CN110468237B

CN110468237B - 检测中东呼吸综合征冠状病毒的引物探针混合液及试剂盒

Info

Publication number: CN110468237B
Application number: CN201910821266.5A
Authority: CN
Inventors: 李明; 何皖平; 蒋析文; 周其伟; 高秀洁; 夏乔; 尤欢; 叶爱华; 吴洁
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2016-03-10
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2036-03-10
Also published as: CN105624335A; CN110468237A; CN105624335B

Abstract

本发明涉及检测中东呼吸综合征冠状病毒的引物探针混合液及试剂盒，具体的本发明涉及利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术同时检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因的引物探针混合液及试剂盒。本试剂盒通过多种荧光通道分别检测的方式，应用多重实时荧光PCR反应模式，能准确快速检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因，可广泛应用于中东呼吸综合征临床早期诊断、疫情防控、及科学研究等多个领域。

Description

检测中东呼吸综合征冠状病毒的引物探针混合液及试剂盒

本申请是申请日为2016年03月10日，申请号为201610147784.X，发明创造名称为“一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可同时检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因试剂盒的试剂盒。

背景技术

冠状病毒为一类大型家族病毒，可引起从感冒到严重急性呼吸综合征等一系列疾病。中东呼吸综合征是一种由新型冠状病毒引起的病毒性呼吸道疾病,该病毒于2012年9月从一名60岁沙特阿拉伯男子痰液中首次分离到并首次报道。世界疫症情报网将其排在第6种新型人类冠状病毒列表中。该病毒自2012年初以来,从沙特阿拉伯开始发现感染人类，并迅速从约旦、卡塔尔、阿联酋、突尼斯等中东地区发现病人，并波及到过中东旅行的欧洲(法、英、德、意)也有确诊病人,病死率极高,已引起医学界高度重视。2013年5月28日，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布将此型病毒定名为“中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)”。中东呼吸综合征冠状病毒是一种人畜共患病毒，目前仍不十分清楚人如何染上这一病毒。据认为人们可能通过与中东受到感染的单峰骆驼直接或间接接触而染上病毒。在埃及、阿曼、卡塔尔和沙特阿拉伯等一些国家的骆驼身上发现了中东呼吸综合征冠状病毒株。病毒来源方面的整体情况尚不清楚。从埃及、阿曼、卡塔尔和沙特阿拉伯的骆驼中已经分离到与人间毒株相匹配的中东呼吸综合征冠状病毒毒株。对山羊、牛、绵羊、水牛、猪和野生鸟类等其它动物开展了中东呼吸综合征冠状病毒抗体检测，但迄今为止尚没有在这些动物中有任何发现。这些研究共同支持这样一种假设，就是单峰骆驼可能是人类的一个感染源。病人作为传染源已有数起报道，可能存在有限的人传人。

MERS-CoV的实验室检测包括病毒核酸检测、抗原和抗体检测及作为病毒感染诊断“金标准”的病毒分离鉴定。其中，反转录－聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase C-hain Reaction，RT-PCR)因检测病毒核酸具有周期短、易标准化等优势而广泛应用于MER S的病原学诊断工作。WHO于2012年12月首次推荐MERS-CoV的实验室诊断标准流程，以指导临床标本的初筛和确认实验。随着人们对该病毒的深入研究和逐步了解，WHO又分别于2013年9月和2014年9月更新了指南内容。自2012年确认首例人感染MERS-CoV病例至2015年6月，全球已有MERS病例1185例，因此，建立特异、有效的快速分子诊断方法对早期发现和防控疫情十分重要。WHO推荐将MERS-CoV包被蛋白(envelope protein，E蛋白)基因的5’′端上游序列(upstream of envelop gene，UPE)作为初筛检测靶标，OF1a/OF1b作为进一步确诊检测靶标。如果患者双靶标检测阳性，则为确诊病例；如果患者初筛靶标阳性但第二靶标检测阴性，则需检测其他基因，包括核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)、RNA依赖的RNA聚合酶(Rna Dependent Rna Polymerase，RdRp)和刺突蛋白(spikeprotein，S蛋白)基因，且通过扩增产物测序确定；如果患者临床症状和流行病学史高度符合但仅初筛阳性，缺少其他基因检测结果，则作为疑似病例。所有确诊或疑似病例均需连续采集2次以上标本检测，排除假阳性或假阴性。值得注意的是，对于上呼吸道标本检测阴性而临床及流行病学史高度符合的患者，应积极采集下呼吸道标本送检，降低假阴性。针对E蛋白基因上游的检测被认为高度敏感，并推荐用于筛查；针对开放阅读框1a的检测被认为具有同样的敏感性；针对开放阅读框1b的检测则不如诊断开放阅读框1a的检测敏感。美国疾控中心已经开发了针对中东呼吸综合征冠状病毒核壳(N)蛋白基因的实时逆转录-聚合酶链反应检测法，同UPE基因检测具有高度敏感，可以作为E蛋白基因上游检测的补充，用于筛查和确诊。迄今，这些实时逆转录-聚合酶链反应检测均未出现与其它呼吸道病毒(包括人冠状病毒)的交叉反应性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术对中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因进行检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确检测MERS-CoV。

