CN102154523B

CN102154523B - 检测人bk病毒核酸的引物与荧光探针及其应用

Info

Publication number: CN102154523B
Application number: CN 201110086450
Authority: CN
Inventors: 吴忠标; 曾爱平; 林国兵; 郑敏巧; 陈军
Original assignee: FIRST PEOPLE'S HOSPITAL OF WENLING
Current assignee: FIRST PEOPLE'S HOSPITAL OF WENLING
Priority date: 2011-04-07
Filing date: 2011-04-07
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2031-04-07
Also published as: CN102154523A

Abstract

本发明提供了一套检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。上游引物序列为：5’-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3’；下游引物序列为：5’-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3’；荧光探针序列为：5’-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3’；使用本发明检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针对人BK病毒核酸进行检测，敏感性和特异性大大提高，亦降低了常规PCR扩增的假阳性率，可快速作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。

Description

检测人BK病毒核酸的引物与荧光探针及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一套检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。

(二)背景技术

多瘤病毒属于乳多空病毒属。其中BK病毒(BKV)的原发感染主要在儿童期，可以无症状或仅有轻微的呼吸道症状。以后病毒停留在肾脏进入潜伏状态，但BKV具有高传播性、低致病性的特点。在肾移植病人，多瘤病毒的潜伏感染率较高。约10％～60％的健康肾移植患者有可能出现无症状的多瘤病毒复活，常常是间隙性的，且不影响肾功能。但如果病毒持续大量复制可以导致肾小管上皮细胞溶解、坏死，并出现基底膜的裸露，从而进入血液循环。病毒血症表明病毒处于极度活跃状态，有进一步导致移植物损害的危险。当病毒血症持续发展，BKV不断在靶细胞就可能导致BKV相关性肾病(BKVAN)。目前对BK病毒的检测多采用PCR方法，本专利则根据该BK病毒VP1基因序列设计荧光定量PCR引物和荧光探针，采用本套引物和MGB探针的TaqMan荧光定量PCR技术使得人们可以在利用PCR高灵敏性的情况下，对BK病毒进行实时精确定量检测，不仅解决了PCR的定量问题，而且还大大提高了病毒检测的特异性。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可应用于TaqMan荧光定量PCR技术检测BK病毒核酸载量的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一套检测人BK病毒核酸的特异性扩增引物与荧光探针，

上游引物序列为：5’-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3’；

下游引物序列为：5’-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3’；

荧光探针序列为：5’-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3’；

探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。

本发明检测人BK病毒核酸的引物，使得病毒核酸载量的检测敏感性大大提高，另外由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得检测者可以在极少的标本中获得足够的信息。

本发明还涉及所述的引物与荧光探针在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。所述试剂盒主要包括特异性引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等。该试剂盒关键在于特异性引物和荧光探针的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。

为达到定量检测的目的，所述试剂盒还可包括人BK病毒核酸标准品，所述标准品序列如下：CAAG AATTCCCCTC CCCAATTTAAATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGA TGTGGGAGGCTGTAACTGTA C。检测时先以梯度浓度的标准品溶液在相同条件下进行检测，绘制标准曲线，根据待测样品CT值，对照标准曲线，即可获知样品中人BK病毒核酸拷贝数。

将所述试剂盒应用于人BK病毒核酸的检测时，具体检测方法如下：

(1)提取样品DNA；待测样品可以是患者尿液、血液等；

(2)荧光PCR扩增检测：取PCR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷混合物、特异性扩增引物和荧光探针配成反应液，加入样品DNA为模板进行扩增反应，反应条件为：42℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃，5s变性，55℃复性与延伸40s，收集FAM荧光，共40个循环；

(3)结果分析：如果有HEX荧光积累，则表示样品中存在人BK病毒；如果没有荧光出现，则表示样品中不存在人BK病毒。定量检测时，则同时以梯度浓度的标准品在相同条件下进行荧光PCR扩增，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。

