CN112941231A - 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 - Google Patents
一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112941231A CN112941231A CN202110451642.3A CN202110451642A CN112941231A CN 112941231 A CN112941231 A CN 112941231A CN 202110451642 A CN202110451642 A CN 202110451642A CN 112941231 A CN112941231 A CN 112941231A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- candida albicans
- probe
- nucleotide sequence
- sequence
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 title claims abstract description 69
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 title claims abstract description 65
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 claims description 4
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 claims description 4
- 229940055022 candida parapsilosis Drugs 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 5
- 230000007123 defense Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009329 sexual behaviour Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010004074 Balanitis candida Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010018143 Genital candidiasis Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001363490 Monilia Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 description 1
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940125698 hormone suppressant Drugs 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 208000016808 vibrio vulnificus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用，属于分子生物学检测技术领域。所述探针是根据白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列设计，所述探针源自如下任一项所示序列：1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；2)如1)所示序列的其中一段不少于15bp的寡核苷酸序列；3)由1)或2)所示序列经过缺失、取代或插入得到的具有95％以上同源性的核苷酸序列。本发明利用该探针实现了白色念珠菌菌种鉴别和临床检测；本发明不仅为白色念珠菌感染性疾病的快速检测、病原鉴定和公卫防控提供了一种方便快速、准确高效的技术策略，而且为感染性疾病的精准医学奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，涉及一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用，具体涉及一种用于沿海人群呼吸道白色念珠菌快速检测的探针、方法及应用。
背景技术
海洋环境相关疾病种类繁多，对人类健康造成严重危害，特别是南海作为我国唯一的热带海域，环境影响因素更加复杂而认识基础不足，因此建立高效的疾病防控技术和健康管理模式具有重要意义。环境病原微生物可引起多种感染性疾病，如海洋、海洋生物中常见的细菌会引发严重的呼吸、消化和皮肤系统致病损伤，海洋创伤弧菌感染导致急性败血症甚至死亡，然而由于海洋环境复杂、取样较难和流行病研究滞后，限制了其快速检测技术的应用，因此研究和开发其诊断和干预技术体系已成为海洋健康工程研究领域的热点。近年来宏基因组学、转录组学、分子生物学等新技术及分子诊断、靶向治疗等精准医疗取得重大突破，为推动海洋环境相关疾病防控和健康管理提供了技术支撑。
白色念珠菌(Monilia albican或Canidia Albicans)是一种真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不易引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则该菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。
念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病。常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。临床症状错综复杂，急缓不一。儿童多为急性继发性感染。近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，其发病率渐趋增高，并可危及生命造成严重后果。生殖器念珠菌病分为念珠菌性阴道炎和念珠菌性龟头炎。两者与性行为关系密切，可以通过性行为互相传播。
至今，未见呼吸道白色念珠菌ITS序列的克隆与特异性核酸分子探针，及其在菌种鉴别中应用的报道，至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，是白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列(ITS)序列设计探针，该探针准确可靠、操作性强、灵敏度高进行菌种鉴定、临床检测以及分子诊断，对于白色念珠菌感染性疾病以及环境中白色念珠菌的快速检测具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于白色念珠菌检测的探针，所述探针是根据白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列设计，所述探针源自如下任一项所示序列：
1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
2)如1)所示序列的其中一段不少于15bp的寡核苷酸序列；
3)由1)或2)所示序列经过缺失、取代或插入得到的具有95％以上同源性的核苷酸序列。
优选的是，所述白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列包含a)或b)：
a)所述白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列为与SEQ ID NO：1所示序列中的第7-148位核苷酸序列具有95％的同源性的序列；
b)所述白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列为可与SEQ ID NO：1所示序列中的第7-148位核苷酸序列杂交的序列。
优选的是，所述探针包括如SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列。
本发明还提供一种白色念珠菌检测方法，包括如下S1或S2所示方法：
S1：基于核酸分子杂交技术，利用所述探针检验，获取特征性图谱，以用于疑似近平滑念珠菌的检测；
S2：基于PCR扩增技术，以所述的SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列为引物，或者以所述的SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列中任一条与如SEQ ID NO：4-5所示序列配对成引物组，经扩增获取特征性条带，以用于近平滑念珠菌的鉴定。
进一步地，所述PCR扩增技术中的分子探针使用规则及判断结果如下：
以rDNA间隔区白色念珠菌异性分子探针Fca和Rca作为上下游寡核苷酸分子(SEQID NO：2-3所示的寡核苷酸序列)探针对，进行PCR反应，扩增产物约141bp。
在本发明中，术语“分离DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“白色念珠菌特征性ITS序列”是指，白色念珠菌rDNA间隔区(即白色念珠菌核糖体rRNA基因转录间隔区)的核苷酸序列，由于该区高度可变，进化速度最快，在真核生物的种间存在巨大差异(见图1)，因此常被用于真菌的系统分类与进化关系研究。由于种内ITS的可变性，所以与SEQ ID NO.1中第7－148位核苷酸序列同源性低至约95％的变异序列也被认为属于白色念珠菌。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第7-148位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第7-148位的核苷酸序列的同源性至少95％，更佳地至少99％，最佳地100％的核苷酸序列。
本发明还提供一种用于白色念珠菌检测的产品，包括所述的探针。
优选的是，所述产品包括试剂盒或检测试剂。
本发明还提供一种所述的探针的应用，用于制备筛查白色念珠菌、辅助白色念珠菌感染检测或菌种鉴定的试剂盒或检测试剂中。
本发明公开了以下技术效果：
1)本发明所涉及的白色念珠菌ITS区是一个高度可变区，其序列差异性反映白色念珠菌种间和种内甚至居群间的亲缘关系，即差异越小，亲缘越近，道地性就越强。基于本发明所提供的白色念珠菌ITS特征性核苷酸序列，依据待测样品ITS序列的同源性比对(标准差异性<5％范围内)，可以判别样品的道地性程度，这无疑将有助于建立准确高效的白色念珠菌病原菌鉴定和快速检测。
2)本发明所提供的是白色念珠菌菌种特异性核酸的特异性探针，在样品未知的前提下，可通过检测能否从样品中获得与此相同的核苷酸序列，快速方便地判断样品是否为白色念珠菌，或检测样品的真伪。
3)本发明所提供的白色念珠菌鉴别方法是一种分子生物学技术，其直接检测样品为DNA分子，即只要能提取DNA的呼吸道组织液，包括肺泡灌洗液、痰液、组织研磨液、血液等，都能采用该方法进行快速便捷、高效准确的检测和鉴别菌种，而且样品需要量极少。
4)本发明在白色念珠菌感染性疾病的病原鉴定、快速检测、公卫防控和抗生素合理用药等方面具有重要作用，也有利于推进感染性疾病的精准医疗。因此，本发明具有很大的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.为本发明白色念珠菌ITS核苷酸序列和原NCBI上白色念珠菌ITS1核苷酸序列(GenBank Accession No.JF803739)比对结果；
图2.为18S-26S rDNA的基本结构及ITS区的分布和定位；
图3.DNA质量检测；
图4.为实施例1中白色念珠菌样品阳性样本和阴性样本的溶解曲线图；
图5.实施例1中利用本发明的白色念珠菌特异性分子探针的PCR示意结果；其中M泳道为空白对照(Marker)，1泳道为阳性样本1，2泳道为阳性样本2，3泳道为阳性样本3，4泳道为阴性对照。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，例如Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1.白色念珠菌特征性ITS序列的PCR扩增
一、待测样品中DNA提取
分离DNA的样品，以疑似白色念珠菌感染性疾病样品的DNA制备为例进行说明。其中，疑似白色念珠菌感染样品采自广东医科大学附属医院沿海人群临床ICU患者痰液。利用基因组提取试剂盒提取基因组DNA，具体方法如下：
1.样本预处理
(1)液体样本中加入等体积的4％NaOH；充分震荡混匀，于37℃液化15分钟(样本较浓时可适当增加NaOH量，延长液化时间。)
(2)脓液拭子置于装有500μL 0.9％的生理盐水的1.5mL离心管中震荡涮洗30s,再加入500μL 4％NaOH，震荡混匀，于37℃液化15分钟。
(3)12000rpm离心5分钟，沉淀用1mL 1×TE(PH＝8.0)或用生理盐水清洗一次，12,000rpm离心5min，弃上清。
2.核酸提取
(1)预处理后沉淀加300μL的Lysis buffer充分悬浮，所有液体转入核酸提取管内，恒温金属浴上最大转速、95℃振荡10min，静置至室温。12000rpm离心1min，上清转至新EP管(约200～250μL上清)。
(2)加入10μL Proteinase K，充分混匀，70℃，10min。
(3)加入750μL Binding Buffer混匀，然后加入15μL磁珠(使用前充分混匀磁珠)，室温轻柔颠倒混匀10min。
(4)短暂离心，将离心管置于磁力架上1min，使磁珠吸附侧壁；避开磁珠，吸出管内液体，从磁力架上取下离心管。
(5)吸取500μL Wash Buffer I，从吸住吸附一侧管壁快速打入，轻柔颠倒混匀1min，利用磁力架吸附磁珠，避开磁珠吸走管内液体，取下离心管。
(6)吸取500μL Wash BuffeII，从磁珠吸附一侧快速打入，轻柔颠倒混匀1min，利用磁力架吸附磁珠，避开磁珠吸出管内液体。
(7)重复步骤(6)，离心管仍置于磁力架上。
(8)从离心管另一侧缓慢加入550μLWash BuffeIII，1min后用加样枪吸出管内液体，晾干。
注意：若磁珠吸附位置较高，未能被Wash Buffer III没过，则可酌情增加WashBuffeIII的用量，但注意该步骤时间不要太长，并且不能吹散磁珠。
(9)取下离心管，加入130μL Elution Buffer，使磁珠重新悬浮。恒温振荡器，300rpm，55℃，10min。将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将洗脱液转移至干净的离心管。
(10)磁珠管中再加入130μLElution Buffer，使磁珠重新悬浮，恒温振荡器，300rpm，55℃，10min。将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将洗脱液与(9)中洗脱液合并，洗脱的DNA直接用于检测或-20℃保存。
所提取的DNA，用Nanodrop进行核酸纯度和浓度检测。结果显示DNA色谱图清晰，质量较佳，可用于PCR扩增(图3)。
二、白色念珠菌特征性ITS序列的PCR扩增
基于白色念珠菌核糖体rDNA的分子结构稳定性、遗传进化保守性和序列信息同源性，扩增白色念珠菌ITS区的引物：ITS1:5′-ACCGAGAAGCTGGTCAAAC-3′和ITS2:5′-CGCCAAAGCAAGTTCGTTTC-3′。
反应体系为(20μL)：ddH2O 13.4μL，10μL qPCR mix，0.4moL/L ITS1 0.25μL，0.4moL/L ITS2 0.25μL，模板DNA 4μL。
PCR反应程序：95℃(30s)，1cycle；95℃(5s)，60℃(30s)，45cycles。融解曲线分析模式为：93℃(5s)，60℃(1min)，1cycle，溶解曲线结果显示仅有阳性样品能够显示特征峰(见图4)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测，获得141bp的特异性条带(见图5)。
回收后连接到pGEMT-Easy载体上，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列与已知白色念珠菌ITS部分序列的同源性很高，故初步认为它是一个白色念珠菌ITS序列。因此，我们认为本发明所提供的ITS序列为白色念珠菌菌种特征性核苷酸序列。
实施例2.白色念珠菌病原鉴定的特异性核酸分子探针的制备、鉴定与检测
应用Primer Premier 5软件，针对白色念珠菌ITS序列，在排除其与已知亲缘菌种的同源序列后，设计出特异性引物Fca(SEQ ID NO.2)和Rca(SEQ ID NO.3)，其核苷酸组成和排列为白色念珠菌鉴别的最佳特异性寡核酸片段。依此在DNA自动合成仪上进行化学合成，获得可长期储存和方便使用的核酸干粉制品，即为白色念珠菌物种鉴定的特异性核酸分子探针。
然后按照下述PCR反应体系及程序方案，
反应体系为(20μL)：ddH2O 13.4μL，10μL qPCR mix，0.4moL/L ITS1 0.25μL，0.4moL/L ITS2 0.25μL，模板DNA 4μL。
PCR反应程序：95℃(30s)，1cycle；95℃(5s)，60℃(30s)，45cycles。融解曲线分析模式为：93℃(5s)，60℃(1min)，1cycle。
用本发明中的该对分子探针作为寡核苷酸引物，扩增白色念珠菌感染性疾病的病原样品的DNA模板(样品包括肺泡灌洗液、痰液、组织研磨液、血液)，最终获得白色念珠菌特异性电泳条带，约为141bp。再经胶回收纯化和测序比对后，证实扩增产物的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第7-148核苷酸序列有98％同源性。证实本发明所提供的特异性核酸分子探针具有高度的物种专一性，能用于白色念珠菌的病原鉴定和快速检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江） 广东医科大学附属医院
<120> 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggaaccg agaagctggt caaacttggt catttagagg aagtaaaagt cgtaacaagg 60
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tactnatttg cttaattgca ccacatgtgt 120
ttttctttga aacgaacttg ctttggcggt gggcccagcc tgccgccaga ggtctactgt 180
aggcaccatc aatc 194
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgagaagc tggtcaaac 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgccaaagca agttcgtttc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taggtgaacc tgcggaagga tca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttccctgttc actcgccgtt act 23
Claims (7)
1.一种用于白色念珠菌检测的探针，其特征在于，所述探针是根据白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列设计，所述探针源自如下任一项所示序列：
1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
2)如1)所示序列的其中一段不少于15bp的寡核苷酸序列；
3)由1)或2)所示序列经过缺失、取代或插入得到的具有95％以上同源性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的用于白色念珠菌检测的探针，其特征在于，所述白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列包含a)或b)：
a)所述白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列为与SEQ ID NO：1所示序列中的第7-148位核苷酸序列具有95％的同源性的序列；
b)所述白色念珠菌rDNA间隔区的核苷酸序列为可与SEQ ID NO：1所示序列中的第7-148位核苷酸序列杂交的序列。
3.如权利要求1所述的用于白色念珠菌检测的探针，其特征在于，所述探针包括如SEQID NO：2-3所示的寡核苷酸序列。
4.一种白色念珠菌检测方法，其特征在于，包括如下S1或S2所示方法：
S1：基于核酸分子杂交技术，利用权利要求1-3任一项所述探针检验，获取特征性图谱，以用于疑似近平滑念珠菌的检测；
S2：基于PCR扩增技术，以权利要求3中所述的SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列为引物，或者以权利要求3中所述的SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列中任一条与如SEQ IDNO：4-5所示序列配对成引物组，经扩增获取特征性条带，以用于近平滑念珠菌的鉴定。
5.一种用于白色念珠菌检测的产品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的探针。
6.如权利要求5所述的用于白色念珠菌检测的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒或检测试剂。
7.一种如权利要求1-3任一项所述的探针的应用，其特征在于，用于制备筛查白色念珠菌、辅助白色念珠菌感染检测或菌种鉴定的试剂盒或检测试剂中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110451642.3A CN112941231A (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110451642.3A CN112941231A (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112941231A true CN112941231A (zh) | 2021-06-11 |
Family
ID=76233460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110451642.3A Pending CN112941231A (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112941231A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114427005A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-05-03 | 国科宁波生命与健康产业研究院 | 一种检测白假丝酵母菌的cda引物组、试剂盒及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6747137B1 (en) * | 1998-02-13 | 2004-06-08 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid sequences relating to Candida albicans for diagnostics and therapeutics |
| US6858387B1 (en) * | 1999-05-28 | 2005-02-22 | Innogenetics, N.V. | Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens |
| CN102229929A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-11-02 | 浙江大学 | 口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的its引物及其应用 |
| US20120130099A1 (en) * | 2008-10-14 | 2012-05-24 | Solazyme, Inc. | Methods of microbial oil extraction and separation |
| US20130034856A1 (en) * | 2008-08-18 | 2013-02-07 | Universiti Putra Malaysia | Method for detecting and identifying candida species |
| CN111471785A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-07-31 | 成都海之元生物科技有限公司 | 基于rpa快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒 |
| CN112143821A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-29 | 北京师范大学 | Fret检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用 |
-
2021
- 2021-04-26 CN CN202110451642.3A patent/CN112941231A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6747137B1 (en) * | 1998-02-13 | 2004-06-08 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid sequences relating to Candida albicans for diagnostics and therapeutics |
| US6858387B1 (en) * | 1999-05-28 | 2005-02-22 | Innogenetics, N.V. | Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens |
| US20130034856A1 (en) * | 2008-08-18 | 2013-02-07 | Universiti Putra Malaysia | Method for detecting and identifying candida species |
| US20120130099A1 (en) * | 2008-10-14 | 2012-05-24 | Solazyme, Inc. | Methods of microbial oil extraction and separation |
| CN102229929A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-11-02 | 浙江大学 | 口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的its引物及其应用 |
| CN111471785A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-07-31 | 成都海之元生物科技有限公司 | 基于rpa快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒 |
| CN112143821A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-29 | 北京师范大学 | Fret检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GENBANK: "Candida albicans ITS1 processing site A3, complete sequence", 《NCBI》 * |
| JING ZHANG 等: "Development of Candida-Specifc Real-Time PCR Assays for the Detection and Identifcation of Eight Medically Important Candida Species", 《MICROBIOLOGY INSIGHTS》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114427005A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-05-03 | 国科宁波生命与健康产业研究院 | 一种检测白假丝酵母菌的cda引物组、试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Roberts et al. | Comparison of microscopy, culture, and conventional polymerase chain reaction for detection of Blastocystis sp. in clinical stool samples | |
| CN111235314A (zh) | 一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用 | |
| CN108060269B (zh) | 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用 | |
| CN106987626B (zh) | 用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用 | |
| CN113462763A (zh) | 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒 | |
| CN104946758A (zh) | 白假丝酵母菌的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN112941231A (zh) | 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 | |
| CN109913482B (zh) | Pik3ca-i874r突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| CN110093432B (zh) | 一种用于区分结核杆菌和BCG疫苗的sRNA标志物及其用途 | |
| CN111471776A (zh) | 虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103882140A (zh) | 结核分枝杆菌快速诊断试剂盒 | |
| CN111057791A (zh) | 一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒 | |
| CN116287391A (zh) | 用于检测烟草靶斑病的rpa引物、引物/探针组合及其应用 | |
| CN113151555A (zh) | 一种用于近平滑念珠菌检测的探针、方法及应用 | |
| AU2020102421A4 (en) | A primer combination for detecting 2019ncov by loop-mediated isothermal amplification | |
| CN111926094B (zh) | 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 | |
| CN114807416A (zh) | 热带念珠菌的rpa-lfs检测引物探针组合及其应用 | |
| CN108676900B (zh) | 一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合pcr分型试剂盒及其应用 | |
| CN116103437A (zh) | Lamp检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合、方法 | |
| CN113186304A (zh) | 一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物、探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN111394504A (zh) | 一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法 | |
| CN1534097A (zh) | 中国对虾热休克蛋白70基因及其克隆方法 | |
| CN112359133A (zh) | 用于检测耳念珠菌的rpa引物组、试剂盒及快速检测方法 | |
| WO2009155772A1 (zh) | 一种核酸富集器及其应用 | |
| CN111850145A (zh) | 一种对亲水气单胞菌o7、o16、o19、o24等血清型o抗原分子分型的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210611 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |