CN112143821A

CN112143821A - Fret检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用

Info

Publication number: CN112143821A
Application number: CN202011060188.0A
Authority: CN
Inventors: 杨琼; 何冰虹; 邱田
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2020-12-29

Abstract

本发明公开了FRET检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用。本发明所要保护的一个技术方案是鉴定或辅助鉴定病原菌的多重PCR引物对组合物和单碱基延伸引物组合物，所述多重PCR引物对组合物由引物对A、引物对B和引物对C组成，所述单碱基延伸引物组合物由引物D、引物E和引物F组成。该多重PCR引物对组合物和单碱基延伸引物组合物能在一个PCR体系中特异性地检测白色念珠菌、新生隐球菌和/或肺炎克雷伯杆菌，能准确地鉴定白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的任意组合侵染，灵敏度为31.25pg。

Description

FRET检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及FRET检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用。

背景技术

近年来，随着高效广谱抗生素、免疫抑制剂、抗恶性肿瘤药物的广泛应用，器官移植、导管技术以及外科其他介入性治疗的深入开展，条件致病性真菌引起的系统性真菌病日益增多，新的致病菌不断出现，病情也日趋严重。其中，新型隐球菌(新生隐球菌(Cryptoccus neo formans))和白色念珠菌(白色念球菌(Candida Albicans))是人类最常见的两种真菌病原体，在真菌感染感染中容易造成侵袭性感染。而细菌感染中，肺炎克雷伯杆菌(肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae))的感染为主要的革兰氏阴性菌感染。在临床上，主要的病原菌检测手段依然是血培养，但是血培养周期长，检出率不高，容易导致患者错过最佳治疗时机。除此之外，非分子方法还包括β-葡聚糖测定以及抗体测定。β-葡聚糖测定主要适用于腹内侵入性真菌感染患者，尤其在血液培养物敏感性低且难以准确鉴别时。白色念珠菌芽管抗体(CAGTA)测定是用间接免疫荧光法检测位于白色念珠菌芽管表面的抗体。但是上述两种非分子方法依然存在灵敏度差、鉴定耗时长、易产生假阳性结果等缺点。除非分子方法外，还有分子方法。目前临床广泛应用的检测感染的分子方法有PCR技术、荧光原位杂交、质谱法、T2磁共振等方法。分子方法具有简单易用、周转时间短等特点，明显优于非分子方法，但是仍存在灵敏度和特异性略低、实验设备和试剂昂贵等缺点，难以广泛普及。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌或如何鉴定肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物，所述组合物由多重PCR引物对组合物和单碱基延伸引物组合物组成。

所述多重PCR引物对组合物由引物对A、引物对B和引物对C组成；所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA、序列表中序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA、序列表中序列7所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对C为由序列表中序列8所示的单链DNA、序列表中序列9所示的单链DNA组成的引物对。

所述单碱基延伸引物组合物由引物D、引物E和引物F组成；所述引物D为序列表中序列10所示的单链DNA；所述引物E为序列表中序列11所示的单链DNA；所述引物F为序列表中序列12所示的单链DNA。

所述病原菌为肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌。

上述多重PCR引物对组合物中所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C的摩尔比为1:1:1。上述单碱基延伸引物组合物中所述引物D、所述引物E和所述引物F的摩尔比为1:1:1。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定病原菌的试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒含有上述鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物。所述病原菌为肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌。

上述试剂或试剂盒含有荧光标记双脱氧核苷酸。上述试剂或试剂盒还含有水溶性共轭聚合物PFP。

上文所述鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物的多重PCR引物对组合物也属于本发明的保护范围；所述病原菌为肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌。

上文所述多重PCR引物对组合物和/或单碱基延伸引物组合物在制备鉴定或辅助鉴定肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌产品中的应用也属于本发明的保护范围。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物的方法，包括将上述多重PCR引物对组合物和所述单碱基延伸引物组合物分别单独包装的步骤。

