CN111270014A

CN111270014A - 一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN111270014A
Application number: CN202010189110.2A
Authority: CN
Inventors: 侯铁英; 胡雪姣; 李杉; 吴际; 廖亚龙; 郑有为; 张雷
Original assignee: Guangdong General Hospital Guangdong Academy of Medical Sciences; Zhongshan Institute of Modern Industrial Technology of South China University of Technology
Current assignee: Guangdong General Hospital Guangdong Academy of Medical Sciences; Zhongshan Institute of Modern Industrial Technology of South China University of Technology
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2040-03-17
Also published as: CN111270014B

Abstract

本发明涉及病毒核酸检测方法技术领域，具体为一种SARS‑CoV‑2的RT‑LAMP核酸检测引物组，以及一种封闭式SARS‑CoV‑2等温扩增核酸检测试剂盒。本发明试剂盒，针对咽拭子样本的病毒RNA无需核酸提取，可直接对样本进行扩增，是一种对SARS‑CoV‑2一步法可视化即时筛查试剂盒，特异性好，能排除其他冠状病毒株的非特异性干扰，快速高效，能在1小时内完成检测，且无需大型昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低，整个过程不涉及有毒试剂，封闭操作，避免二次污染，保证了操作人员及环境的安全。

Description

一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测方法技术领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2 的RT-LAMP核酸检测引物组，以及一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒。

背景技术

随着《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》的发布，核酸检测作为诊断的重要标准，其重要性得到了普遍认可。然而核酸检测涉及到提取、扩增、检测等环节，对实验室环境和操作人员要求较高，一个完整的新冠病毒核酸检测程序往往需要专业测试人员连续3小时以上的双手离台操作，涉及大型的荧光定量PCR仪，因此核酸检测的普及和现场应用受到限制，进而导致了大量有临床症状的病人不能够及时得到确诊和针对性的治疗。截至2020年2月22日，国内报道研制出SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的企业超过100家，国家药监局应急批准了上海之江、圣湘生物、上海捷诺等7个核酸检测试剂盒产品上市。这些产品具有如下特点：

(1)超过90％都是核酸诊断试剂盒形式，需经过提取、扩增和检测，操作繁琐，且需要专业人员和复杂的P2实验室，难以实现新型冠状病毒肺炎 (COVID-19)的现场实时检测；

(2)多数采用qPCR方法，由于涉及到升降温循环，因此检测时间较长(4h左右)，不利于现场快速检测；

(3)2020年2月16日科技部推荐两个核酸检测产品纳入药监局应急审批通道(杭州优思达和上海仁度)，两个产品均采取等温扩增方式，说明等温扩增技术在新型冠状病毒肺炎检测中的重要作用。但以上公司研发的等温扩增试剂盒尚未实现免核酸提取的步骤。

因此，研发出免核酸提取、封闭式、可视化等温扩增快速核酸检测试剂盒，突破现有核酸检测方法对大型检测仪器和特殊场所的限制，能够有效防止二次污染，缩短检测用时，提高判读便捷性和检测灵敏度，为SARS-COV-2 诊断提供一种关键的技术解决方案，对新型冠状病毒肺炎疫情的防控具有重要意义。

发明内容

本发明针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的核酸检测技术问题，根据目前发布的新型冠状病毒的序列，(Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1,complete genome GenBank:MN908947.3)全长为29903 bp，通过对其基因序列blast之后筛选出特异性序列设计环介导等温扩增引物，应用Primer Explorer软件设计特异性引物组，利用环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术扩增靶基因的特定区域，从而提供一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，从分子水平上实现快速检测，为SARS-CoV-2检测提供了有效且快速的检测方法，具有广阔的前景和较大的社会效益。

本发明的第一目的在于提供一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，即SARS-CoV-2的等温扩增核酸检测引物组，利用SARS-CoV-2的特定区域，进行环介导等温扩增，能够快速、特异地实现SARS-CoV-2的扩增。

本发明的第二目的在于提供一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，其利用上述的RT-LAMP核酸检测引物组进行环介导等温扩增，减少核酸提取过程，利用可视化研判方式实现SARS-CoV-2的核酸快速检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，所述引物组包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、 LB-1；

所述F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

5’CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC3’；

所述B3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

5’CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT3’；

所述FIP-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

5’CACATAATAAGCTGCAGCACCA-TACATAGAAGTTATTTGACTCC TGG 3’；

所述BIP-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

5’ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCT GAG 3’；

所述LF-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

5’GCTGTCCAACCTGAAGAAGAATCA3’；

所述LB-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：

5’AGACTGTGCACTTGACCCTC 3’。

一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，包括反应预混液A、反应预混液B、显色剂、检测管、标准阳性模板、阴性对照；主要包括以下物质：1)Bst DNA大片段聚合酶；2)AMV逆转录酶；3)10X反应缓冲液；4)显色剂；5)密封液；6)标准阳性模板；7)阴性对照；8)以上所述的引物组；9)甲酰胺。

优选的，所述显色剂为HNB。

更优选的，所述显色剂为3mM的HNB溶液。

优选的，所述甲酰胺选用浓度为5-8wt％的甲酰胺溶液。

更优选的，所述甲酰胺选用浓度为6wt％的甲酰胺溶液。

优选的，所述反应预混液A包括Bst DNA大片段聚合酶、AMV逆转录酶；所述反应预混液B包括10X反应缓冲液、以上所述的引物组、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、6wt％甲酰胺和DEPC水。

优选的，反应预混液B中所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:(2-6):(1-3)。

更优选的，反应预混液B中所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。

进一步地，所述标准阳性模板为SARS-CoV-2基因组片段；所述阴性对照为灭菌超纯水。

以上所述的封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒的使用方法，包括环介导等温扩增和显色结果判定：

(1)待检样本：待检样本不需要提取RNA。可对咽拭子样本的病毒RNA 直接扩增。

(2)反应体系及条件：检测管中的反应体系含有：10X buffer反应液， Bst DNA大片段聚合酶，AMV逆转录酶，引物组，显色剂，处理好的待检样本，甲酰胺，余量为超纯水；同时设置阳性对照和阴性对照，检测管内的溶液混匀后离心，50-70℃反应30-60min，并在85℃中断反应。

进一步地，所述反应体系及条件(LAMP扩增，25μL)：引物组2.8μL (包括内引物1.6μM、外引物0.4μM、环引物0.8μM)，dNTP 1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，Bst DNA大片段聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，待检样本5μL，10X Buffer 2.5μL，HNB染料1μL，6wt％甲酰胺1.5μL，无菌双蒸水补齐至25μL，63℃反应45min，85℃中断反应。

(3)检测结果判断：

根据检测管内反应体系的颜色判断检测结果，检测结果呈蓝色则检测结果判定为阳性，即检测样本中含有SARS-CoV-2；检测结果呈紫色则检测结果判定为阴性，即检测样本中不含SARS-CoV-2。

本发明试剂盒应用检测结果的示意图如图1所示，1阳性质控为 SARS-COV-2RNA片段，2阳性样本为含有SARS-CoV-2的拭子样本(已确诊)，3阴性样本为拭子上清液，4阴性质控为DEPC水。在白纸背景下观察反应液颜色，1阳性质控和2阳性样本呈蓝色，蓝色则说明样本中含有 SARS-CoV-2，3阴性样本和4阴性质控呈紫色，紫色则说明样本中没有含 SARS-CoV-2。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)免提取，针对咽拭子样本的病毒RNA无需核酸提取，可直接对样本进行扩增，是一种对SARS-CoV-2一步法可视化即时筛查试剂盒。

2)特异性好，能有效检测样本中是否存在特定基因片段，进而确定样本中是否存在SARS-CoV-2，能排除其他冠状病毒株的非特异性干扰。

3)快速高效，能在1小时内完成检测。

4)现场检测，无需大型昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低。

5)鉴定方便简单，通过肉眼目测反应液颜色变化即可进行结果判断。

6)整个过程不涉及有毒试剂，封闭操作，避免二次污染，保证了操作人员及环境的安全。

附图说明

图1为实施例1所述试剂盒对SARS-CoV-2的检测结果。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。

实施例1

本实施例提供一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，该试剂盒包括反应预混液A、反应预混液B、HNB显色剂、检测管、标准阳性模板、阴性对照。反应预混液由反应预混液A和反应预混液B构成。其中，反应预混液A包括Bst DNA大片段聚合酶、AMV逆转录酶；反应预混液B 包括10X反应缓冲液、引物组、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、6wt％甲酰胺和 DEPC水。

