CN107586845A - 胶质瘤诊断标志物Circ19:5604583|5604936及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了胶质瘤诊断标志物Circ19:5604583|5604936及应用。在本发明中，首次发现：正常人体细胞所分泌的外泌体对Circ19:5604583|5604936具有明显的富集作用；同时发现胶质瘤患者血清外泌体中Circ19:5604583|5604936的表达水平相比于对照组明显降低(p＝0.0134)，ROC分析则显示其对胶质瘤具有较高诊断价值(AUC＝0.928，p<0.0001，灵敏度和特异性分别为100％和86.2％)。因此通过检测可能患有胶质瘤人群的血清外泌体中Circ19:5604583|5604936的表达水平，可对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性筛查并辅助诊断。

Description

胶质瘤诊断标志物Circ19:5604583|5604936及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及涉及一种用于胶质瘤诊断的血清circRNA标志物Circ19:5604583|5604936、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤诊断制剂的应用、还有试剂盒。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40％--50％。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清，即使是最现代的神经外科技术也难以做到病理学上的全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，且随着手术和复发次数的增加，其恶性程度有增加的趋势。运用现代显微外科技术、放疗和化疗等综合治疗措施后，胶质瘤患者预后仍不理想，高度恶性的多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者，1年和2年生存率仅为58％和31％。由于颅内病变的位置特殊性，加上手术治疗时不可避免的医源性损伤，生存者多并发神经功能障碍以及生活质量低下。近30年中恶性胶质瘤患者的临床预后没有明显改善。这充分反映了我们对脑胶质瘤发生、发展的生物学机制缺乏认识，因此不能在早期进行有效干预。因此，阐述胶质瘤发生、发展的分子机制，寻找和发现治疗神经胶质瘤生成的关键信号通路及调控因子，仍是神经胶质瘤临床和基础研究领域最重要的课题之一。

环状RNA是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中、具有调控基因表达作用的内源性非编码RNA分子，具有共价闭合的环形结构，广泛存在于各种细胞中，也是继microRNA(miRNA)后RNA家族的最新研究热点。近年来，随着深度测序技术的广泛应用和生物物理和信息学技术的快速发展，人们发现人类许多外显子的转录本可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成环状RNA，且它们在所有剪接转录本中占了相当大的比例。近年来也逐渐发现外泌体中也含有大量的环状RNA，可能发挥重要作用。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。近年研究显示，外泌体是细胞与细胞间通讯的重要的分子，参与诸多生理与病理过程。外泌体中不仅包含蛋白质成分，还包括一些RNA成分，如微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA和mRNA、环状RNA(circular RNA，circRNA)。外泌体所携带的这些RNA统称为外泌体来源RNA，具有完整的序列结构和生物活性，有望作为液体活检分子标志物，在精准医学发展上有着光明的前景。

发明内容

本发明的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物。

主要内容包括：一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物Circ19:5604583|5604936，其序列如SEQ NO:1所示。

本发明的第二个目的是，提供检测所述的CircRNA标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种胶质瘤诊断试剂盒，其能够测定血清外泌体中的Circ19:5604583|5604936的含量。

所述的胶质瘤诊断试剂盒，含有检测Circ19:5604583|5604936含量的PCR引物。优选引物的序列如SEQ NO:2和3所示。

所述的胶质瘤诊断试剂盒，除Circ19:5604583|5604936的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。

包括：

(1)提取血清外泌体所需试剂：Total Exosome Isolation Reagent(fromserum)，可由Invitrogen公司购得，货号4478360；

(2)提取外泌体RNA所需试剂：Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；

(3)逆转录所需试剂：随机引物(Random Primer)、无酶水、5×逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶；

(4)荧光定量PCR所需试剂：Circ19:5604583|5604936上下游引物、GAPDH内参上下游引物、SYBR染料、无酶水。

本发明的有益效果在于：首次发现胶质瘤细胞所分泌的外泌体对Circ19:5604583|5604936具有明显的富集作用，同时发现胶质瘤患者血清外泌体中Circ19:5604583|5604936的表达水平相比于对照组明显降低(p＝0.0134)，ROC分析则显示其对胶质瘤具有较高诊断价值(AUC＝0.928，p<0.0001，灵敏度和特异性分别为100％和86.2％)。因此通过检测可能患有胶质瘤人群的血清外泌体中Circ19:5604583|5604936的表达水平，可对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性筛查并辅助诊断。本发明可以使得胶质瘤的诊断更加方便准确，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析Circ19:5604583|5604936在胶质瘤细胞与细胞所分泌的外泌体中的表达差异；

图2为实时荧光定量PCR分析Circ19:5604583|5604936在胶质瘤血清与正常血清外泌体中的表达差异；

图3为Roc分析血清外泌体来源的Circ19:5604583|5604936对胶质瘤早期诊断的特异性，灵敏性。

具体实施方式

以下结合实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

一、研究对象

1.两株胶质瘤细胞系为U251和U87细胞系，五株胶质瘤原代细胞分别为1216、1125、1124B、1124C、0128C，均由中南大学基础医学院肿瘤研究所提供。

2. 40例胶质瘤患者的血清样本由湘雅医院提供，15例正常血清样本为同期进行社区疾病筛查的健康个体。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一致。

二、研究方法

1.细胞、细胞所分泌的外泌体、胶质瘤/正常血清外泌体中RNA的抽提

A.细胞RNA的抽提

待上述七种细胞长至适当密度，倒掉培基，于培养皿中加入1ml Trizol试剂，冰上裂解15分钟。裂解结束后移至1.5ml无酶Tube管，4℃,12000rpm离心10min，上清液移至新的tube管。加氯仿200μl于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置15min，4℃，12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube管中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，冰上静置20min，4℃,12000rpm离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃，7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无酶水10μl溶解RNA。-80℃保存，由实验员每天记录冰箱温度。

B.细胞所分泌的外泌体中RNA的抽提

待上述七种细胞于培养皿养至适当密度(培养基内所用血清必须提前去除外泌体)，收集上清培养基约15ml于超滤管(millipore公司)，4500g于4℃离心1h。离心之后的超滤液收集于1.5ml无酶Tube管，加入ExoQuick-TC试剂(SBI公司)后上下颠倒摇匀，4℃静止过夜沉淀。过夜后于常温1500g离心30min，弃掉上清，再次1500g离心5min，吸干上清液。沉淀即为细胞于培养基上清中所分泌的外泌体。将沉淀用1ml Trizol试剂重悬，冰上裂解15分钟，裂解结束之后提取步骤同A。

C.胶质瘤/正常血清外泌体中RNA的抽提

使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，4℃静置24小时后3000g常温离心5分钟。用微量移液器抽取200μl上层血清分装至新的600μl离心管中，-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。

取上述血清200μl于2000g常温离心30分钟，用微量移液器抽取上层清液至新的600μl离心管，加入40μl外泌体提取试剂(Total Exosome Isolation Reagent(fromserum)，货号：4478360，Invitrogen公司)轻轻上下颠倒摇匀，4℃孵育45分钟。孵育结束后10000g常温离心10分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体。于沉淀中加入200μlTrizol(MRC公司)使沉淀重悬，将悬液移至新的1.5ml tube管，补Trizol至1ml。冰上裂解15min，裂解结束之后提取步骤同A。

2.cDNA制备

按照逆转录试剂盒(Thermo公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为20μl(总RNA 10μl，Random primer 1μl,无酶水1μl，5×Reaction Buffer 4μl，RI 1μl，RT 1μl和10mM dNTP 2μl)。

成分	剂量/管
		随机逆转录引物(1μM)	1μl
RNA样本	10μl
		无酶水	To 12μl

逆转录第一步条件：65℃5分钟

成分	剂量/管
		5×逆转录缓冲液	4μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)	2μl
		RNA酶抑制剂(40U/μl)	1μl
MMLV逆转录酶(200U/μl)	1μl
		第一步PCR的产物	12μl
总体积	20μl

逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。

3.实时荧光定量PCR

采用汉恒生物科技(上海)有限公司合成的特异性引物(引物序列见SEQ NO：2和3)进行实时定量PCR：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μL反应体系如下：

实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。

(6)数据分析：采用2^-ΔCT表示Circ19:5604583|5604936相对于内参的表达倍数，其中△CT＝CT_样本–CT_内参。本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因(引物序列见SEQ NO：4和5)，数据利用软件GraphPad Prism及SPSS17.0进行分析。

三、研究结果

1.胶质瘤细胞所产生的外泌体中Circ19:5604583|5604936相比于细胞内浓度明显升高，细胞外泌体对该环状RNA具有良好的富集效果。具体结果如图1所示。

2.胶质瘤患者的血清外泌体中Circ19:5604583|5604936相比正常血清外泌体对照组显著下调(p＝0.0134)。具体数据如图2所示。ROC曲线分析显示Circ19:5604583|5604936作为生物标记物对胶质瘤具有较高诊断价值(AUC＝0.928，p<0.0001，灵敏性和特异性分别为100％和86.2％)，详细结果见图3。

序列表

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 胶质瘤诊断标志物Circ19:5604583|5604936及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

guugucgggg ccaaaguggu aacgaacgcc cgcagcccgg gggcucgaug cuauggauuc 60

gucaccaugu cgacaucuga cgaggcgacc aagugcauca gccaucucca cagaacugag 120

cugcauggac gaaugaucuc cguagagaag gccaaaaaug agccugcugg gaaaaagcuu 180

uccgacagaa aagagugcga agugaagaag gaaaaauuau cgagugucga cagacaucau 240

ucuguggaga ucaaaauuga aaa 263

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gtgcgaagtg aagaaggaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

tctgtggaga tggctgatg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atcatcagca atgcctcct 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

catcacgcca cagtttcc 18

Claims (6)

1.一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物Circ19:5604583|5604936，其序列如SEQ NO:1所示。

2.检测权利要求1所述的CircRNA标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。

3.一种胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，能够测定血清外泌体中的Circ19:5604583|5604936的含量。

4.根据权利要求3所述的胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，含有检测Circ19:5604583|5604936含量的PCR引物。

5.根据权利要求4所述的胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，引物的序列如SEQ NO:2和3所示。

6.根据权利要求3或4或5所述的胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，除Circ19:5604583|5604936的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。