实验证明，本发明所提供的FRET检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的组合物，能够在一个PCR体系中特异性地检测白色念珠菌、新生隐球菌和/或肺炎克雷伯杆菌，能准确地鉴定白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的任意组合侵染。检测灵敏度高，在病原菌的浓度为pg级别可准确鉴定；检测特异性好，能在多种病原菌样品中特异检测白色念珠菌，新生隐球菌和/或肺炎克雷伯杆菌。

附图说明

图1为无病原菌感染的溶液荧光颜色。

图2为肺炎克雷伯杆菌感染的溶液荧光颜色。

图3为新生隐球菌感染的溶液荧光颜色。

图4为白色念珠菌感染的溶液荧光颜色。

图5为肺炎克雷伯杆菌与白色念珠菌共感染的溶液荧光颜色。

图6为肺炎克雷伯杆菌与新生隐球菌共感染的溶液荧光颜色。

图7为白色念珠菌与新生隐球菌共感染的溶液荧光颜色。

图8为肺炎克雷伯杆菌与新生隐球菌和白色念珠菌共感染的溶液荧光颜色。

图9为本发明中鉴定病原菌的组合物中多重PCR引物对组合物对不同浓度模板量的灵敏性实验结果。Klebsiella Pneumoniae代表肺炎克雷伯杆菌；Candida Albicans代表白色念株菌；Cryptoccus neoformans代表新型隐球菌。“1-6”代表不同的病原菌模板浓度。

图10为本发明鉴定病原菌的组合物中的引物对A对多种单一标准菌样品中白色念珠菌的特异性检测结果。Candida Albicans代表白色念株菌检测组。

图11为本发明鉴定病原菌的组合物中的引物对B对多种单一标准菌样品中新型隐球菌的特异性检测结果。Cryptoccus neoforman代表新型隐球菌检测组。

图12为本发明鉴定病原菌的组合物中的引物对C对多种单一标准菌样品中肺炎克雷伯杆菌的特异性检测结果。Klebsiella Pneumoniae代表肺炎克雷伯杆菌检测组。

图13为本发明鉴定病原菌的组合物中多重PCR引物对组合物对多种单一标准菌样品的多重PCR检测结果。

图14为病原菌备选引物组合对肺炎克雷伯杆菌与新生隐球菌和白色念珠菌混合样品的多重PCR检测结果(浓度：20ng/μL)。泳道1为备选引物组合1的检测结果；泳道2为备选引物组合2的检测结果；泳道3为备选引物组合3的检测结果；泳道4为备选引物组合4的检测结果。

图15为本发明鉴定病原菌的组合物中的多重PCR引物对组合物对肺炎克雷伯杆菌与新生隐球菌和白色念珠菌混合样品的多重PCR检测结果。泳道1-4分别代表不同模板浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、FRET检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌方法的建立

通过PCR-FRET(荧光能量共振转移fluorescence resonance energy transfer,FRET)系统进行病原菌种类检测。

1、引物的设计与合成

分别以白色念珠菌的特异序列(真菌的DNA条形码位于核糖体DNA(rDNA)，rDNA由非转录区、外转录间隔区、18srDNA、ITS1、5.8s rDNA、ITS2和28s rDNA组成。本次选用的序列来自ITS2区)、新生隐球菌的特异序列(真菌的DNA条形码位于核糖体DNA(rDNA)，rDNA由非转录区、外转录间隔区、18srDNA、ITS1、5.8s rDNA、ITS2和28s rDNA组成。本次选用序列来自ITS1至ITS2区域)和肺炎克雷伯杆菌(细菌的核糖体DNA由5s rDNA、16s rDNA和23srDNA组成。本次选用的序列来自16s rDNA)的特异序列为靶序列，设计三组PCR引物对和三个单碱基延伸引物。三组PCR引物对分别为引物对A、引物对B和引物对C；三个单碱基延伸引物为引物D、引物E和引物F。引物对A用于特异性扩增白色念珠菌的保守序列，引物D用于对引物对A的PCR产物进行单碱基延伸反应；引物对B用于特异性扩增新生隐球菌的保守序列，引物E用于对引物对B的PCR产物进行单碱基延伸反应；引物对C用于特异性扩增肺炎克雷伯杆菌的保守序列，引物F用于对引物对C的PCR产物进行单碱基延伸反应。

引物对A：

引物1：5’-ACGGATCTCTTGGTTCTCGC-3’(序列表中序列4)

引物2：5’-AGCCATTGTCAAAGCGATCC-3’(序列表中序列5)

引物对B：

引物3：5’-ACATCGATGAAGAACGCAGC-3’(序列表中序列6)

引物4：5’-CGGCAAACACCCAAATCCAA-3’(序列表中序列7)

引物对C:

引物5：5’-CTACTTATCCCGACAGCCCG-3’(序列表中序列8)

引物6：5’-ACCAGCAGACGAACTTCCTGCTC-3’(序列表中序列9)

引物D：5’-ACGGATCTCTTGGTTCTCGC-3’(序列表中序列10)

引物E：5’-ACATCGATGAAGAACGCAGC-3’(序列表中序列11)

引物F：5’-ACCAGCAGACGAACTTCCTGC-3’(序列表中序列12)

2、多重PCR扩增

使用引物对A、引物对B和引物对C对病原菌进行多重PCR反应。

PCR反应体系：模板20ng,TaKaRa Taq HS(5U/μL)0.25μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL。

引物对A、B、C混合物各2μL(引物的浓度均为10μM)。

多重PCR扩增：

95℃5min；

95℃30s；

58℃30s；

72℃30s；

40个循环，72℃10min。

引物对A扩增白色念珠菌的保守序列得到白色念珠菌的特异性PCR产物(序列表中序列1；引物对B扩增新生隐球菌的保守序列得到新生隐球菌的特异性PCR产物(序列表中序列2)；引物对C扩增肺炎克雷伯杆菌的保守序列得到肺炎克雷伯杆菌的特异性PCR产物(序列表中序列3)。

3、单碱基延伸反应得到荧光标记产物

将荧光标记双脱氧核苷酸通过单碱基延伸反应添加到步骤2的多重PCR反应产物中，得到荧光标记产物。荧光标记双脱氧核苷酸包括ROX-ddATP，Cy5-ddCTP，Fl-ddUTP。不同病原菌在单碱基延伸反应中连接到3’末端的荧光分子不同。其中Fl-ddUTP是肺炎克雷伯杆菌对应的单碱基延伸引物D的延伸碱基，可以通过引物D的单碱基延伸反应添加到肺炎克雷伯杆菌的特异性PCR产物中，Fl为荧光胺；ROX-ddATP是白色念珠菌对应的单碱基延伸引物E的延伸碱基，可以通过引物E的单碱基延伸反应添加到白色念珠菌的特异性PCR产物中；Cy5-ddCTP是新生隐球菌对应单碱基延伸引物F的延伸碱基，可以通过引物F的单碱基延伸反应添加到新生隐球菌的特异性PCR产物中。

3.1PCR产物的消化：

取8μL多重PCR扩增产物加上1单位碱性磷酸酶(Takara，2660A)、10单位核酸外切酶I(Takara，2650A)和0.05单位酵母焦磷酸酶(NEB，M2403)，37℃消化40min，95℃消化15min。

3.2单碱基延伸：

取2μL消化产物作为模板，加入1×thermosequenase reaction buffer，1单位thermo sequenase DNA polymerase，三种单碱基延伸引物各1μL(终浓度为1μM)，三种荧光标记ddNTP(Perkinelmer，ROX-ddATP NEL478001EA，Cy5-ddCTP NEL588001EA，Fl-ddUTPNEL401001EA)(终浓度为2μmol/L)，补水到10μL。95℃4min，95℃30s，60℃30s，60cycle，最后4℃保存。

4、紫外光下的可视化检测

在单碱基延伸反应产物中加入20μL 0.2mmol/L PFP(水溶性共轭聚合物，供体荧光分子)溶液(由中科院化学所王树课题组提供，文章：Duan X,Li Z,He F,et al.Asensitive and homogeneous SNP detection using cationic conjugated polymers[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(14):4154.)，充分混匀后在365nm的紫外灯箱中激发，观察溶液颜色变化。

延伸产物加入PFP聚合物溶液中，只有标记到DNA上的荧光物质能与PFP发生荧光能量共振转移，这是由于PFP聚合物的发射光谱和荧光物质的吸收光谱有一定的重叠，长链的DNA与聚合物或者寡聚物形成静电复合物使DNA上的荧光物质距离PFP很近，发生有效的能量转移，从而能够实现荧光的不同激发。

由于PFP在紫外灯下激发的荧光颜色为蓝色，当有ROX-ddATP、Cy5-ddCTP或Fl-ddUTP荧光分子通过单碱基延伸反应连接到DNA上时，ROX-ddATP、Cy5-ddCTP或Fl-ddUTP荧光分子将作为受体分子，由于荧光能量共振转移效应会使得供体荧光分子发生荧光淬灭，受体分子激发出相应荧光。由于不同病原菌在单碱基延伸反应中连接到3’末端的荧光分子不同，可通过溶液荧光的颜色判断感染的病原菌类型。

当样品体系中有肺炎克雷伯杆菌感染时，溶液为绿色；

当样品体系中有新生隐球菌感染时，溶液为紫红色；

当样品体系中有白色念珠菌感染时，溶液为亮红色；

当样品体系中有肺炎克雷伯杆菌和白色念珠菌共感染时，溶液为亮黄色；

当样品体系中有肺炎克雷伯杆菌和新生隐球菌共感染时，溶液为浅黄色；

当样品体系中有白色念珠菌和新生隐球菌共感染时，溶液为暗红色；

当样品体系中有肺炎克雷伯杆菌、白色念珠菌和新生隐球菌共感染时，溶液为亮粉色。

实施例2、白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌FRET检测方法的应用

1、病原菌检测样品：

无感染样品来源于无菌三蒸水。病原菌样品：肺炎克雷伯杆菌(由八一儿童医院惠赠，文章：陈冲,花少栋,梅亚波,et al.影响脓毒症休克早产儿预后的危险因素[J].中华围产医学杂志,2018,21(12):801-807.)；新生隐球菌JEC21和H99-2(由北师大生科院朱旭东课题组惠赠：Dong L,Xiaojiao Z,Zhongming L,et al.Cryptococcus neoformans Ca2+homeostasis requires a chloride channel/antiporter Clc1 in JEC21,but not inH99[J].Fems Yeast Research,2012(1):69-77.)；白色念珠菌(为本实验室储存：杨琼,苏全平,温得中,等.系统性白色念珠菌感染的免疫应答反应及疫苗研究进展[J].生理科学进展,2006(03):259-262.)。

2、病原菌检测结果

提取步骤1中病原菌样品的DNA和无感染样品的DNA，使用实施例1中的检测方法检测病原菌的类型。

结果如图1-图8所示，无感染的检测样品发出蓝光，溶液为蓝色(图1)；感染肺炎克雷伯杆菌的样品发出绿光，溶液为绿色(图2)；感染新生隐球菌的样品发出紫红色光，溶液为紫红色(图3)；感染白色念珠菌的样品发出亮红色光，溶液为亮红色(图4)；肺炎克雷伯杆菌和白色念珠菌共感染的样品发出亮黄色光，溶液为亮黄色(图5)；肺炎克雷伯杆菌和新生隐球菌共感染的样品发出浅黄色光，溶液为浅黄色(图6)；白色念珠菌和新生隐球菌共感染的样品发出暗红色光，溶液为暗红色(图7)；肺炎克雷伯杆菌、白色念珠菌和新生隐球菌三种菌共感染的样品发出亮粉色光，溶液为亮粉色(图8)。

本发明所提供的白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌FRET检测方法通过一管多重检测可以实现快速检测；同时由于PCR以及单碱基延伸反应时间较短，可以较快得到实验结果；同时，单碱基延伸反应实际是对于PCR反应的再次检验，可以提高检验效率，保证实验结果的可靠性。

