CN103740832A - 一种新型隐球菌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型隐球菌（CN-DNA）检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于CN-DNA检测的引物和探针序列如下，CN-DNA上游引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，CN-DNA下游引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，CN-DNA探针：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。使用本发明的试剂盒检测新型隐球菌的灵敏度高，定量线性范围宽；应用该试剂盒可以对全血、血清（血浆）、肺泡灌洗液等培养物中的CN-DNA进行快速准确的检测，为诊断新型隐球菌感染提供可靠的实验依据。
Description
技术领域
本发明提供一种新型隐球菌检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的CN检测试剂盒。
背景技术
新型隐球菌（Cryptococcus Neoformans，CN）是一种可引起人类严重感染的酵母样病原真菌，主要引起细胞免疫功能低下者，如器官移植、长期应用激素及艾滋病(AIDS)患者并发隐球菌病。
新型隐球菌通常经呼吸道或皮肤黏膜破损处侵入人体，血行播散至脑、骨骼和皮肤。有80%病例中枢神经系统受损，引起慢性脑膜炎，此外，还可引起肺隐球菌病，以及其他感染，如侵害淋巴结、骨、皮肤等引起炎症、脓肿等。临床检测方法主要有墨汁染色、脑脊液细胞形态学检验、组织病理学方法等。墨汁染色和脑脊液细胞形态学检验、组织病理学方法均难以计数，且需进行创伤性操作，临床应用具有局限性。
近年来以DNA为基础的PCR分子生物学检测方法因快速、准确而倍受关注，成为探索的热点，主要包括巢式PCR（nest PCR）、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantifyPCR）等。由于实时荧光定量PCR在速度、操作、特异性等多方面存在众多优势，因此临床上其中新型隐球菌感染早期诊断领域的应用愈加广泛，给临床诊断和治疗带来了重要的指导意义。
运用荧光PCR技术检测新型隐球菌DNA主要包括新型隐球菌核酸提取和核酸PCR扩增两方面。
目前国内临床上主要采用机械破碎法对新型隐球菌核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，反复高速震荡和高速离心，再取上清为模板。该方法的优点在于对于样本中的PCR抑制物去除较彻底，但存在步骤繁琐，操作时间长，对于操作人员技术水平要求高和需添置专门的设备等不足之处。
临床上检测CN-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
目前国外已有基于实时荧光定量PCR技术检测CN-DNA的试剂盒，但这些试剂盒的核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低。且其检测灵敏度不高，某些弱阳性样本经常无法扩增。这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。另外，受限于现有技术中针对CN-DNA检测的引物探针序列，本领域还需要开发出一种检测CN-DNA特异性好且综合性能优良的PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明提供一种核酸释放剂在新型隐球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。
在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在CN检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该核酸检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。
本发明提供一种新型隐球菌（CN-DNA）检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于CN-DNA检测的引物和探针序列如下，
CN-DNA上游引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
CN-DNA下游引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA探针：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测CN的灵敏度高，定量线性范围宽。另外，本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和探针序列，具有很好的特异性。
本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，且所述PCR反应液中还包含用于检测内标的引物和探针序列，
内标：AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA；
内标上游引物：TGAAGACTTACACAAGCCTGGG，
内标下游引物：TGAATCCTTGCAGCACTGTC，
内标探针：ACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTG。
本发明中所述内标为插入pUC18T载体的一段长为125碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。
优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5～2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。
在一个具体实施方式中，所述试剂盒中包括核酸释放剂、内标、PCR反应液、酶混合液、CN定量参考品、CN阳性对照、CN阴性对照和CN浓缩液。
本发明还提供一种新型隐球菌CN-DNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于CN-DNA检测的引物和探针序列如下，
CN-DNA上游引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
CN-DNA下游引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA探针：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
本发明提供的新型隐球菌荧光定量PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，应用该试剂盒可以对全血、血清（血浆）、肺泡灌洗液等培养物中的CN-DNA进行快速准确的检测，为诊断新型隐球菌感染提供可靠的实验依据。
具体实施方式
以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
另外，如未做特殊交待，则本发明中的百分含量指质量百分含量。
实施例1
本实施例提供一种具体的新型隐球菌检测试剂盒，它包括如下组分：
①核酸释放剂：包含莎梵婷（surfactin）0.1mmol/L，氯化钾100mmol/L，十二烷基磺酸钠（SDS）0.1%，0.1%的乙醇和溶剂TE缓冲液。
②内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为125碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为2.00E+05copies/ml，125碱基对的序列为：
5’-AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA-3’；
③PCR反应液：包括10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物均为0.3μmol/L，用于靶多核苷酸检测的探针为0.3μmol/L，用于内标片段扩增的上下游引物均为0.1μmol/L，用于检测内标的探针为0.1μmol/L。其中，所述10×PCR反应缓冲液为包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于新型隐球菌核酸的保守区域的引物和探针，其碱基序列分别为：
CN-DNA上游引物：5’-TGGACTTGGATTTGGGTGTTT-3’，
CN-DNA下游引物：5’-GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT-3’，
CN-DNA探针：5’-CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC-3’；
所述的用于检测内标的引物探针序列分别为：
内标上游引物：5’-TGAAGACTTACACAAGCCTGGG-3’，
内标下游引物：5’-TGAATCCTTGCAGCACTGTC-3’，