所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中PCR反应条件如下：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增，最后置于4℃。

PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×PCR buffer、0.3～0.5μM的引物、0.1～0.3μM的荧光探针、1～5U的DNA聚合酶、0.2～0.4mM的dNTPs，通常取2μL的模板，反应总体积通常为20～50μL。缓冲液终浓度为1×，是指缓冲液中各组分在反应体系中终浓度与1×PCR buffer相同。

本发明的有益效果主要体现在：使用本发明检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针对人BK病毒核酸进行检测，敏感性和特异性大大提高，亦降低了常规PCR扩增的假阳性率，可快速作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。

(四)附图说明

图1为带有标准品序列的质粒标准品实时荧光定量PCR检测结果；从左至右分别为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μL标准品(横坐标：PCR循环数；纵坐标为荧光强度)。

图2为实时荧光定量PCR标准曲线；标准曲线为Y＝-3.236×1gX+38.465；Y：对应的CT值；X：人BK病毒VP基因的copies。

图3为1例临床标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为27.42，拷贝数分别为2.59×10³copies/μL(横坐标：PCR循环数；纵坐标为荧光强度)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

一、材料：

病毒基因组DNA提取试剂购自大连宝生物技术有限公司；限制性内切酶购自美国LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系统、Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，测序试剂、377型测序仪、9600型PCR仪及7000型定量PCR仪均为美国ABI公司产品。

二、引物及探针设计与合成：

以BK病毒VP1基因序列为模板，使用Primer Express^TM(V2.0，美国ABI公司)软件分析引物和TaqMan-MGB探针位点，并根据同时考虑VP1基因DNA序列情况，从中选择最佳组合：

上游引物序列：5’-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3’

下游引物序列：5’-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3’

荧光探针序列：5’-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3’，

均由大连宝生物技术公司合成。

三、检测标准品制备：

患者的尿液标本用病毒DNA提取试剂提取基因组DNA，取5.0μl做PCR反应模板，用上下游引物在PE9600型PCR仪上进行PCR扩增，条件为94℃5分钟变性，94℃20秒、55℃20秒、72℃20秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。

PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。提取质粒，测定浓度并换算(拷贝数/体积)。

标准品序列如下：CAAG AATTCCCCTC CCCAATTTAAATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGA TGTGGGAGGCTGTAACTGTA C。

实施例2：

一、标本检测：

102例肾移植患者尿液标本，采用病毒DNA提取试剂提取基因组DNA，取1.0μL做模板，用检测用上下游引物和荧光探针在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

水补足至20μL。

PCR条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃。

同时加标准品在相同条件下检测作标准曲线。

测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的BK病毒核酸载量。

二、样品检测结果

标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2，样本检测结果见图3。

102例肾移植患者尿液标本中，仅测出1例患者标本检出BK病毒阳性，CT值分别为27.42，拷贝数分别为2.59×10³copies/μL，与PCR测序方法检测结果相符(PCR直接测序方法是鉴定病毒的金标准)。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 温岭市第一人民医院

<120> 检测人BK病毒核酸的引物与荧光探针及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

caagaattcc cctccccaat 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

gtacagttac agcctcccac atca 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

tgaatgagga cctaacctg 19

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

caagaattcc cctccccaat ttaaatgagg acctaacctg tggaaatcta ctgatgtggg 60

aggctgtaac tgtac 75

Claims

1.检测人BK病毒核酸的特异性扩增引物与荧光探针，其特征在于：

上游引物序列为：5’-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3’；

下游引物序列为：5’-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3’；

荧光探针序列为：5’-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3’；

其中FAM为荧光基团，MGB为荧光淬灭基团。

2.权利要求1所述的特异性扩增引物与荧光探针在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒还包括人BK病毒核酸标准品，所述标准品序列如下： CAAG AATTCCCCTC CCCAATTTAAATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGA TGTGGGAGGC TGTAACTGTAC。