根据GenBank中登录的MERS-CoV的UPE和N基因序列，应用DNAMAN软件进行同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用Primer Express3.0软件根据每种病毒基因的保守区基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。2条探针分别用FAM和HEX标记，以便于在检测中区分。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。

本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H₂O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由UPE和N基因特异性的正、反向引物，特异性的探针组成，其特征在于UPE基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TTTCCACTGTTTTCGTGCC-3’和5’-GACCCATAGTAGCGCAGAG-3’；UPE基因特异性的探针的序列是5’-CAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；N基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GTGCTGTTTCCTTTGCCGATA-3’和5’-GGTAAGCCCAGTGTACCAAG-3’；N基因特异性的探针的序列是5’-ACAGTGTTATTTGGTGCAGCTCGTGGTT-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；

本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度为0.2～0.5μmol/L，探针浓度为0.1～0.25μmol/L。

本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0～8.8)、MgCl₂(3～8mmol/L)、KCl(150～350mmol/L)组成。

本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成。逆转录酶可选择MMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用市售产品，如Qiagen公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5～10U，逆转录酶用量为1.5～5U，dNTPs用量为6～12mmol。

本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为：50℃15分钟，94℃2分钟；94℃15秒，58℃35秒，40个循环(退火时收集荧光信号)。

本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为人工合成的含有UPE和N基因目的基因的体外转录RNA。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM、HEX通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测2个通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。

本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。准确检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因，可广泛应用于中东呼吸综合征疾病临床早期诊断、口岸检验检疫、疫情防控及科学研究等多个领域。

本发明与现有技术相比优点为：①对中东呼吸综合征冠状病毒核酸扩增水平进行检测，可反映出样本中中东呼吸综合征冠状病毒感染的状态，可用于中东呼吸综合征的监测和防控及临床诊断，有助于中东呼吸综合征冠状病毒的早期诊断和治疗；②分别针对中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因特异性序列设计专用引物、探针，保证检测的特异性和准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点；③一份样本同时对中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因，检测过程只需1.5h，相比一个样本进行4次检测，大大减少了工作量，提高了检测效率；相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以上；④试剂采用阴阳性质控品作为质控，能够对试剂的质量进行严格的把控；⑤试剂采用RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点。

附图说明

图1显示PCR扩增的反应条件。

图2显示UPE基因标准品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒具有很好的线性相关性，且可以检出100copies/mL的浓度样本。

图3显示N基因标准品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒具有很好的线性相关性，且可以检出100copies/mL的浓度样本。

图4显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM、HEX通道荧光信号均呈阴性。

图5显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。

图6显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。

图7显示显示特异性样本的扩增曲线。图中FAM和HEX通道没有S型扩增曲线，说明均呈阴性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1中东呼吸综合征冠状病毒基因检测试剂盒的制备及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒

引物探针混合液(25μl/管)1管，RT-PCR反应液(125μl/管)，RT-PCR反应酶系(75μl/管)1管，阳性质控品(200μl/管)1管，阴性质控品(200μl/管)1管，DEPC H₂O(2000μl/管)1管。

