比稀释,用于初步 摸索样本直接扩增法的检测限,并最终通过20从重复检测确定最低检测限,20 次重复检测阳性率需≥95%,经确认检测限即LoD定义为1.1E+04cp/mL。
其中,所采用的PCR仪器为Thermo的QuantStudio Dx 96。
3倍浓度倍比稀释摸索检测限数据如下:
表1
其中,N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
20次重复试验验证检测限数据如下(检出率≥95%):
表2
其中,N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
实施例4
取新型冠状病毒阳性患者鼻咽拭子10例(浓度不低于直扩试剂盒LoD,即 1.1E+04cp/mL),放入含400μL样本处理液的样本管中,剧烈震荡30s后,丢弃 拭子,再次剧烈震荡30s,取5μL采用上述直接扩增方法进行检测,检测结果均 为阳性。
其中,所采用的PCR仪器为Thermo的QuantStudio Dx 96。
表3
其中,N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
实施例5
取新型冠状病毒阳性患者鼻拭子10例(浓度不低于直扩试剂盒LoD,即 1.1E+04cp/mL),放入含400μL样本处理液的样本管中,剧烈震荡30s后,丢弃 拭子,再次剧烈震荡30s,取5μL采用直接扩增方法进行检测,检测结果均为阳 性。
其中,所采用的PCR仪器为Thermo的QuantStudio Dx 96。
表4
样本编号 | IC Ct | N Ct | ORF1ab Ct | 结论 |
S1 | 32.70 | 33.42 | 33.30 | SARS-CoV-2阳性 |
S2 | 34.26 | 34.40 | 36.40 | SARS-CoV-2阳性 |
S3 | 34.28 | 35.00 | 36.41 | SARS-CoV-2阳性 |
S4 | 34.25 | 34.39 | 36.56 | SARS-CoV-2阳性 |
S5 | 34.04 | 34.19 | 33.40 | SARS-CoV-2阳性 |
S6 | 33.67 | 34.74 | 33.64 | SARS-CoV-2阳性 |
S7 | 33.75 | 33.90 | 33.14 | SARS-CoV-2阳性 |
S8 | 36.94 | 37.18 | 38.14 | SARS-CoV-2阳性 |
S9 | 36.81 | 37.63 | / | SARS-CoV-2阳性 |
S10 | 36.96 | 36.69 | 38.86 | SARS-CoV-2阳性 |
注:N与ORF1ab任一基因Ct≤42时定义为该样本为SARS-CoV-2阳性。
以上所述仅为本发明较佳的实施例,并非因此限制本发明的实施方式及保护 范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内 容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,均应当包含在本发明的保 护范围内。
序列表
<110> 苏州新波生物技术有限公司
<120> 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
Claims (10)
1.一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒,其特征在于,包括样本处理液、热启动抗抑制DNA聚合酶混合液、反应试剂A、反应试剂B、反应试剂C、阴性对照、阳性对照以及内标;
其中,所述样本处理液包括EDTA、SDS以及去垢剂;
所述反应试剂A包括Tris、硫酸铵、氯化镁以及dNTPs;
所述反应试剂B包括如SEQ ID NO.1-6所示的引物探针组;
所述反应试剂C包括BSA、明胶以及Brij;
所述热启动抗抑制DNA聚合酶混合液包括:Taq、MMLV、UNG以及RNase Inhibitor。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述样本处理液包括2mM-20mM的EDTA、0.1%-10%的SDS以及去垢剂。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述去垢剂包括0.01%-5%的Tween20、0.01%-5%的NP40或0.01%-5%的Triton X100中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述样本处理液包括1mM的EDTA、0.5%的SDS以及1.5%的Tween20。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述反应试剂A包括50mM的Tris、30mM的硫酸铵、4mM的氯化镁以及2mM的dNTPs。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述引物探针组中每条引物为300nM,每条探针为150nM。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述反应试剂C包括0.01mg/mL-1mg/mL的BSA、0.02%-10%的明胶以及0.01%-5%的Brij。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述反应试剂C包括0.05mg/mL的BSA、0.05%的明胶以及0.02%的Brij。
10.根据权利要求1所述的直接扩增检测方法,其特征在于,所述剧烈震荡的时长为30s。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011591473.5A CN113151583A (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011591473.5A CN113151583A (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113151583A true CN113151583A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76878294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011591473.5A Pending CN113151583A (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113151583A (zh) |
Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090155777A1 (en) * | 2005-02-28 | 2009-06-18 | Bioquest, Inc. | Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules |
CN110982876A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-04-10 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 |
CN111139317A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-05-12 | 欧陆分析技术服务(苏州)有限公司 | 一种sars-cov-2病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN111273026A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-12 | 无锡市人民医院 | 一种新型冠状肺炎病毒快速检测试纸条及其应用 |
CN111270014A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-06-12 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒 |
CN111304175A (zh) * | 2020-02-15 | 2020-06-19 | 南京尧顺禹生物科技有限公司 | 一种用于病毒核酸临床检测的病毒样品保存液及其使用方法 |
CN111321123A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-06-23 | 北京天恩泽基因科技有限公司 | 一种免核酸提取的病毒保存液 |
CN111534576A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-08-14 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途 |
CN111925941A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-11-13 | 北京健为医学检验实验室有限公司 | 一种病毒保存液及其应用 |
CN111989410A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-11-24 | 江苏康为世纪生物科技有限公司 | 基于pcr的病毒快速检测方法及其试剂盒 |
CN112111597A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-12-22 | 安徽同科生物科技有限公司 | 一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒 |
JP2022153338A (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅用組成物の保存安定性の向上方法 |
-
2020
- 2020-12-29 CN CN202011591473.5A patent/CN113151583A/zh active Pending
Patent Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090155777A1 (en) * | 2005-02-28 | 2009-06-18 | Bioquest, Inc. | Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules |
CN111304175A (zh) * | 2020-02-15 | 2020-06-19 | 南京尧顺禹生物科技有限公司 | 一种用于病毒核酸临床检测的病毒样品保存液及其使用方法 |
CN111273026A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-12 | 无锡市人民医院 | 一种新型冠状肺炎病毒快速检测试纸条及其应用 |
CN110982876A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-04-10 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 |
CN111321123A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-06-23 | 北京天恩泽基因科技有限公司 | 一种免核酸提取的病毒保存液 |
CN111139317A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-05-12 | 欧陆分析技术服务(苏州)有限公司 | 一种sars-cov-2病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN111270014A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-06-12 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒 |
CN112111597A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-12-22 | 安徽同科生物科技有限公司 | 一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒 |
CN111989410A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-11-24 | 江苏康为世纪生物科技有限公司 | 基于pcr的病毒快速检测方法及其试剂盒 |
CN111534576A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-08-14 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途 |
CN111925941A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-11-13 | 北京健为医学检验实验室有限公司 | 一种病毒保存液及其应用 |
JP2022153338A (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅用組成物の保存安定性の向上方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GARRETT A PERCHETTI 等: "Multiplexing primer/probe sets for detection of SARS-CoV-2 by qRT-PCR", 《J CLIN VIROL .》, vol. 129, 8 June 2020 (2020-06-08), XP086229145, DOI: 10.1016/j.jcv.2020.104499 * |
鲍瑶菲 等: "用于新型冠状病毒核酸检测的即时检测方法研究进展", 《中国药科大学学报》, vol. 51, no. 6, 25 December 2020 (2020-12-25), pages 635 - 645 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3636769B1 (en) | Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof | |
CN108060269B (zh) | 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用 | |
CN108103240A (zh) | 对虾传染性肌肉坏死病毒(imnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN111187860A (zh) | 新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒 | |
CN112813195B (zh) | 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒 | |
CN107828915A (zh) | 虾黄头病毒(yhv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN112176105B (zh) | 病毒bvdv、brv和bcv一管多重荧光pcr检测的专用引物及其应用 | |
CN111676322A (zh) | 一种用于7种冠状病毒分型的引物组合物、试剂盒、方法和防护箱 | |
CN107828914A (zh) | 传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107988426A (zh) | 对虾桃拉病毒(tsv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107338328B (zh) | 一步法微滴数字pcr定量检测果蔬中gii型诺如病毒的方法 | |
CN111424119A (zh) | SARS-CoV-2病毒的高通量检测引物及试剂盒 | |
CN106048097A (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测番茄褪绿病毒的特异引物及方法 | |
CN113046484A (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法 | |
CN112899268A (zh) | 一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒 | |
CN117004777A (zh) | 用于检测鳜鱼弹状病毒的rpa组合物及其应用、检测方法 | |
CN109628640B (zh) | 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒 | |
CN111206122A (zh) | 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒 | |
CN111471800A (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
CN107287347B (zh) | 戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
CN113151583A (zh) | 一种可直接扩增含SARS CoV-2病毒样本的检测试剂盒及其检测方法 | |
CN108384892A (zh) | 一种检测鲤春病毒血症病毒的lamp引物组、试剂盒及方法 | |
CN113930418A (zh) | 核酸释放剂及其核酸释放方法 | |
CN111893213A (zh) | 用于新型冠状病毒快速筛查鉴定的引物及试剂盒和用途 | |
CN116515840B (zh) | 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |