CN102229929A - 口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的its引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，其特征在于所述引物为：IT S-1：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ITS-2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，为口腔扁平苔藓白色念珠菌基因分型提供了基础，可真正从基因水平来为临床上制定及时有效的防治措施提供可靠依据，以及为念珠菌分子流行病学的深入研究奠定基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的特异性引物及其应用。
(二)背景技术
扁平苔藓(lichen planus，LP)是一种伴有慢性浅表性炎症的皮肤黏膜角化异常性疾病，其病因复杂，至今尚不明确，并且病程长，有一定的癌变率(0.4～5％)，对患者造成很大的困扰。口腔扁平苔藓(OLP)的典型病理表现为上皮过度不全角化、基底层液化变性以及固有层有密集的淋巴细胞呈带状浸润。在口腔扁平苔藓的病因学的研究中，念珠菌与扁平苔藓的关系很早就得到国内外学者的关注，但至今尚不能给念珠菌是共生菌还是始动致病菌下结论。对口腔扁平苔藓的念珠菌进行明确的研究，从而有效地预防和治疗口腔粘膜病，首先需要准确的菌种鉴定分类的方法，特别是菌株间关系的分析判断。传统的表型分型虽具有一定的研究价值，但存在鉴别能力弱、重复性差、不稳定等局限性。随着现代生物分子技术的快速发展，从基因水平对念珠菌进行分型已成为可能和必然。基因分型的目的在于追踪口腔扁平苔藓中念珠菌的感染是来自患者自身、还是外源性的感染；明确是否存在特定菌株与扁平苔藓之间的相关性；了解念珠菌的感染除了与宿主全身及局部易感因素有关外，其本身的遗传型是否与感染有关，是否存在易感菌株或易感基因，从而探求口腔扁平苔藓的发病和进展机理。
ITS指核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(internal transcribedspacer region，ITS)。念珠菌的rDNA是一个串联排列的重复序列，包括18S、5.8S和26S。而分隔这些基因亚单位的是ITS，称为非编码区。ITS1-ITS2部分进化较快，具有种间特异性和种内保守性，可以将菌株鉴定到种或亚种。
(三)发明内容
本发明目的是基于PCR ITS1-ITS2基因分型方法，提供一种用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物及其应用。
本发明采用的技术方案是：
用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，其特征在于所述引物为：
IT S-1：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
ITS-2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。
本发明还涉及所述的引物在扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列中的应用，使用本发明引物扩增出来的特征序列，可进一步作为基因分型的研究对象。
具体的，所述应用为：以口腔扁平苔藓病人含漱液DNA为模板，以ITS-1、ITS-2为引物进行PCR扩增，得到口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列，可根据所得到的特征序列，进一步对待测样品进行基因分型。
根据扩增出的特征序列，可判断其是否属于II型、IIIa型或IIIb型中的一种。各基因型特征序列如下：
II型：5′-TGGAAGTAAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAA-3′；
IIIa型：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCCA-3′；
IIIb 型：5′-TGGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAGTAATAATCTGGTGTGACAAGTTGATAAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGCCCACCGCCAAAGCAAGTTTGTTTCAAAGAAAAACACATGTGGTGCAATTAAGCAAATCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCCA-3′。
若通过基因诊断确定基因型为上述之一，采用特定药物针对性干预白念的局部治疗，可缩短疗程至1周左右(通常一般疗程为2～3周)，为临床诊断提供了基础。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，为口腔扁平苔藓白色念珠菌基因分型提供了基础，可真正从基因水平来为临床上制定及时有效的防治措施提供可靠依据，以及为念珠菌分子流行病学的深入研究奠定基础。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1材料与方法
1.1研究对象
病例组白色念珠菌分离株来源于2010.2.16～2010.6.1就诊于浙江大学第二附属医院口腔科及黏膜病专科并确诊为OLP的患者。OLP患者的诊断依据其典型的临床表现以及实验室检查确诊，主要的病损表现为：大多左右对称，由粟粒大小的白色或灰白色丘疹组成的线条构成网状、环状、树枝状、斑块状病损，病变区域与正常粘膜之间无清晰的界限，白色线条间及四周可为正常粘膜或有充血、糜烂，甚或溃疡。健康对照组均无口腔粘膜疾病，无任何口腔粘膜病的临床症状、体征及病史。
研究对象的排除条件为：①全口义齿配戴者；②长期或近期(3月内)使用广谱抗菌药物者；③近期(3月内)使用抗真菌药物者；④长期使用肾上腺皮质激素或其他免疫抑制剂者；⑤患有糖尿病、甲状腺功能低下、免疫缺陷等系统性疾病者。
本实验所有参加对象均签署知情同意书。
1.2实验设备
1.2.1隔水式恒温培养箱(GNP-9050型，上海，中国)
1.2.2API 20C AUX念珠菌鉴定系统(Biomerieux，France)
1.2.3冰箱(-4℃，-20℃)(SIEMENS，中国)
1.2.4移液枪(Gilson，France)
1.2.5紫外分光光度计(Parmacia biotech，USA)
1.2.6PCR仪(BIOMETRA，GERMANY)
1.2.7紫外成像仪(KAISER，GERMANY)
1.3实验试剂
1.3.1真菌基因组DNA提取试剂盒(bioflux，China)
1.3.2Primer ITS-1：(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)
Primer ITS-2：(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)
(Invitrogen，China)
1.3.3Primer STARTM HS DNA Polymerase (TaKaRa，China)
1.3.4100bp DNA ladder Marker(TaKaRa，China)
1.3.5Taq酶、dNTP Mixture、10*PCR Buffer、MgCl2(TaKaRa，China)
1.3.6PBS液(吉诺生物医药技术有限公司，中国)
1.3.7沙保劳氏琼脂(杭州天和，中国)
1.3.8Agrarose B，Low EEO琼脂糖(BBI，生工生物工程(上海)有限公司供应)
1.3.9Red-gel(BIOTIUM，USA)
1.3.10无菌棉签(3M，USA)
2实验步骤
2.1标本采集
2.1.1健康对照组采用含漱浓缩法采集菌株，即嘱健康志愿者用PBS液含漱口腔1min，收集含漱液。
2.1.2非糜烂组和糜烂组采用无菌棉捻拭子法，即用生理盐水湿润的无菌棉捻反复涂擦口腔粘膜扁平苔藓病变处。
2.2白色念珠菌菌株分离及纯化
3.2.1健康对照组收集的含漱液立即送于实验室，用4000r/min离心5min，取沉淀1ml均匀涂布于沙保劳氏琼脂平板上，37℃培养24～48h，待菌落出现后.挑取典型菌落形接种于沙保劳氏琼脂平板。反复3次，以达到分离纯化的目的。
3.2.2从非糜烂组和糜烂组将收集的棉捻涂布于沙保劳氏琼脂平板上，37℃培养24～48h，待菌落出现后.挑取典型菌落形接种于沙保劳氏琼脂平板，反复3次，以达到分离纯化的目的。
2.3白色念珠菌的鉴定及保存
分离株在沙堡葡萄糖琼脂(SDA)上生长48h后，菌落形态呈乳白色奶酪状圆形；用改良革兰染色法染色后，光镜下呈革兰阳性、细胞体积较大、菌体为圆形或卵圆形职层环状结构；在米粉吐温琼脂培养基上37℃孵育4～6h后可形成芽管；在SDA上45℃孵育48h，仍然生长良好；应用API 20C AUX念珠菌鉴定系统(购自法国BioMerieUX S.A.公司)进行鉴定的读数均符合BioM6rieux提供的数据库中的白色念珠菌读数。最后菌株保存于-20℃冰箱中。
2.4白色念珠菌DNA的提取(根据Biospin Fungus Genomic DNAExtraction Kit说明)
2.4.1Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit使用前准备向Wash Buffer中加入37.8ml乙醇(无水)并混合均匀；向E BindingBuffer中加入28ml乙醇(无水)并混合均匀。
2.4.2DNA提取操作步骤
2.4.2.1保存菌种接种于沙保罗固体培养基中，在37℃条件下培养48h活化；
2.4.2.2取活化的真菌组织，在冰浴中将真菌组织研磨粉碎；
2.4.2.3取不多于50mg磨碎的真菌组织，放入1.5ml微量离心管中；
2.4.2.4加400ul LE Buffer，并混合均匀；
2.4.2.5于65℃环境中温浴15～30mins(温浴过程中可间或振荡离心管2-3次)，然后移出；
2.4.2.6加入130ul DABuffer，混合均匀后于冰浴中放置5mins；
2.4.2.714,000*g离心3mins；
2.4.2.8上清液转移到一个新的1.5ml的离心管；
2.4.2.9加750ul的E Binding Buffer，并混合均匀；
2.4.2.10将混合液转移至spin column。6,000*g离心1min，并弃去接液管中液体。由于混合液体积大于750ul，分2次离心过柱；
2.4.2.11向spin column中加入500ul的G Binding Buffer。10,000*g离心30s，并弃去接液管中液体；
2.4.2.12向spin column中加入600ul的Wash Buffer。10,000*g离心30s，并弃去接液管中液体；
2.4.2.13重复步骤12一次；
2.4.2.14再次将Spin column 10,000*g离心1min，并将Spin column转移至一个新的1.5ml离心管；
2.4.2.15向Spin column中加入100ul至200ul Elution Buffer，并于室温温育1min；
2.4.2.16于12,000*g离心1min，并弃去Spin column。1.5ml离心管中液体含有DNA，于-20℃冰箱保存。
2.5紫外线分光光度计DNA吸光度测定
2.5.1用双蒸水稀释待测DNA50倍；
2.5.2以双蒸水作对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计读数调到零；
2.5.3将稀释DNA加入到厚度为1cm的比色杯中，测定DNA在260nm处的光吸收值；
2.5.4DNA浓度(μg/mL)＝(A260nm/0.02)×稀释倍数。
2.6PCR ITS1-ITS2区域DNA碱基序列测定
2.6.1PCR扩增ITS1-ITS2区域
PCR反应体系总体积为50ul，包括10*PCR Buffer 5ul，200um dNTP，25mM MgCl2，高保真Taq酶2U，100ng DNA模板，引物ITS1和ITS2各2ul，ITS1：(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)，ITS2：(5’-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3’)。在PCR扩增仪中，按一下步骤进行反应：95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s，40个循环，而后72℃延伸10min。PCR产物在2％(w/v)琼脂糖TAE凝胶中电泳，以100bp梯度的Marker为DNA分子量标记电泳结果在紫外灯下观察并照相记录。
2.6.2DNA碱基序列测定
ITS1-ITS2区域PCR扩增产物进行纯化及DNA碱基序列测定(TaKaRa宝生物工程有限公司，大连)。
3测定结果及处理方法
经鉴定确认有148例患者口腔扁平苔藓白色念珠菌基因型为II型、IIIa型或IIIb型之一，均按照下述方式进行治疗：
用药：维生素A油丸的油剂25000单位/粒，氟康唑胶囊的粉剂50mg/粒，各取1粒混合，局部涂布于每2cm2的口内扁平苔藓病变处；
用药方式：qn(每晚一次)用药一周；
临床治疗结果：总病例数为148例，治愈117例，显效134例，治愈率为79.05％，显效率为90.54％。
传统药物治疗的显效时间为2～3周，而经本发明确认基因型后采取针对性治疗方法，显效时间缩短为1周，能使疗程明显缩短，治疗速度提高。说明本发明可真正从基因水平来为临床上制定及时有效的防治措施提供可靠依据。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 277
<212> DNA
<213> Candida albicans
<400> 1
tggaagtaaa aaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac ctgcggaagg atcattacag 60
tattcttttg ccagcgctta actgcgcggc gaaaaacctt acacacagtg tctttttgat 120
acagaactct tgctttggtt tggcctagag ataggttggg ccagaggttt aacaaaacac 180
aatttaatta tttttacagt tagtcaaatt ttgaattaat cttcaaaact ttcaacaacg 240
gatctcttgg ttctcgcatc gatgaagaac gcagcaa 277
<210> 2
<211> 245
<212> DNA
<213> Candida albicans
<400> 2
ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attactgatt 60
tgcttaattg caccacatgt gtttttcttt gaaacaaact tgctttggcg gtgggcccag 120
cctgccgcca gaggtctaaa cttacaacca attttttatc aacttgtcac accagattat 180
tacttaatag tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc 240
agcca 245
<210> 3
<211> 246
<212> DNA
<213> Candida albicans
<400> 3
tggctgcgtt cttcatcgat gcgagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgactatt 60
agtaataatc tggtgtgaca agttgataaa aaattggttg taagtttaga cctctggcgg 120
caggctgggc ccaccgccaa agcaagtttg tttcaaagaa aaacacatgt ggtgcaatta 180
agcaaatcag taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttttac 240
ttccca 246
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
gctgcgttct tcatcgatgc 20
Claims (3)
1.用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，其特征在于所述引物为：
IT S-1：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
ITS-2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。
2.如权利要求1所述的引物在扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述引用为：以口腔扁平苔藓病人含漱液DNA为模板，以ITS-1、ITS-2为引物进行PCR扩增，得到口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列。
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| CN 201110133296 CN102229929A (zh) | 2011-05-23 | 2011-05-23 | 口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的its引物及其应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112941231A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-06-11 | 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) | 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 |
-
2011
- 2011-05-23 CN CN 201110133296 patent/CN102229929A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《临床口腔医学杂志》 20041231 赵民等 应用ITS1-ITS2 区域鉴定口腔念珠菌 710－711 1－3 , * |
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| 《江苏中医》 20001231 黄志强等 辨证分型治疗口腔扁平苔藓75例 26－27 1－3 , * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112941231A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-06-11 | 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) | 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用 |
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111102 |