2、目的基因重组质粒的制备

由委托公司合成并纯化中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因的体外转录RNA，通过紫外分光光度仪测得浓度，然后计算其RNA拷贝数，并将2种RNA用DEPC H₂O分别稀释至1.0×10⁵copies/mL～1.0×10²copies/mL的标准品。

3、实时荧光定量PCR扩增及检测

3.1试剂准备：

按比例取相应量的引物探针混合液1μl、RT-PCR反应液5μl、RT-PCR反应酶系3μl、DEPC H₂O 11μl，充分混匀后备用。

3.2加样：

向PCR反应管中，分别加入阴、阳性质控品、目的基因全长RNA溶液5μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。

3.3编辑(ABI Prism 7500荧光定量PCR仪)

打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择Reporter为FAM和Quencher为none，再选择Reporter为HEX和Quencher为none；再选择Reporter为Texas Red和Quencher为none；然后选择Reporter为Cy5和Quencher为none后关闭窗口。在PassiveReference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：50℃15分钟，94℃2分钟；94℃15秒，58℃35秒，40个循环(见附图1)。所有设置完成后保存文件，运行。

3.4结果分析：

反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Ampplot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：1.5±100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

4、检测结果

本试剂盒在1.0×10⁵copies/mL～1.0×10²copies/mL之间具有很好的线性关系，且灵敏度可以达到100copies/mL(见附图2、3)。

实施例2特异性样品的检测

选取HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU13、H3N2(流感病毒)、H1N1(流感病毒)、Adenovirus(腺病毒)type 5、RSV(呼吸道合胞病毒)、EV71(肠道病毒)、PIV-1(副流感病毒-1型)、PIV-2(副流感病毒-2型)、PIV-3(副流感病毒-3型)、PIV-4(副流感病毒-4型)、鼻病毒、HSV-1(单纯疱疹病毒)、EB病毒、人巨细胞病毒、麻疹病毒的阳性样本各1例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴，阳性质控品的检测。

检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见附图4)，阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线(见附图5，6)，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒对HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU13、H3N2(流感病毒)、H1N1(流感病毒)、Adenovirus(腺病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、EV71(肠道病毒)、PIV-1(副流感病毒-1型)、PIV-2(副流感病毒-2型)、PIV-3(副流感病毒-3型)、PIV-4(副流感病毒-4型)、鼻病毒、HSV-1(单纯疱疹病毒)、EB病毒、人巨细胞病毒、麻疹病毒无非特异扩增(见附图7)。

本次试验中18例标本的检测结果与病毒培养鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，加之其价格低廉，有望应用于检测中东呼吸综合征的临床检测、检验检疫以及疫情监测。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 检测中东呼吸综合征冠状病毒的引物探针混合液及试剂盒

<130> 020040

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tttccactgt tttcgtgcc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gacccatagt agcgcagag 19

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cagttcctct tcacataatc gccccgag 28

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

gtgctgtttc ctttgccgat a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ggtaagccca gtgtaccaag 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

acagtgttat ttggtgcagc tcgtggtt 28

Claims

1.一种用于中东呼吸综合征冠状病毒基因检测的引物探针混合液，其特征在于，所述引物探针混合液包括UPE和N基因特异性的正、反向引物及特异性的探针，

其中，UPE基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TTTCCACTGTTTTCGTGCC-3’,和5’-GACCCATAGTAGCGCAGAG-3’；

UPE基因特异性的探针的序列是5’-CAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAG-3’；

N基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’- GTGCTGTTTCCTTTGCCGATA-3’，和5’- GGTAAGCCCAGTGTACCAAG-3’；

N基因特异性的探针的序列是5’- ACAGTGTTATTTGGTGCAGCTCGTGGTT-3’。

2.如权利要求1所述的引物探针混合液，其特征在于，UPE基因特异性的探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。

3.如权利要求1所述的引物探针混合液，其特征在于，N基因特异性的探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。

4.如权利要求1所述的引物探针混合液，其特征在于，引物探针混合液中引物浓度均为0.2～0.5μmol/L，探针浓度均为0.1～0.25μmol/L。

5.权利要求1所述的引物探针混合液在制备检测中东呼吸综合征冠状病毒基因检测试剂盒中的应用。