CN101928784A - 仙台病毒实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为：5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，反向引物的序列为：5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；所述荧光探针的序列为：5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。

Description

仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒检测方法，具体的地说是一种仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

仙台病毒(Sendai virus)属RNA病毒中的副黏液病毒科第一型，可在小鼠、大鼠、豚鼠等多种啮齿类实验室动物中导致自然感染甚至死亡，小鼠仙台病毒很难控制，常呈隐性感染，急性型多见于20日龄左右乳鼠，表现呼吸道症状。仙台病毒感染可对实验研究产生严重干扰，如改变体液和细胞介导的免疫应答，可改变被感染的肿瘤细胞的表面抗原及其致癌性。

目前，检测各种病毒的方法很多，如血清学试验、组织块培养和共培技术、核酸杂交和常规PCR检测技术等，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且实验时间也相对较长。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效方法。实时荧光定量PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法的检测灵敏度可达到1.0×10⁴个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。

按照本发明提供的技术方案，所述仙台病毒实时荧光定量PCR方法包括步骤如下：

1、标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得仙台病毒的保守基因，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子；

2、特异性引物及荧光探针的设计：以步骤1中选取的高度保守序列为基准，设计一对特异性引物及一条荧光探针；设计原则为：每条引物的长度为18-25个碱基，荧光探针长度为20～30个碱基；特异性引物和荧光探针中GC含量要求在40-60％，理论Tm＞50℃；特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的3’端避免碱基配对；选用的特异性引物和荧光探针要设计在仙台病毒基因中的保守区，只对仙台病毒特异，和其他物种无交叉反应；荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域；

所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列为：5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，

反向引物的序列为：5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；

所述荧光探针的序列为：5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’；

3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤：

(1)模板的制备：

将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.98×10⁹拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；

(2)实时荧光定量PCR反应体系：

25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循环反应：

根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，C_T值为y轴的标准曲线；

4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备，包括步骤：

(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA；

(2)采用Invitrogen公司提供的SuperScriptTM Preamplification System forFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒做反转录，制备cDNA；

5、有效性验证及结果检测判定：

(1)利用未感染仙台病毒小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染仙台病毒小鼠的cDNA，1μl；

利用感染仙台病毒小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染仙台病毒小鼠的cDNA，1μl；

(2)循环反应：

按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(3)有效性验证：

荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无C_T值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其C_T值应＜30，否则重做。

本发明采用实时定量荧光PCR进行仙台病毒的特异性检测，具有以下优点：

(1)、特异性好：由于TagMan荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别，具有很高的准确性，同时，靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低。

(2)、灵敏度高：荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术，因此TagMan检测的灵敏度很高。

(3)、线性关系好：由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。

(4)、操作简单，自动化程度高、防污染；使用TagMan荧光探针定量扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。同时扩增和检测一步完成，操作简单，易于实现自动化。

附图说明

图1为仙台病毒的检测标准曲线。

图2为仙台病毒PCR电泳图谱。

具体实施方式

一、实验材料：

1、阳性样本：取自感染仙台病毒小鼠(来自无锡市血防所动物实验室)的血液。

2、实验试剂：裂解液Trizol(购于美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶及引物(购于美国Promega公司)，液氮、氯仿、异丙醇、75％乙醇、DEPC处理水、dNTPs、DL2000 Marker(均购自美国Sigma公司)。

实验仪器：

离心机(CT15RT，上海天美电化仪器设备工程有限公司)、实时荧光定量PCR仪(FQD-48A，杭州博日科技有限公司)、普通PCR仪(TC-96/G/H(b)A杭州博日科技有限公司)、紫外分光光度仪(ND-1000，美国Thermo FisherScientific公司)、扫描仪(YLN-26、北京市朝阳区京南机电综合服务部)、数码照相机(索尼WX1)、冰箱(MDF-382E(N)，三洋电机国贸公司)。

二、实验方法：

1、标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得仙台病毒的保守基因，该保守基因序列的NC号为001552.1，基因片段从5275～5619；利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的质粒为PUC57(由金斯瑞公司提供)，由金斯瑞公司提供合成。

2、特异性引物及荧光探针的设计：以步骤1中选取的高度保守序列为基准，按照发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)的特异性引物及一条荧光探针：其中，

正向引物的序列(SEQ ID NO.1)为：

5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，

反向引物的序列(SEQ ID NO.2)为：

5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；

荧光探针的序列(SEQ ID NO.3)为：

5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’；

3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线：

(1)模板的制备：

将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.98×10⁹拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；

(2)实时荧光定量PCR反应体系：

25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循环反应：

根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，C_T值为y轴的标准曲线(如图1所示)；

对图1所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上，表明当基因拷贝数在1.0×10⁸-1.0×10⁴范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线性关系；回归分析显示，R²＝0.9935；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性能良好。