3、白色念珠菌、新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌FRET检测方法的灵敏度实验

由于本设计中，检测方法的灵敏性基于多重PCR扩增结果，目的片段的有效扩增是FRET检测方法建立的基础。因此，检测PCR扩增最低模板量是检测本设计中引物灵敏度的有效方法。分别使用步骤1中三种病原菌样品的不同DNA模板浓度作为检测样品，在反应体系中分别加入不同浓度模板量和实施例1中的检测病原菌引物组合物中的多重PCR引物对进行多重PCR反应，在多重PCR后进行DNA凝胶电泳，检测结果如图9所示，由左至右分别是肺炎克雷伯杆菌、白色念珠菌和新生隐球菌的扩增结果。其中不同泳道模板DNA浓度如表1所示：

表1灵敏度实验中不同病原菌样品DNA浓度

泳道	1	2	3	4	5	6
							DNA浓度(ng/μl)	1	0.5	0.25	0.125	0.0625	0.03125

根据DNA凝胶电泳图可以看出，该多重PCR引物对组合物在pg级别具体为31.25pg都能很好扩增出目的DNA片段，检测出病原菌。

4、白色念珠菌、新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌FRET检测方法的特异性实验

由于本发明设计中，检测方法的特异性表现为在含有多种菌株的模板中，特异性扩增出目的条带，因此，选用常见菌种DNA作为模板，进行PCR扩增是检测特异性的有效手段。使用步骤1中三种病原菌的单一标准菌样品的DNA和常见菌种近平滑念珠菌、热带念珠菌大肠杆菌的单一标准菌样品的DNA作为检测样品，以三蒸水作为空白对照，使用本发明实施例1中多重PCR引物对组合物中的三对引物对分别进行PCR反应。PCR扩增后进行DNA凝胶电泳检测，图10为多重PCR引物对组合物中的引物对A对白色念珠菌的特异性扩增结果，结果显示引物对A能在白色念珠菌样品中特异地扩增出序列表中序列1所示的239bp长度的条带，其他病原菌样品中均没有扩增出条带；图11为多重PCR引物对组合物中的引物对B对新生隐球菌的特异性扩增结果，结果显示引物对B能在新生隐球菌样品中特异地扩增出序列表中序列2所示的184bp长度的条带，其他病原菌样品中均没有扩增出条带；图12为多重PCR引物对组合物中的引物对C对肺炎克雷伯杆菌的特异性扩增结果，结果显示引物对C能在肺炎克雷伯杆菌样品中特异地扩增出序列表中序列3所示的295bp长度的条带，其他病原菌样品中均没有扩增出条带。图13为多重PCR引物对组合物在不同病原菌中的多重PCR扩增结果，结果显示实施例1中多重PCR引物对组合物能够有效扩增出白色念珠菌、新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌。特异性实验检测结果中PCR产物电泳凝胶检测泳道从左到右依次代表扩增模板1-8如表2所示。特异性检测结果表明本发明所提供的检测三种病原菌的多重PCR引物对组合物能特异地检测白色念珠菌、新生隐球菌和/或肺炎克雷伯杆菌。

表2特异性实验电泳凝胶检测扩增模板顺序

5、白色念珠菌、新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌FRET检测方法的对比实验

分别通过软件设计病原菌备选引物，进行多重PCR扩增，DNA凝胶电泳鉴定扩增结果。引物配对如表3所示：斜体部分为替换引物。检测样本为步骤1中病原菌样品的DNA，模板浓度为：20ng/μl。

表3软件设计病原菌备选引物组合

注：斜体部分为替换引物。

通过DNA凝胶电泳鉴定多重PCR结果发现(如图14)，以上组合均不能有效实现多重PCR扩增，只有本设计中提供的是三种引物组合能够有效扩增出白色念珠菌、新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的保守区域片段(图15)。其中，图15是扩增的等量混合模板(白色念珠菌、新生隐球菌、肺炎克雷伯杆菌)的结果，其模板浓度如表4所示：

