CN107557474A - 胶质瘤诊断标志物circ15:98707562|98708107及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种胶质瘤诊断标志物circ15:98707562|98708107及应用。该circRNA此前并未报道研究过，通过荧光定量PCR技术对胶质瘤患者血清外泌体中circ15:98707562|98708107的含量进行分析，发现胶质瘤患者血清外泌体中circ15:98707562|98708107表达水平相比于正常对照组明显降低(P＝0.0013)，ROC分析则显示其对胶质瘤具有较高诊断价值(AUC＝0.924，P＜0.001，敏感度和特异度分别为87.5％和85.6％)。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于胶质瘤诊断的血清CircRNA标志物、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤诊断制剂的应用、还有试剂盒。
背景技术
脑胶质瘤是成年人最为频发的脑肿瘤疾病，占颅内肿瘤的40.49％。从确诊开始，脑胶质瘤患者平均生存寿命不超过五年。为了诊治胶质瘤这种与遗传物质相关性极高的恶性疾病，必须在分子生物学水平，从遗传信息表达的方面来探索其发病机理。目前而言胶质瘤的诊断和治疗方法虽处于不断改进阶段，但是胶质瘤患者生存率并没有明显提高。胶质瘤诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为中晚期，手术后的生存率不容乐观。因此，寻找胶质瘤诊断标志物对患者进行诊断分析，尽早确诊病情，并相应地选择合理的后续治疗方案，提高生存率，是神经科学领域亟待解决的研究任务。
circRNA是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中、具有调控基因表达作用的内源性非编码RNA分子，具有共价闭合的环形结构，广泛存在于各种细胞中，也是继microRNA(miRNA)后RNA家族的最新研究热点。近年来，随着深度测序技术的广泛应用和生物物理和信息学技术的快速发展，人们发现人类许多外显子的转录本可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成circRNA，且它们在所有剪接转录本中占了相当大的比例。近年来逐渐发现外泌体中也含有大量的CircRNA，可能发挥重要作用。目前，由于CircRNA丰富性、稳定性、高保守性和时空特异性等特点，在肿瘤诊断标志物方面正发挥越来越大的作用。
发明内容
本发明的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物。
主要内容包括：一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物circ15:98707562|98708107，其序列如SEQ NO.1所示。
本发明的第二个目的是，提供检测所述的CircRNA标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。
本发明的第三个目的是，提供一种胶质瘤诊断试剂盒，其能够测定血清外泌体中的circ15:98707562|98708107的含量。
所述的胶质瘤诊断试剂盒含有检测circ15:98707562|98708107含量的PCR引物。优选引物的序列如SEQ NO:2和3所示。
所述的胶质瘤诊断试剂盒，除circ15:98707562|98708107的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。包括：
(1)提取血清外泌体所需试剂：Total Exosome Isolation Reagent(fromserum)，可由Invitrogen公司购得，货号4478360；
(2)提取外泌体RNA所需试剂：Trizol试剂(Molecular Research Center,Inc购得)、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；
(3)逆转录所需试剂：随机引物(Random Primer)、无酶水、5×逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶(逆转录试剂盒从Thermo购得)；
(4)荧光定量PCR所需试剂：circ15:98707562|98708107上下游引物、GAPDH内参上下游引物、SYBR染料、无酶水。
本发明的有益效果在于：首次发现circ15:98707562|98708107这种血清外泌体中的环状RNA，并发现其对胶质瘤具有较高的诊断价值；通过血清CircRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可以使得胶质瘤的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析circ15:98707562|98708107在正常人血清外泌体与胶质瘤患者血清外泌体中的表达差异；
图2为Roc分析血清外泌体来源的circ15:98707562|98708107对胶质瘤诊断的特异性，灵敏性。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
一、研究对象
病例组为在湖南省肿瘤医院收集的28例胶质瘤血清样本。对照组为同期进行社区疾病筛查的健康个体12例，按性别和年龄(±5岁)与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一致。
二、研究方法
(1)血清制备：使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，4℃静止24小时后3000g常温离心5分钟。用微量移液器抽取200ul上层血清分装至新的600ul离心管中，-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。
(2)血清外泌体的制备：取上述血清200μl于2000g常温离心30分钟，用微量移液器抽取上层清液至新的600μl离心管，加入40μl外泌体提取试剂(Total Exosome IsolationReagent(from serum)，货号4478360，Invitrogen公司)轻轻上下颠倒摇匀，4℃孵育45分钟。孵育结束后10000g常温离心10分钟，弃掉上清液，于沉淀中加入200μl Trizol使沉淀重悬，将悬液移至新的1.5ml tube管，补Trizol至1ml。
(3)外泌体中RNA的抽提：将上述重悬液于冰上静止裂解15分钟。裂解结束后4℃，12000rpm离心10min，上清液移至新的tube管。加氯仿200μl于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置15min，4℃，12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，冰上静置20min，4℃，12000rpm离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃，7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无酶水10μl溶解RNA，-80℃保存。
(4)cDNA制备：按照miRNA逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。反应总体积为20μl(总RNA 10μl，Random primer 1μl无酶水1μl，5×Reaction Buffer 4μl，RI 1μl，RT 1μl和10mM dNTP 2μl)。
| 成分 | 剂量/管 |
| 随机逆转录引物(1μM) | 1μl |
| RNA样本 | 10μl |
| 无酶水 | To 12μl |
逆转录第一步条件：65℃5分钟
逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。
(5)实时荧光定量PCR：汉恒生物科技(上海)有限公司合成的circ15:98707562|98708107特异性引物(见序列表SEQ NO：2和3)进行实时定量PCR：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μL反应体系如下：
实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。
(6)数据分析：用2-ΔΔCT表示对于对照组变化的倍数，其中△CT＝CT样本–CT内参，△△CT＝△CT病例–△CT对照。本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因(引物见序列表SEQ NO：4和5)，胶质瘤患者△CT的平均值为对照。数据利用软件GraphPad Prism和SPSS进行分析。
三、研究结果
病例组血清外泌体circ15:98707562|98708107表达水平较对照组显著下降(p＝0.0013)。具体数据如图1所示。
ROC曲线分析显示，circ15:98707562|98708107作为生物标记物对胶质瘤具有较高诊断价值(AUC＝0.924，p＜0.001，敏感度和特异度分别为87.5％和85.6％)。详细结果见图2。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 胶质瘤诊断标志物 circ15:98707562|98708107及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 546
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ucugcgggcc aggcaucgac auccgcaacg acuaucagca gcugaagcgc cuggagaacu 60
gcacggugau cgagggcuac cuccacaucc ugcucaucuc caaggccgag gacuaccgca 120
gcuaccgcuu ccccaagcuc acggucauua ccgaguacuu gcugcuguuc cgaguggcug 180
gccucgagag ccucggagac cucuucccca accucacggu cauccgcggc uggaaacucu 240
ucuacaacua cgcccugguc aucuucgaga ugaccaaucu caaggauauu gggcuuuaca 300
accugaggaa cauuacucgg ggggccauca ggauugagaa aaaugcugac cucuguuacc 360
ucuccacugu ggacuggucc cugauccugg augcgguguc caauaacuac auugugggga 420
auaagccccc aaaggaaugu ggggaccugu guccagggac cauggaggag aagccgaugu 480
gugagaagac caccaucaac aaugaguaca acuaccgcug cuggaccaca aaccgcugcc 540
agaaaa 546
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ccgatgtgtg agaagacca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
tggagatgag caggatgtg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
atcatcagca atgcctcct 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
catcacgcca cagtttcc 18
Claims (6)
1.一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物circ15:98707562|98708107，其序列如SEQ NO:1所示。
2.检测权利要求1所述的CircRNA标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。
3.一种胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，能够测定血清外泌体中的circ15:98707562|98708107的含量。
4.根据权利要求3所述的胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，含有检测circ15:98707562|98708107含量的PCR引物。
5.根据权利要求4所述的胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，引物的序列如SEQNO:2和3所示。
6.根据权利要求3或4或5所述的胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，除circ15:98707562|98708107的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。
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