所述引物组包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1。

F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1、LB-1的核苷酸序列如下：

F3-1(SEQ ID NO.1)：5’CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC3’；

B3-1(SEQ ID NO.2)：5’CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT3’；

FIP-1(SEQ ID NO.3)：

5’CACATAATAAGCTGCAGCACCA-TACATAGAAGTTATTTGACTCC TGG 3’；

BIP-1(SEQ ID NO.4)：

5’ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCT GAG 3’；

LF-1(SEQ ID NO.5)：5’GCTGTCCAACCTGAAGAAGAATCA 3’；

LB-1(SEQ ID NO.6)：5’AGACTGTGCACTTGACCCTC 3’。

具体的，应用本实施例的试剂盒，25μL反应体系含以下物质：引物组 2.8μL(包括内引物1.6μM、外引物0.4μM、环引物0.8μM)，dNTP 1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，Bst DNA大片段聚合酶8U，AMV逆转录酶 5U，待检样本5μL，10X Buffer 2.5μL，HNB染料1μL，6wt％甲酰胺1.5 μL，无菌双蒸水补齐至25μL。

结合本发明试剂盒检测的灵敏度和相关检测标准的要求，对待检拭子样本的处理进行优化。

本实施例的试剂盒的使用方法：

(2)反应体系及条件(LAMP扩增，25μL反应体系)：

引物组2.8μL(包括内引物1.6μM、外引物0.4μM、环引物0.8μM)， dNTP 1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，Bst DNA大片段聚合酶8U， AMV逆转录酶5U，待检样本5μL，10X Buffer2.5μL，HNB染料1μL， 6wt％甲酰胺1.5μL，无菌双蒸水补齐至25μL。反应体系在63℃反应45min，在85℃中断反应。

(3)检测结果判断：

具体的，完成反应后，在白纸背景下观察检测管内反应液的颜色，如图 1所示，1阳性质控为SARS-COV-2RNA片段，2阳性样本为含有SARS-CoV-2 的拭子样本(已确诊)，3阴性样本为拭子上清液，4阴性质控为DEPC水。 1阳性质控和2阳性样本呈蓝色，蓝色说明样本中含有SARS-CoV-2，3阴性样本和4阴性质控呈紫色，紫色说明样本中没有含SARS-CoV-2。

实施例2

结合本发明试剂盒检测的检测标准的要求，对待检样本进行了临床验证。

LAMP检测结果与qPCR检测比较

阳性样本的LAMP阳性检出率：100％

阴性样本的LAMP阳性检出率：100％

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110> 广东省人民医院（广东省医科学院）

中山市华南理工大学现代产业技术研究院

<120> 一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒

<141> 2020-03-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequece

<400> 1

ctaggtttca aactttactt gc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequece

<400> 2

cctttttcta cagtgaagga tt 22

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequece

<400> 3

cacataataa gctgcagcac catacataga agttatttga ctcctgg 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequece

<400> 4

atgaaaatgg aaccattaca gatgccaacg tacactttgt ttctgag 47

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequece

<400> 5

gctgtccaac ctgaagaaga atca 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequece

<400> 6

agactgtgca cttgaccctc 20

Claims

1.一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，其特征在于，包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；

所述F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FIP-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述LF-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，包括反应预混液A、反应预混液B、显色剂、检测管、标准阳性模板、阴性对照，其特征在于，主要包括以下物质：1)Bst DNA大片段聚合酶；2)AMV逆转录酶；3)10X反应缓冲液；4)显色剂；5)密封液；6)标准阳性模板；7)阴性对照；8)权利要求1所述的引物组；9)甲酰胺。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为HNB。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为3mM的HNB溶液。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述甲酰胺选用浓度为5-8wt％的甲酰胺溶液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述甲酰胺选用浓度为6wt％的甲酰胺溶液。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应预混液A包括Bst DNA大片段聚合酶、AMV逆转录酶；所述反应预混液B包括10X反应缓冲液、权利要求1所述的引物组、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、6wt％甲酰胺和DEPC水。

8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性模板为SARS-CoV-2基因组片段；所述阴性对照为灭菌超纯水。

9.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，反应预混液B中所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1∶(2-6)∶(1-3)。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，反应预混液B中所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1∶4∶2。