内标探针：5'-ACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTG-3'。
④酶混合液：包含5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.3U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）。
⑤CN定量参考品：来源于使用CN企业定量线性参考品L1～L5定值后的CN强阳性质粒，该定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00～5.00E+06CFU/ml（A）、1.00～5.00E+05CFU/ml（B）、1.00～5.00E+04CFU/ml（C）、1.00～5.00E+03CFU/ml（D）。
⑥CN阳性对照：为临床医院收集的CN强阳性样本，其浓度为1.00～5.00E+05CFU/ml。
⑦CN阴性对照：为灭菌生理盐水。
⑧CN浓缩液：聚乙二醇6000（PEG-6000）10～100mmol/L（质量/体积），氯化钠50～500mmol/L（质量/体积）。
实施例2
本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测全血、血清（血浆）、肺泡灌洗培养物等未知样本中CN-DNA的操作步骤：
一、试剂准备
根据待测样本、CN阴性对照、CN阳性对照以及CN定量参考品A～D的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（1μl/人份）及内标0.5μl/人份，充分混匀成PCR-mix；瞬时离心后备用。
二、核酸提取
1.待测样本：取100μl待测样本，加入CN浓缩液100μl，振荡混匀后12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入50μl核酸释放剂，震荡或移液枪吸打混匀，100℃处理10min，12000r/min离心3min，作为待测样本备用。
2.CN阴性对照、CN阳性对照、CN定量参考品：CN阴性对照、CN阳性对照、CN定量参考品A～D分别取10μl与10μl核酸释放剂混匀待用。
三、向PCR反应管中加样
每个PCR反应管中加入上述第二步骤中处理后的待测样本、CN阴性对照、CN阳性对照以及CN定量参考品A～D各10μl；静置10分钟后，每管加入步骤一中的PCR-mix40μl，吸打混匀2-3次，去除气泡后盖上管盖，2000rpm离心30秒。
四、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）
1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。
2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测CN；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标；参比荧光（Passive Reference）设置为none。
3）荧光定量PCR反应条件见表1：
表1
4）结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定量检测结果。对于测定Ct值≤39（Ct值＞0）的样本，报告为CN-DNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为CN-DNA阴性，此时待测样本扩增曲线平直；对于测定Ct值>39的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为低于检测下限。若内标Ct值>39或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
本发明能检测出CN感染，但不能检测出非CN病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性；本发明的试剂盒与肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、MP、EBV、呼吸道合胞病毒等样本均无交叉反应。本发明的试剂盒的定量线性范围为10CFU/ml～1.00E+07CFU/ml，检测灵敏度为10CFU/ml。使用本发明所述试剂盒检测企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100%，灵敏度参考品的检测结果符合质量标准。精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10%，浓度变异系数<50%。
Claims (6)
1.一种核酸释放剂在新型隐球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。
2.一种新型隐球菌CN-DNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于CN-DNA检测的引物和探针序列如下，
CN-DNA上游引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
CN-DNA下游引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA探针：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，且所述PCR反应液中还包含用于检测内标的引物和探针序列，
内标：AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA；
内标上游引物：TGAAGACTTACACAAGCCTGGG，
内标下游引物：TGAATCCTTGCAGCACTGTC，
内标探针：ACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTG。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5～2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。
5.根据权利要求2～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括核酸释放剂、内标、PCR反应液、酶混合液、CN定量参考品、CN阳性对照、CN阴性对照和CN浓缩液。
6.一种新型隐球菌CN-DNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于CN-DNA检测的引物和探针序列如下，
CN-DNA上游引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
CN-DNA下游引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA探针：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, Changsha hi tech Development Zone, Hunan Patentee after: Shengxiang Biotechnology Co., Ltd Address before: 410012, No. 680, Lu Song Road, Changsha hi tech Development Zone, Hunan Patentee before: Sansure Biotech Inc. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200217 Granted publication date: 20160309 Pledgee: Suzhou Lirui equity investment center (limited partnership)|Triton equity investment partnership (limited partnership)|JUNHE Tongrui equity investment partnership (limited partnership)|Chenbang Pledgor: SANSURE BIOTECH Inc. Registration number: 2017430000042 |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210316 Address after: 201108 2nd floor, building 2, no.479 Chundong road and No.128 Shenfu Road, Minhang District, Shanghai Patentee after: Shengxiang (Shanghai) Gene Technology Co.,Ltd. Address before: No. 680, Lusong Road, Changsha high tech Development Zone, Hunan Province, 410012 Patentee before: Shengxiang Biotechnology Co.,Ltd. |