CN106350609B - 一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂、检测方法及应用 - Google Patents
一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂、检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的水泡性口炎病毒检测的试剂，包括用于水泡性口炎病毒重组酶聚合酶扩增检测的第一套引物探针组合和第二套引物探针组合；第一套引物探针组合的正向引物、反向引物和探针依序为Seq ID No.1‑3所示序列；第二套引物探针组合的正向引物、反向引物和探针依序为Seq ID No.4‑6所示序列。本申请用于水泡性口炎病毒检测的试剂，分别针对两个亚型设计了两套引物探针组合，为水泡性口炎病毒检测提供了一种新检测方案和途径。基于本申请试剂的水泡性口炎病毒RPA检测方法，快速而准确，对硬件要求低，适用于现场快速检测，特别适合检验检疫等部门使用。
Description
技术领域
本申请涉及水泡性口炎病毒检测领域，特别是涉及一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂及其应用，以及基于该试剂的水泡性口炎病毒的检测方法。
背景技术
水泡性口炎(Vesicularstomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus,VSV)引起的一类重要的人畜共患传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告传染病，在我国进境动物检疫疫病名录中列为二类传染病。VSV在分类上属于弹状病毒科、水泡病毒属，为单股负链RNA病毒，有两个独立的血清型：印第安纳型(Indiana,VSV-IND)和新泽西型(New Jersey,VSV-NJ)。马、牛和猪是易感动物，绵羊、山羊和其它野生动物也可被感染。相关的易感物种染病后临床症状与口蹄疫、猪水疱性皮疹以及猪水泡病很难区分，以动物唇、蹄冠部和乳房等部位出现小囊泡、溃疡和结痂等为主要特征，导致动物食欲减退及继发性乳腺炎从而降低动物的生产能力，给疫区畜牧业带来严重的经济损失。人类也可感染该病毒，引发类似流感样症状。VS仅在美洲流行，十九世纪末二十世纪初法国和南非曾有该病的报道。随着我国进口动物及动物产品贸易量的不断增长，VS传入我国的风险不容忽视，一旦传入将会给我国的养殖业造成巨大损失，因此建立快速高效的鉴别检测方法对防止该病传入具有重要的现实意义。
病毒核酸检测是病原鉴定最常用的方法之一，现已建立的VS检测方法有常规RT-PCR法和实时荧光RT-PCR法，虽然实时荧光RT-PCR法相对于常规RT-PCR法更为快速，但检测时间至少也需要七十分钟。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，缩写RPA)，是一项由多种酶和蛋白参与，在等温条件下进行核酸扩增的新技术，其原理是在恒温下，重组酶与引物结合形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，循环进行从而实现DNA的指数增长，最佳反应温度范围是37℃至42℃。体系中增加反转录酶，可以对RNA模板进行一步法扩增。结合一个便携式的常温等温扩增荧光检测仪可在15～20分钟内完成检测，极大地缩短了检测时间，简化了反应程序。目前尚没有水泡性口炎病毒检测的相关RPA技术研究和报道。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂，基于该试剂的水泡性口炎病毒的检测方法，及其应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂，该试剂包括用于水泡性口炎病毒重组酶聚合酶扩增检测的第一套引物探针组合和第二套引物探针组合；第一套引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.1所示序列，反向引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；第二套引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.4所示序列，反向引物为Seq ID No.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-TTGATGATGCATGATCCTGCTCTTCGTCAATCATT-3’
Seq ID No.2：5’-AATGAGAGACTTTCTGTTACGGGATCTGGGAAGGC-3’
Seq ID No.3：
5’-CTTGCACAGTTCTACTTTCAAATACGCCATGTTGTATTTGGACCCTT-3’
Seq ID No.4：5’-CTCTGAGCCTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGT-3’
Seq ID No.5：5’-TTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCTATCAGA-3’
Seq ID No.6：
