CN104745723A - 一种用于检测bk病毒的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测bk病毒的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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CN104745723A CN201510050835.2A CN201510050835A CN104745723A CN 104745723 A CN104745723 A CN 104745723A CN 201510050835 A CN201510050835 A CN 201510050835A CN 104745723 A CN104745723 A CN 104745723A
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明公开了一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒，具有灵敏度高的特性，且检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。

Description

一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂盒。
背景技术
BK病毒(BK virus，BKV)是多瘤病毒(polyomaviruses，PV)的一种。BK病毒为无被膜环状双链病毒，呈全球性分布。流行病学表明90％以上健康成人既往有BK病毒感染史，患者免疫功能低下时BK病毒重新激活，可出现BK病毒尿症。据报道，约45％肾脏移植受者出现病毒激活，1％-10％的肾移植患者出现BK病毒相关性肾病(BK virus associated nephropaty，BKVAN)，其中60％-70％会导致移植肾丧失功能。除此之外，BK病毒的感染还与骨髓移植患者的出血性膀胱炎、输尿管狭窄、进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等有关。BK病毒往往潜伏在肾脏中，在免疫抑制状态下机体才可能会发病，如获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immuno-deficiency Syndrome，AIDS)、先天性免疫功能缺陷和接受化疗的恶性肿瘤患者以及应用免疫抑制剂治疗的实体器官移植及骨髓移植受者。对于接受免疫抑制治疗的人特别是肾移植后的患者，BK病毒容易再次激活且大量复制，导致疾病。由于目前缺乏有效针对BK病毒的抗病毒治疗手段，使得持续、有效地对BK病毒感染进行监测显得尤为重要。
在目前BK病毒感染的检测中采用病毒血清学检测法，具体采用酶免疫分析法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测BK病毒的抗体滴度，但此方法检测速度慢且特异性不高。
发明内容
为了解决现有技术中检测BK病毒的速度慢且特异性不高的问题，本发明实施例提供了一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于检测BK病毒的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针，其中，
所述用于检测BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测BK病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测BK病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和探针。
具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
所述工作标准品1为1×107拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段；
所述工作标准品2为1×106拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段；
所述工作标准品3为1×105拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段；
所述工作标准品4为1×104拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。
具体地，所述阳性质控品为1.0×106拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。
具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。
具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。
具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。
具体地，所述临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。
具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测BK病毒的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测BK病毒的试剂盒，具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为LogStarting Quantity copy number，纵坐标为Threshold Cycle。
图中：Cycles为循环数，RFU为荧光值，Log Starting Quantity copy number为水痘带状疱疹病毒起始浓度的对数值，Ct(Threshold Cycle)值为循环数；1a-实施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实施例2中样品7。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1.一种用于BK病毒核酸定量检测的引物和荧光探针
本发明实施例提供了一种用于检测BK病毒的引物和探针，引物和探针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针，其中，
用于检测BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
用于检测BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示
用于检测BK病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
表1.BK病毒引物和探针
表1中：F：forward，正向；BK病毒-F表示BK病毒的正向引物。R：reverse，反向；BK病毒-R表示BK病毒的反向引物。P：probe，荧光探针(探针)；BK病毒-P表示BK病毒荧光探针，荧光探针可以为TaqMan-MGB荧光探针、LNA荧光探针或MGB荧光探针。表1的设计的引物和探针均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。
本发明实施例提供的引物和探针具有灵敏度高的特性，且能够准确检测出待测样品中的BK病毒的含量。
实施例2.一种用于检测BK病毒的试剂盒
本发明实施例提供了一种用于检测BK病毒核酸定量的试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例1提供的引物和探针，该试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
具体地，PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。在本实施例中，PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL、浓度为10mmol/L的dNTPs2μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液5μL。