4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备：

(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA；具体步骤为：

(a)、抽取感染仙台病毒小鼠的血液，在1.5ml的微量离心管中加入抽取的血液500μl，然后加入Trizol裂解液500μl，充分混匀，室温放置10min；

(b)、向上述室温放置10min后的微量离心管中加入200μl的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置10min；然后4℃，13000r/min离心15min；

(c)、吸取上述离心后的上层水相加入到另一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min后，4℃，13000r/min离心15min；

(d)、小心弃去上清液，再加入1ml75％乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min；

(d)、弃去上清液，按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下10000r/min离心5分钟。

(e)、小心弃去上清液，然后将分离下来的RNA置于超净台中干燥5min；

(注意：干燥后的RNA溶于DEPC处理水中，即可进行反转录操作，若要保存备用，可在步骤(e)后直接加入乙醇并冻存于-70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在-20℃保存1个月左右)。

(2)cDNA的制备：

采用Invitrogen公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒做反转录，具体步骤为：

(a)、在0.5ml微量离心管中，加入步骤(1)中提取的干燥后的RNA 1-5μg，补充适量的DEPC水使总体积达11μl；向微量离心管中加入10μM Oligo(dT)15μl，轻轻混匀、离心；

(b)、将微量离心管70℃加热10min后立即插入冰浴中至少1min；然后加入下列混合试剂，混合试剂的成分为：10×PCR buffer，2μl；25mM MgCl₂，2μl；10mM each dNTPmix，1μl；0.1M DTT，2μl；然后轻轻混匀，4℃下12000r/min离心1min；然后转入42℃水浴中下孵育2-5min；

(c)、加入反转录酶200U1μl，在42℃水浴中继续孵育50min；

(d)、将微量离心管70℃加热15min，终止反应；

(e)、将微量离心管插入冰中，加入RNase H 1μl，在37℃下孵育20min，降解残留的RNA，反转录的最终体系为35μl，最后补足DEPC水165μl，得最终cDNA为200μl，置于-20℃保存备用。

5、有效性验证及结果检测判定

(1)利用未感染仙台病毒小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染仙台病毒小鼠的cDNA，1μl；

利用步骤4中制备的感染仙台病毒小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染仙台病毒小鼠的cDNA，1μl；

(2)循环反应：

按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(3)有效性验证：

荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点(如图1所示)；阴性对照在本检测试验中无C_T值并且无扩增曲线，表明该反应体系中无仙台病毒；图中的阳性对照点位于标准曲线上，并且其C_T值＜30，实验有效，可见，本发明的检测方法能够准确有效地检测出仙台病毒。

三、常规PCR检测：

(1)以DL2000 Marker作为参照，采用步骤1中构建的标准质粒作为模板，以未感染仙台病毒小鼠的cDNA作为样本cDNA，进行PCR电泳检测，分为参照组、阴性对照组、阳性对照组和样本组a、b、c、d、e，各组的反应体系成分如表1所示：

表1：常规PCR电泳检测中的各组的反应体系成分

其中，8.25μl的混合液由2.5μl的10×PCR buffer，0.5μl的10mM dNTPs，0.25μl的1.25U Tag DNA聚合酶，2.5μl的300nM PrimerF和2.5μl的300nMPrimerR组成。

(2)常规PCR反应：反应循环程序及参数为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环后反应结束，得到反应产物；

(3)将上述反应产物进行常规凝胶电泳检测(120V 40min)，检测结果如图2所示(泳道M：参照组DL2000 Marker，泳道1：阴性对照组，泳道2：阳性对照组，泳道3：样品组a，泳道4：样品组b，泳道5：样品组c，泳道6：样品组d，泳道7：样品组e)，由图可见，泳道1并未出现条带，说明本实验方法的非特异性较好。

本发明采用的实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间，简化了实验操作。而且荧光检测的结果由电脑分析读数，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。同时，本发明中采用的阳性对照是根据仙台病毒的保守基因序列设计构建的标准质粒分子，相对于以往采用灭活病毒液作为阳性品的检测，更增加了安全性，标准质粒分子还可以大量进行复制，使得阳性标准品的来源更加稳定和可靠，避免了阳性病毒株在每次试验中的使用。

序列表

<110>无锡奥瑞生物医药科技有限公司

 

<120>仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法

 

<160>3

 

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’

Claims (3)

1.仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定，其特征在于，所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列为：5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，

反向引物的序列为：5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；

所述荧光探针的序列为：5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’。

2.如权利要求1所述的仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为：

(1)将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.98×10⁹拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；

(2)实时荧光定量PCR反应体系：

25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循环反应：

根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，C_T值为y轴的标准曲线。

3.如权利要求1所述的仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述有效性验证及结果检测判定的步骤为：

(1)利用未感染仙台病毒小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染仙台病毒小鼠的cDNA，1μl；

利用感染仙台病毒小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染仙台病毒小鼠的cDNA，1μl；

(2)循环反应：

按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(3)有效性验证：

荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无C_T值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其C_T值应＜30，否则重做。

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