5’-TCCAATTGCCAAATTCAGGATAGAGCATATCAATAAGTTATTAGAG-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的第一套引物探针组合的探针中，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第31个碱基替换为dSpacer，第32个碱基修饰BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer；SeqID No.6所示序列的第二套引物探针组合的探针中，第28个碱基修饰HEX-dT，第29个碱基替换为dSpacer，第30个碱基修饰BHQ2-dT，3’末端修饰C3Spacer。
需要说明的是，重组酶聚合酶扩增(缩写RPA)是2006年由英国公司TwistDx Inc研发的一种新型的核酸恒温扩增技术。RPA检测的关键在于扩增引物和探针的设计。而就目前来说，常规PCR引物及其设计方案是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。并且，不同于常规PCR引物的设计，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。目前，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，也没有任何引物或探针设计软件可以使用，科研人员需要进行反复的试验和研究分析、优化，以获得适合的引物和探针。
还需要说明的是，本申请的用于水泡性口炎病毒检测的试剂，实际上就是两套RPA检测引物探针组合，本申请的两套引物探针组合分别对水泡性口炎病毒的印第安纳型(Indiana,VSV-IND)和新泽西型(New Jersey,VSV-NJ)进行特异性检测，具体的，第一套引物探针组合用于特异性的检测VSV-IND，第二套引物探针组合用于特异性的检测VSV-NJ，两套引物探针组合需要配合使用才能够对两个型进行完整的检测。可以理解，如果在可以确定水泡性口炎病毒为其中一个型的情况下，也可以独立的使用其对应的一套引物探针组合。
本申请的另一面公开了本申请的试剂在制备水泡性口炎病毒检测试剂盒或设备中的应用。
本申请的另一面公开了一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。
本申请的再一面公开了一种水泡性口炎病毒的检测方法，包括采用本申请的试剂，对待测样品进行重组酶聚合酶扩增检测，重组酶聚合酶扩增检测的温度和条件为40℃反应20分钟，并采用荧光检测仪收集荧光。
需要说明的是，本申请的一种实现方式中，具体采用了探针荧光法进行RPA检测，可以理解，其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等，也可以用于对RPA扩增产物进行检测，可以根据不同的使用需求或者条件进行选择。
本申请的有益效果在于：
本申请的用于水泡性口炎病毒检测的试剂，分别针对印第安纳型和新泽西型两个亚型设计了特异性检测引物探针组合，为水泡性口炎病毒的检测提供了一种新的检测方案和途径。并且，基于本申请试剂的水泡性口炎病毒RPA检测方法，快速而准确，对硬件设备要求低，适用于现场快速检测，特别适合检验检疫等部门使用，为保障生产安全，控制水泡性口炎病毒传播提供了有力的科学工具。
附图说明
图1是本申请实施例中VSV-IND亚型特异性检测的结果图；
图2是本申请实施例中VSV-NJ亚型特异性检测的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
一、材料与方法
1.供试核酸
本例实验用模板包括VSV-IND核酸、VSV-NJ核酸，以及其它病原：口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪水泡病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒。本例采用的核酸和病毒均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。
2.病毒核酸提取
本例采用Thermo病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit(AM1836)于全自动磁珠提取纯化系统Thermo Scientific KingFisher Flex上自动抽提病毒核酸，具体操作方法按照核酸抽提试剂盒和全自动磁珠提取纯化系统说明书进行。
3.检测试剂
本例采用的RPA检测试剂盒TwistAmp exo RT kit购自英国剑桥TwistDx公司。其它化学试剂均为分析纯。
4.引物和探针的设计和筛选
本例根据水泡性口炎病毒两种血清型编码病毒RNA聚合酶的L基因序列，分别设计了用于VSV-IND和VSV-NJ两个亚型的多条引物和探针。设计好引物和探针后，通过BLAST比较确定其特异性，然后再用于后续试验。用于VSV-IND的引物和探针具体序列如表1所示，用于VSV-NJ的引物和探针具体序列如表2所示。本例所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成与修饰。
表1用于VSV-IND的引物和探针序列
表2用于VSV-NJ的引物和探针序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | Seq ID No. |
| KY-RPA(L)P2 | CTtTTTATGCATGACCCaGCAATAAGACAATCTCTGTATACaGTCCAGG | 23 |