表4对比实验中凝胶检测泳道对应病原菌模板浓度

泳道	1	2	3	4
					DNA浓度(ng/μl)	1	5	10	20

序列表

<110> 北京师范大学

<120> FRET检测白色念珠菌，新生隐球菌和肺炎克雷伯杆菌的试剂及其应用

<130> GNCSQ202058

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 239

<212> DNA

<213> 白色念球菌(Candida albicans)

<400> 1

acggatctct tggttctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatac gtaatatgaa 60

ttgcagatat tcgtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccctct ggtattccgg 120

agggcatgcc tgtttgagcg tcgtttctcc ctcaaaccgc tgggtttggt gttgagcaat 180

acgacttggg tttgcttgaa agacggtagt ggtaaggcgg gatcgctttg acaatggct 239

<210> 2

<211> 184

<212> DNA

<213> 新生隐球菌(Cryptoccus neo formans)

<400> 2

acatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat 60

catcgagtct ttgaacgcaa cttgcgccct ttggtattcc gaagggcatg cctgtttgag 120

agtcatgaaa atctcaatcc ctcgggtttt attacctgtt ggacttggat ttgggtgttt 180

gccg 184

<210> 3

<211> 295

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 3

ctacttatcc cgacagcccg gagcgttttt caatcggcgc gccgctgggg cgaggtttac 60

gtctcaaccg gctggggatc caccacgagc ggctgccgcc cgggcggcgc acctcttatc 120

cacacgcgga gagcgatgag gaagagttca tctacgtgct ggagggctat ccggaagtgt 180

ggataaacgg ctatctctgg aagctggagc ccggcgacag cgtgggtttt cccgctggta 240

ccggcatctg ccacaccttt ctcaataaca ccgagcagga agttcgtctg ctggt 295

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）Artificial Sequence

<400> 4

acggatctct tggttctcgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 5

agccattgtc aaagcgatcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 6

acatcgatga agaacgcagc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 7

cggcaaacac ccaaatccaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 8

ctacttatcc cgacagcccg 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 9

accagcagac gaacttcctg ctc 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 10

acggatctct tggttctcgc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 11

acatcgatga agaacgcagc 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 12

accagcagac gaacttcctg c 21

Claims

1.鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物，所述组合物由多重PCR引物对组合物和单碱基延伸引物组合物组成；

所述多重PCR引物对组合物由引物对A、引物对B和引物对C组成；所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA、序列表中序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA、序列表中序列7所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对C为由序列表中序列8所示的单链DNA、序列表中序列9所示的单链DNA组成的引物对；

所述单碱基延伸引物组合物由引物D、引物E和引物F组成；所述引物D为序列表中序列10所示的单链DNA；所述引物E为序列表中序列11所示的单链DNA；所述引物F为序列表中序列12所示的单链DNA；

2.根据权利要求1所述的鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物，其特征在于：所述多重PCR引物对组合物中所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C的摩尔比为1:1:1。

3.根据权利要求1或2所述的鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物，其特征在于：所述单碱基延伸引物组合物中所述引物D、所述引物E和所述引物F的摩尔比为1:1:1。

4.鉴定或辅助鉴定病原菌的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有权利要求1-3中任一权利要求所述的鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物；

5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有荧光标记双脱氧核苷酸。

6.根据权利要求4或5所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有水溶性共轭聚合物PFP。

7.鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物，所述组合物由权利要求1中所述多重PCR引物对组合物组成；所述病原菌为肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌。

8.权利要求1-3中任一权利要求所述的多重PCR引物对组合物和/或单碱基延伸引物组合物在制备鉴定或辅助鉴定肺炎克雷伯杆菌、新生隐球菌和/或白色念珠菌产品中的应用。

9.制备权利要求1-3中任一权利要求所述的鉴定或辅助鉴定病原菌的组合物的方法，包括将所述多重PCR引物对组合物和所述单碱基延伸引物组合物分别单独包装的步骤。