具体地，正向引物和反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM(正向引物和反向引物均为0.05-0.9μM)，探针的终浓度为0.05-0.9μM。在本实施例中，浓度为10μmol/L引物加入2.5μL，浓度为10μmol/L探针加入2.5μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中构成反应体系，再添加无菌水至体积为49.5μL。
具体地，核酸释放剂：Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)的终浓度为0.03％、NP-40(壬基酚聚氧乙烯(40)醚)的终浓度为0.04％和pH值为8.3的终浓度为0.01M的Tris-HCL(三(羟甲基)氨基甲烷)，溶剂为无菌水。
具体地，阴性质控品为浓度为0.8％的生理盐水。称量0.008g氯化钠固体溶于1ml双蒸水，混匀，直接吸取0.5μL作阴性质控品。
具体地，阳性质控品为1.0×106拷贝/mL的BK病毒的基因片段。取含BK病毒液，毒株由中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，CCTCC)提供，经培养后，取含BK病毒液100μL加入等体积的核酸释放剂充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×106拷贝/mL，即可作为阳性质控品模板。
具体地，临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的BK病毒的基因片段。该基因片段为DNA基因片段，取含BK病毒液，毒株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，经培养后，取含BK病毒液100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×104拷贝/mL，即可作为临界阳性质控品。
具体地，工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
工作标准品1为1×107拷贝/mL的BK病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品2为1×106拷贝/mL的BK病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3为1×105拷贝/mL的BK病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4为1×104拷贝/mL的BK病毒基因的非传染性DNA片段。
工作标准品，为含有BK病毒的高度保守基因的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×108拷贝/mL，于-20℃保存。贮存浓度为1.0×108拷贝/mL，使用前用无菌生理盐水或0.1mol/L PBS缓冲液(pH值为7.6)进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×107拷贝/mL，1.0×106拷贝/mL，1.0×105拷贝/mL和1.0×104拷贝/mL，使用前，经10,000rmp离心30s，取上清液作为工作标准品。本实施例提供的试剂盒成分如下：
表2.试剂盒配置(24人份/盒)：
该试剂盒可在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融，该试剂盒适用的荧光定量PCR仪包括：Roche LightCycler480、ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5TM、Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P和达安7000等。
用本发明实施例2提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上检测BK病毒，具体方法如下：
(1)采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中5个为经检测已知的阳性样品，3个为经检测已知的阴性样品，样品可以为血浆、血清或尿液，在5个经检测已知的阳性样品中有2个样品为血清，1个为血浆，其余2个为尿液，在3个经检测已知的阴性样品中有1个样品为血清，1个为血浆，其余1个为尿液。
①血清的预处理：取0.5ml血液品置于1.5ml离心管中，2000r/min离心5min，分离出血清。离心管于4℃保存备用。
②血浆的预处理：取0.5ml血液品置于1.5ml离心管中，加入抗凝剂，轻轻颠倒混匀，2000r/min离心5min，分离出血浆。离心管于4℃保存备用。
③尿液标品处理：将采集的尿液样品振荡混匀，取1ml转移至离心管中，13,000rpm离心10min，弃上清，离心管于4℃保存备用。
样品保存和运输：如果样品不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。标品长途运送应采用0℃冰壶。
(2)样品处理：取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品。
(3)加样：向装有PCR反应液、引物和探针的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品各0.5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品或工作标准品的体积比为99：1，经5,000rpm离心10s。
(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品选Unknown。
按下面程序进行PCR扩增：
95℃3分钟；
95℃10秒，60℃1分钟(收集荧光信号)，40个循环。
(5)分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于28且小于等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的扩增结果如图1所示(图1在Ct值为32时已经可以判断出样品结果)，具体检测结果见下表3。
表3为实施例2提供的样品对应的Ct值
序号 Ct值
1 23.79
2 N/A
3 N/A
4 22.38
5 25.32
6 22.78
7 21.08
8 N/A
其中，样品1，4，5，6，7在阳性范围内，为阳性样品；N/A表示阴性，样品2，3，8在阴性范围内，为阴性样品，结果与已知的一致，可见本发明实施例2提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％，以图1为例，在图1中将阳性样品扩增结果标出，图2-图5中的排布规律参见图1。
实施例3.一种用于检测BK病毒的试剂盒
本发明实施例提供了一种检测样品中BK病毒核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：
PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液3μL。
浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入0.25μL，浓度为10μmol/L探针加入0.25μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为10μL。
DNA提取液包括Triton-X100终浓度为0.1％、NP-40终浓度为0.2％和Tris-HCL(pH值为8.3)终浓度为0.05M/L。
表4.实施例3提供的试剂盒配置(24人份/盒)：
采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中8个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：
加样：向装有10μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品40μL，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图2所示，得到具体检测结果见表5。
表5为实施例3提供的样品对应的Ct值
序号 Ct值
1 28.45
2 23.38
3 19.14
4 N/A
5 22.38
6 25.46
7 N/A
8 21.45
9 22.09
10 31.57
