CN113322354A - 一种检测2019-nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测2019-nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract

本发明公开了一种检测2019‑nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对2019‑nCoV的S区片段扩增的引物组和/或N区片段扩增的引物组；其中，所述针对2019‑nCoV的S区片段扩增的引物组包括一对引物，分别为：S‑MF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，S‑MR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述针对2019‑nCoV的N区片段扩增的引物组包括一对引物，分别为：N‑MF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，N‑MR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的试剂盒包括所述CDA引物组。本发明基于CDA技术，针对2019‑nCoV的2个特异保守区域分别设计2条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的2019‑nCoV。

Description

一种检测2019-nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测2019-nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
2019年12月在武汉发现多起不明原因肺炎感染病例，经分离确认是一种新型冠状病毒(简称2019-nCoV)。2019-nCoV病原传播性强、传播迅速。在一项对41例疫情早期病例的临床研究发现，2019-nCoV患者进入ICU的重症患者占比率为31.7％，疾病总死亡率达到14.6％，对公共卫生安全造成极大的威胁。我国现已将其归为乙类法定传染病，并归为甲类传染病管理。
因目前尚无特效治疗药物，对于该疾病的防控则仍显得极为重要。而对于该病毒的快速、特异、高灵敏的诊断则为防控中的重要一环。我国卫健委发布的诊疗手册将基于RT-PCR指定为2019-nCoV病毒检测的确诊指标。但应用RT-PCR方法，需要在标准生化分析实验室中使用精密的实时荧光PCR仪，并需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区，不适合用于现场快速筛查。而免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率较高、灵敏度较低，难于检测处于潜伏期的2019-nCoV携带者，可能造成疫情的扩散。因此，面向现场的快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为2019-nCoV防控提供强有力的保障。
基于竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification of nucleic acids，CDA)是中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院研发的替代日本LAMP的核酸恒温扩增方法，具体参见申请号为202110473121.8的专利。该方法主要利用2至6种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CDA还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于2019-nCoV的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP中成环引物40bp短，这将极大节省成本。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测2019-nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种非疾病诊断目的的检测2019-nCoV的CDA引物组，所述CDA引物组为针对2019-nCoV的S区片段扩增的引物组和/或N区片段扩增的引物组；其中，所述针对2019-nCoV的S区片段扩增的引物组包括一对引物，分别为：S-MF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，S-MR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述针对2019-nCoV的N区片段扩增的引物组包括一对引物，分别为：N-MF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，N-MR：其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本发明还提供一种检测2019-nCoV的试剂盒，所述试剂盒包括上述的CDA引物组。
作为优选实施方案，所述CDA引物组中各引物S-MF、S-MR、N-MF、N-MR在反应体系中的浓度均为1～2μM。
作为优选实施方案，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、AMV反转录酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
作为优选实施方案，所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。
作为优选实施方案，所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。
作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为，
2-50mM Tris-HCl pH8.8
2-20mM KCl
2-20mM(NH4)2SO4
2～20mM MgSO4
0.1～0.5％Triton X-100
0.2～1M甜菜碱
1～1.6mM dNTP
5～10U Bst DNA聚合酶
5～10UAMV反转录酶
100～150μmol/L显色剂
2～4μM引物S-MF/S-MR或N-MF/N-MR；
反应溶剂为超纯水。
所述的试剂盒检测2019-nCoV的方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
步骤2，上述制得的扩增反应液，在35～45℃恒温反应5～10min，然后60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有2019-nCoV。
本发明还提供所述的CDA引物组在非疾病诊断目的的2019-nCoV病毒检测中的应用。
本发明还提供所述的试剂盒在非疾病诊断目的的2019-nCoV病毒检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.发明基于CDA技术，针对2019-nCoV的2个特异保守区域分别设计2条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的2019-nCoV。
2.由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，在CDA扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。
3.本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对2019-nCoV的快速准确检测，因此，适用于2019-nCoV爆发时，专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，可实现对2019-nCoV快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明实施1中S区扩增的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图2为本发明实施2中N区扩增的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图3为本发明实施3中S区扩增的阴阳性反应终点结果图。
图4为本发明实施4中N区扩增的阴阳性反应终点结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1应用Eva Green验证对2019-nCoV的S区扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(反应溶液为25μL，溶剂为超纯水)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
1600nM S-MF(SEQ ID NO.1所示)
1600nM S-MR(SEQ ID NO.2所示)
靶:2019-nCoV-S dsDNA(2019-nCoV的S区片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。
同时设置无靶的对照组。
设置罗氏LC480 real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。图1结果表明：引物组S-MF、S-MR可实现2019-nCoV的S区片段的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断扩增结果。
实施例2应用Eva Green验证对2019-nCoV的N区扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(反应溶液为25μL，溶剂为超纯水)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
1600nM N-MF(SEQ ID NO.3所示)
1600nM N-MR(SEQ ID NO.4所示)
靶:2019-nCoV-N dsDNA(2019-nCoV的N区片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6)
同时设置无靶的对照组。
设置罗氏LC480 real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。图2结果表明：引物组N-MF、N-MR可实现2019-nCoV的N区片段的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断扩增结果。
实施例3应用羟基萘酚兰(HNB)对2019-nCoV的S区扩增反应进行终点监测
羟基萘酚兰(HNB)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
反应溶液组合(反应溶液为25μL，溶剂为超纯水)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
120μM HNB
引物：
1600nM S-MF(SEQ ID NO.1所示)
1600nM S-MR(SEQ ID NO.2所示)
靶:2019-nCoV-S dsDNA
同时设置无靶的对照组。
设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图3所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。图3结果表明：将HNB应用于本发明的引物扩增反应中可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
实施例4应用羟基萘酚兰(HNB)对2019-nCoV的N区扩增反应进行终点监测
羟基萘酚兰(HNB)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
反应溶液组合(反应溶液为25μL，溶剂为超纯水)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
120μM HNB
引物：
1600nM N-MF(SEQ ID NO.3所示)
1600nM N-MR(SEQ ID NO.4所示)
靶:2019-nCoV-S dsDNA
同时设置无靶的对照组。
设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图4所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。图4结果表明：将HNB应用于本发明的引物扩增反应中可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院
中国科学院大学宁波华美医院
<120> 一种检测2019-nCoV的CDA引物组、试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
gtcacatgca agttccctca gtcagcacct 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ttatgtccct gcatggcagg agcagttgtg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
tgcctggagt tgttctcgtt cctcatcacg 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
gcagtagggg acaaagcaag agcagcatc 29
<210> 5
<211> 3822
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(2019-nCoV)
<400> 5
ttatgtgtaa tgtaatttga ctcctttgag cactggctca gagtcgtctt catcaaattt 60
gcagcaggat ccacaagaac aacagccctt gagacaacta cagcaactgg tcatacagca 120
aagcataatt gtcaccatta ctatggcaat caagccagct ataaaaccta gccaaatgta 180
ccatggccat tttatatact gctcatactt tccaagttct tggagatcga tgagagattc 240
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agcattaatg ccagagatgt cacctaaatc aacatctggt gatgtatgat tcttaaaata 360
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gacaccttca cgaggaaagt gtgcttttcc atcatgacaa atggcaggag cagttgtgaa 600
gttcttttct tgtgcaggga cataagtcac atgcaagaag actacaccat gaggtgctga 660
ctgagggaag gacataagat gatagccctt tccacaaaaa tcaactcttt ttgattgtcc 720
aagtacacac tctgacattt tagtagcagc aagattagca gaagctctga tttctgcagc 780
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gatgaagcca gcatctgcaa gtgtcacttt gttgaaaagt agatcttcaa taaatgacct 1380
cttgcttggt tttgatggat ctggtaatat ttgtgaaaaa ttaaaaccac caaaatcttt 1440
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caacaaaaga ttgctgcatt cagttgaatc accacaaatg tacattgtac aatctactga 1620
tgtcttggtc atagacactg gtagaatttc tgtggtaaca ctaatagtaa aatttgtggg 1680
tatggcaata gagttattag agtaagcaac tgaattttct gcaccaagtg acatagtgta 1740
ggcaatgatg gattgactag ctacactacg tgcccgccga ggagaattag tctgagtctg 1800
ataactagcg catatacctg caccaatggg tatgtcacac tcatatgagt tgttgacatg 1860
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agaaagtact actactctgt atggttggta accaacacca ttagtgggtt ggaaaccata 2340
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tctatacagg taattataat taccaccaac cttagaatca agattgttag aattccaagc 2520
tataacgcag cctgtaaaat catctggtaa tttataatta taatcagcaa tctttccagt 2580
ttgccctgga gcgatttgtc tgacttcatc acctctaatt acaaatgaat ctgcatagac 2640
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ggaagcaaaa taaacaccat cattaaatgg taggacaggg ttatcaaacc tcttagtacc 3600
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caagtcctga gttgaatgta aaactgagga tctgaaaact ttgtcagggt aataaacacc 3720
acgtgtgaaa gaattagtgt atgcaggggg taattgagtt ctggttgtaa gattaacaca 3780
ctgactagag actagtggca ataaaacaag aaaaacaaac at 3822
<210> 6
<211> 1260
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(2019-nCoV)
<400> 6
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims (10)

