CN114427005A - 一种检测白假丝酵母菌的cda引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测白假丝酵母菌的cda引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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CN114427005A CN202210120778.0A CN202210120778A CN114427005A CN 114427005 A CN114427005 A CN 114427005A CN 202210120778 A CN202210120778 A CN 202210120778A CN 114427005 A CN114427005 A CN 114427005A
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cda
seq
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蔡昊
蔡挺
桂峥
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Ningbo Huamei Hospital University of CAS
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Guoke Ningbo Life And Health Industry Research Institute
Ningbo Huamei Hospital University of CAS
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明公开了一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对白假丝酵母菌的保守区片段扩增的引物组，为引物对CA‑F2/CA‑R2、CA‑LF/CA‑LR和引物对CA‑MF/CA‑MR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对白假丝酵母菌的快速准确检测，因此，适用于专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，可实现对白假丝酵母菌快速准确的检测。

Description

一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
白假丝酵母菌(Candida albicans)是一种真菌，又称白色念珠菌，通常存在于正常人的口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。白色念珠菌在很大一部分人群中作为共生菌存在，无症状地定植于口腔、胃肠道和生殖道。然而，在屏障完整性和/或宿主免疫应答受到干扰时，真菌可通过上皮迁移，并侵入机体细胞并引起疾病。
目前白假丝酵母菌常用的检测方法主要有生化培养鉴定、血清学检测等。白假丝酵母菌的传统检测方法全过程大约需要5-10d，且检出限极低，费时费力，不能及时、灵敏地检测食品中的致病菌，无法用于处理食物突发事件。与白假丝酵母菌其他检测法相比，PCR方法具有极好的敏感性，但必需经过选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分，一个完整的以PCR为基础的白假丝酵母菌检测法需2d完成。建立一种快速、灵敏、特异的白假丝酵母菌检测方法迫在眉睫。
基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification of nucleic acids，CDA)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CDA还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于白假丝酵母菌的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP中成环引物40bp短，这将极大节省成本。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的CDA引物组，所述CDA引物组为以下三对引物，
引物对CA-F2/CA-R2，其中，CA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
引物对CA-LF/CA-LR，其中，CA-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA-LR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
引物对CA-MF/CA-MR，其中，CA-MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CA-MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的CDA引物组。
作为优选实施方案，所述CDA引物组中，引物CA-F2与CA-R2的浓度均为0.2～0.4μM，引物CA-LF与CA-LR的浓度均为0.4～1.5μM，引物CA-MF与CA-MR的浓度均为1～2μM。
作为优选实施方案，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
作为优选实施方案，所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。
作为优选实施方案，所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。
作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
2-50mM Tris-HCl pH8.8
2-20mM KCl
2-20mM(NH4)2SO4
2～20mM MgSO4
0.1～0.5％TritonX-100
0.2～1M甜菜碱
1～1.6mM dNTP
5～10U Bst DNA聚合酶
100～150μmol/L显色剂
0.2～0.4μM引物CA-F2
0.2～0.4μM引物CA-R2
0.4～1.5μM引物CA-LF
0.4～1.5μM引物CA-LR
1～2μM引物CA-MF
1～2μM引物CA-MR；
反应溶剂为超纯水。
本发明还提供所述的试剂盒非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
步骤2，上述制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有白假丝酵母菌。
本发明还提供所述的CDA引物组在非疾病诊断目的的白假丝酵母菌检测中的应用。
本发明还提供所述的试剂盒在非疾病诊断目的的白假丝酵母菌检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供的CDA引物组通过对白假丝酵母菌的特异保守区域(GenBank:MT193530.1)进行设计并筛选获得，由6条引物组成，包括序列内引物对(CA-MF/CA-MR)、外引物对(CA-F2/CA-R2)、环引物对(CA-LF/CA-LR)。CA-F2/CA-R2分别为上下游外部引物，由F2区组成，并与靶基因的F2c区域互补。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的白假丝酵母菌。具体核苷酸序列如下表1所示：
表1引物序列
序列号 引物名称 核苷酸序列
SEQ ID NO.1 CA-F2 TTATCAACTTGTCACACCAG
SEQ ID NO.2 CA-R2 TTGAAAGACGGTAGTGGTAA