表5中，样品2、3、5、6、8和9在阳性范围内，为阳性样品；样品1和10在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共8个且与已知检测结果相符；样品4和7在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例3提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。
实施例4.一种用于检测BK病毒的试剂盒
本发明实施例提供了一种检测样品中BK病毒核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：
PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 3μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液10μL。
浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入4.5μL，浓度为10μmol/L探针加入4.5μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为45μL。
DNA提取液包括Triton-X100终浓度为0.1％、NP-40终浓度为0.2％和Tris-HCL(pH值为8.3)终浓度为0.05M/L。
其余试剂与实施例2中提供的试剂相同。
采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：
加样：向装有10μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品各5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品的体积比为9：1，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图3所示，得到具体检测结果见表6。
表6为实施例4提供的样品对应的Ct值
序号 Ct值
1 25.08
2 30.45
3 26.64
4 31.47
5 N/A
6 N/A
7 22.53
8 31.04
表6中，样品1、3和7在阳性范围内，为阳性样品；样品2、4和8在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共6个且与已知检测结果相符；样品5和6在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例4提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。
实施例5.一种用于检测BK病毒的试剂盒
在利用本发明实施例4提供的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样品反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还有4个反应管，对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5μL，按照实施例4的方法配制PCR反应体系，5000rpm离心10s，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×107拷贝/ml、1.0×106拷贝/ml、1.0×105拷贝/ml、1.0×104拷贝/ml及1.0×103拷贝/ml。
采用使用仪器Bio-Rad iQ5TM进行检测。
参照结果：
a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品BK病毒DNA含量小于检测下限；
b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品BK病毒DNA含量处于临界阳性范围；
c.如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：若样品的C(“C”表示样品浓度或含量)＜5.0000E+01，则该样品的BK病毒DNA总含量＜50基因拷贝；若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的BK病毒DNA总含量等于C基因拷贝；若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的BK病毒DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测，具体检测结果见表7；
表7为Ct值及其对应的起始浓度
工作标准品 Ct值 C(起始浓度)
1.0e+007 18.03 1.0e+007
1.0e+006 21.34 1.0e+006
1.0e+005 24.65 1.0e+005
1.0e+004 27.96 1.0e+004
Slope -3.31 -
Intercept 41.2 -
R2 1 -
标准方程 y＝-3.31x+41.2 -
本发明实施例5提供的样品的扩增曲线如图5所示，本发明实施例5提供的工作标准品和8个样品在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图6的标准曲线，再经换算，最终得到8个样品的初始浓度如下表。
序号 Ct值 C(起始浓度)
阳性质控品 19.86 2.800e+006
临界阳性质控品 29.67 3.044e+003
阴性质控品 N/A -
1 26.08 3.700e+004
2 25.45 5.732e+004
3 34.64 0.959e+002
4 22.47 4.566e+005
5 N/A -
6 N/A -
7 N/A
8 26.04 3.802e+004
扩增曲线均呈光滑″S″型，标准曲线为一条直线，Ct值在14-28之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.31。检测下限可精确到5.000e+002，由此可见，该试剂盒具有高灵敏度。
本发明提供一种BK病毒定性定量检测的引物和探针，本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，其试剂盒能够精确定量，并能够快速检测BK病毒。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan荧光探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性和降低交叉污染的可能性。另外，本发明实施例不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间，整个检测过程共仅需2～3小时。在实时TaqMan荧光定量PCR中，PCR产物累积的每个循环都被实时监控和分析，分析达到荧光阈值的循环数(Ct值)就可以直接报告出DNA起始拷贝数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测BK病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针，其中，
所述用于检测BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测BK病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2.一种用于检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
所述工作标准品1为1×107拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段；
所述工作标准品2为1×106拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段；
所述工作标准品3为1×105拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段；
所述工作标准品4为1×104拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为1.0×106拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。
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