1.一种非疾病诊断目的的检测2019-nCoV的CDA引物组，其特征在于：所述CDA引物组为针对2019-nCoV的S区片段扩增的引物组和/或N区片段扩增的引物组；
其中，所述针对2019-nCoV的S区片段扩增的引物组包括一对引物，分别为：S-MF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，S-MR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
其中，所述针对2019-nCoV的N区片段扩增的引物组包括一对引物，分别为：N-MF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，N-MR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA引物组。
3.如权利要求2所述的一种检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：所述CDA引物组中各引物S-MF、S-MR、N-MF、N-MR在反应体系中的浓度均为1～2μM。
4.如权利要求2所述的一种检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst聚合酶、AMV反转录酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
5.如权利要求4所述的一种检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。
6.如权利要求4所述的一种检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。
7.如权利要求2所述的一种检测2019-nCoV的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应体系的组成为，
2-50mM Tris-HCl pH8.8
2-20mM KCl
2-20mM(NH4)2SO4
2～20mM MgSO4
0.1～0.5％TritonX-100
0.2～1M甜菜碱
1～1.6mM dNTP
5～10U Bst DNA聚合酶
5～10UAMV反转录酶
100～150μmol/L显色剂
2～4μM引物S-MF/S-MR或N-MF/N-MR；
反应溶剂为超纯水。
8.权利要求7所述的试剂盒检测2019-nCoV的方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
步骤2，上述制得的扩增反应液，在35～45℃恒温反应5～10min，然后60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有2019-nCoV。
9.权利要求1所述的CDA引物组在非疾病诊断目的的2019-nCoV病毒检测中的应用。
10.权利要求2-7任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的2019-nCoV病毒检测中的应用。
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