SEQ ID NO.3 CA-LF GAAATGCGATACGTAATATG
SEQ ID NO.4 CA-LR CATTGCGCCCTCTGGTATTC
SEQ ID NO.5 CA-MF CGCAATGTGCGTTCTCTTGGTTCTCGCATC
SEQ ID NO.6 CA-MR CCCTCTGGTATTGAAACGACGCTCAAACAG
2.由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，CDA扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。
3.本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对白假丝酵母菌的快速准确检测，因此，适用于专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，可实现对白假丝酵母菌快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明实施1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图2为本发明实施2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图3为本发明实施3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图4为本发明实施4中应用HNB进行反应基于颜色变化的终点监测图。
图5为本发明实施5中应用HNB进行反应基于颜色变化的终点监测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1应用Eva Green验证对白假丝酵母菌基因组DNA片段的扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
200nM CA-F2(SEQ ID NO.l所示)
200nM CA-R2(SEQ ID NO.2所示)
800nM CA-LF(SEQ ID NO.3所示)
800nM CA-LR(SEQ ID NO.4所示)
1600nM CA-MF(SEQ ID NO.5所示)
1600nM CA-MR(SEQ ID NO.6所示)
靶：白假丝酵母菌基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.7所示)
同时设置无靶的对照组。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。图1结果表明：本发明提供的引物组可实现对白假丝酵母菌特异保守区域的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例2应用Eva Green验证对白假丝酵母菌提取基因组的扩增反应
方法同实施例1。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
200nM CA-F2(SEQ ID NO.l所示)
200nM CA-R2(SEQ ID NO.2所示)
800nM CA-LF(SEQ ID NO.3所示)
800nM CA-LR(SEQ ID NO.4所示)
1600nM CA-MF(SEQ ID NO.5所示)
1600nM CA-MR(SEQ ID NO.6所示)
靶：白假丝酵母菌提取基因组
同时设置无靶的对照组。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。图2结果表明：本发明提供的引物组可实现对白假丝酵母菌提取基因组的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例3应用Eva Green验证白假丝酵母菌CDA引物组对多种细菌提取基因组的扩增反应
方法同实施例1。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
200nM CA-F2(SEQ ID NO.l所示)
200nM CA-R2(SEQ ID NO.2所示)
800nM CA-LF(SEQ ID NO.3所示)
800nM CA-LR(SEQ ID NO.4所示)
1600nM CA-MF(SEQ ID NO.5所示)
1600nM CA-MR(SEQ ID NO.6所示)
靶核酸1:白假丝酵母菌DNA(序列如SEQ ID NO.7所示)
靶核酸2:白假丝酵母菌提取基因组DNA，设置为阳性对照
靶核酸3：金黄色葡萄球菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
靶核酸4：志贺氏菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
靶核酸5：沙门氏菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
靶核酸6：大肠杆菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
同时设置无靶的对照组。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图3所示。图3结果表明：本发明提供的引物组可区分白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌，进一步说明了本发明提供的CDA引物组的特异性。
实施例4应用羟基萘酚兰(HNB)进行白假丝酵母菌CDA扩增反应终点监测
羟基萘酚兰(HNB)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
应用羟基萘酚兰(HNB)进行白假丝酵母菌CDA扩增的反应溶液的组合如下面所示。
反应溶液组合如下，其余加入ddH2O至25μL
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
120μM HNB
引物：
200nM CA-F2/SEQ ID NO.l
200nM CA-R2/SEQ ID NO.2
800nM CA-LF/SEQ ID NO.3
800nM CA-LR/SEQ ID NO.4
1600nM CA-MF/SEQ ID NO.5
1600nM CA-MR/SEQ ID NO.6
靶核酸:白假丝酵母菌提取基因组DNA。扩增反应设置8个阳性对照和8个阴性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图4所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：将HNB应用于其中可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
实施例5应用羟基萘酚兰(HNB)验证白假丝酵母菌CDA对多种细菌提取基因组的扩增反应终点监测
羟基萘酚兰(HNB)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
应用羟基萘酚兰(HNB)进行白假丝酵母菌CDA扩增的反应溶液的组合如下面所示。
反应溶液组合如下，其余加入ddH2O至25μL
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
120μM HNB
引物：
200nM CA-F2/SEQ ID NO.l
200nM CA-R2/SEQ ID NO.2
800nM CA-LF/SEQ ID NO.3
800nM CA-LR/SEQ ID NO.4
1600nM CA-MF/SEQ ID NO.5
1600nM CA-MR/SEQ ID NO.6
靶核酸1:白假丝酵母菌合成DNA(序列如SEQ ID NO.7所示)
靶核酸2:白假丝酵母菌提取基因组DNA，设置为阳性对照
靶核酸3：志贺氏菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
靶核酸4：沙门氏菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
靶核酸5：大肠杆菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
靶核酸6：金黄色葡萄球菌提取基因组DNA，设置为阴性对照
扩增反应各设置8个。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图5所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：本发明提供的CDA引物组可区分白假丝酵母菌和志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，应用HNB的体系可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读，进一步说明了本发明CDA引物组的特异性。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 国科宁波生命与健康产业研究院
中国科学院大学宁波华美医院
<120> 一种检测白假丝酵母菌的CDA引物组、试剂盒及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
ttatcaactt gtcacaccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ttgaaagacg gtagtggtaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
gaaatgcgat acgtaatatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
cattgcgccc tctggtattc 20
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
cgcaatgtgc gttctcttgg ttctcgcatc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 6
ccctctggta ttgaaacgac gctcaaacag 30
<210> 7
<211> 659
<212> DNA
<213> 白色念珠菌(Candida albicans)
<400> 7
acttacaacc aattttttat caacttgtca caccagatta ttactaatag tcaaaacttt 60
caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gatacgtaat 120
atgaattgca gatattcgtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cctctggtat 180
tccggagggc atgcctgttt gagcgtcgtt tctccctcaa accgctgggt ttggtgttga 240
gcaatacgac ttgggtttgc ttgaaagacg gtagtggtaa ggcgggatcg ctttgacaat 300
ggcttaggtc taaccaaaaa cattgcttgc ggcggtaacg tccaccacgt atatcttcaa 360
actttgacct caaatcaggt aggactaccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg 420
aaaagaaacc aacagggatt gcctcagtag cggcgagtga agcggcaaaa gctcaaattt 480
gaaatctggc gtctttggcg tccgagttgt aatttgaaga aggtatcttt gggcccggct 540
cttgtctatg ttccttggaa caggacgtca cagagggtga gaatcccgtg cgatgagatg 600
acccgggtct gtgtaaagtt ccttcgacga gtcgagttgt tgggaatgca gctctaagt 659

Claims (10)

1.一种非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的CDA引物组，其特征在于：所述CDA引物组为以下三对引物，
引物对CA-F2/CA-R2，其中，CA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
引物对CA-LF/CA-LR，其中，CA-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA-LR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
引物对CA-MF/CA-MR，其中，CA-MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CA-MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA引物组。
3.如权利要求2所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述CDA引物组中，引物CA-F2与CA-R2的浓度均为0.2～0.4μM，引物CA-LF与CA-LR的浓度均为0.4～1.5μM，引物CA-MF与CA-MR的浓度均为1～2μM。
4.如权利要求2所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
5.如权利要求4所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自Sybrgreen I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。
6.如权利要求4所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和TritonX-100。
7.如权利要求2所述的一种检测白假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应体系的组成为，
2-50mM Tris-HCl pH8.8
2-20mM KCl
2-20mM(NH4)2SO4
2～20mM MgSO4
0.1～0.5％TritonX-100
0.2～1M甜菜碱
1～1.6mM dNTP
5～10U Bst DNA聚合酶
100～150μmol/L显色剂
0.2～0.4μM引物CA-F2
0.2～0.4μM引物CA-R2
0.4～1.5μM引物CA-LF
0.4～1.5μM引物CA-LR
1～2μM引物CA-MF
1～2μM引物CA-MR；
反应溶剂为超纯水。
8.权利要求7所述的试剂盒的非疾病诊断目的的检测白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
步骤2，上述制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有白假丝酵母菌。
9.权利要求1所述的CDA引物组在非疾病诊断目的的白假丝酵母菌检测中的应用。
10.权利要求2-7任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的白假丝酵母菌检测中的应用。
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