| KY-NJ-P1007 | TCCAATTGCCAAATTCAGGATAGAGCATATCAATAAGTTATTAGAG | 6 |
| KY-NJ-F01 | ATTTATTTATGAACATGCCTCTGAGCCTCATCTC | 24 |
| KY-NJ-F02 | CTCTGAGCCTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGT | 4 |
| KY-NJ-F03 | CTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGTTTGGGGAT | 25 |
| KY-NJ-R01 | GATGATTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCT | 26 |
| KY-NJ-R02 | TTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCTATCAGA | 5 |
| KY-NJ-R03 | TGATGATTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCT | 27 |
| KY-RPA(L)F2 | CCATGATACAGTACAATTATTTTGGGACATTTGCT | 13 |
| KY-RPA(L)F3 | ATGATTCAGTATAATTATTTTGGGACCTTTGCT | 28 |
| KY-RPA(L)F4 | AATGATTCAGTATAATTATTTTGGGACCTTTGCTC | 29 |
| KY-RPA(L)R2 | AATGAAAGGCTCTCTGTTACTGGATCTGGGAATGC | 30 |
| KY-RPA(L)R3 | AATGARAGRCTYTCTGTTACKGGATCTGGGAAKGC | 21 |
| KY-RPA(L)R5 | AAACATTACAGCTATCTTTTTGAGATGAGGCTC | 31 |
表1中，Seq ID No.3所示序列的KY-IN-P探针中，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第31个碱基替换为dSpacer，第32个碱基修饰BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer；Seq ID No.7所示序列的KY-RPA(L)P1探针中，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第31个碱基替换为dSpacer，第33个碱基修饰BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer。表2中，Seq ID No.6所示序列的KY-NJ-P1007探针中，第28个碱基修饰HEX-dT，第29个碱基替换为dSpacer，第30个碱基修饰BHQ2-dT，3’末端修饰C3Spacer；Seq ID No.23所示序列的KY-RPA(L)P2探针中，第31个碱基修饰HEX-dT，第33个碱基替换为dSpacer，第35个碱基修饰BHQ2-dT，3’末端修饰C3Spacer。
5.反应体系和条件
本例采用TwistAmp exoRT Kit试剂盒进行RPA扩增。
反应体系为50μL，包括：Rehydration Buffer 29.5μL，浓度10μM的正向引物和反向引物各2.1μL、浓度10μM的探针0.6μL，模板RNA和ddH2O总用量13.2μL，混匀后，加入280mM的醋酸镁溶液2.5μL，混匀。
反应条件：将装有上述反应体系的反应管置于荧光检测仪(Twista)中，40℃反应20分钟，连续收集荧光并读取结果。
6.引物和探针筛选
本例分别对VSV-IND和VSV-NJ两个亚型的引物和探针进行筛选，以获得分别对两个亚型进行特异性检测的第一套引物探针组合和第二套引物探针组合。在筛选的过程中，由于引物的数量比较多，本例先采用其中一条正向引物，对反向引物进行筛选，然后再根据筛选出来的反向引物，再去筛选正向引物和探针。引物和探针筛选采用“5.反应体系和条件”。
7.特异性试验
采用筛选的引物对和探针组合，按“5.反应体系和条件”，对VSV-IND核酸、VSV-NJ核酸、口蹄疫病毒核酸、蓝舌病病毒核酸、牛病毒性腹泻病毒核酸、猪水泡病病毒核酸、猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪轮状病毒核酸等9种核酸模板进行检测。并设置一个空白水对照。
8.灵敏度试验
本例分别将VSV-IND核酸和VSV-NJ核酸，按10倍梯度稀释至10-6，采用各梯度浓度的稀释核酸进行RPA试验，以测试两套引物探针组合的灵敏度，试验中设置一个水空白对照。同时，以各梯度浓度的稀释核酸为模板，采用OIE中水泡性口炎参考文献(Hole et al.,2010)所建立的实时荧光RT-PCR法，进行对比试验，比较本例的引物探针组合的灵敏度与实时荧光RT-PCR法的灵敏度。
二、结果及分析
1.引物和探针筛选
经过筛选，本例最终获得了一套用于VSV-IND检测的特异性引物探针组合，和一套用于VSV-NJ检测的特异性引物探针组合。具体的，Seq ID No.1所示序列的正向引物KY-IN-F02、Seq ID No.2所示序列的反向引物KY-RPA(L)R1和Seq ID No.3所示序列的探针KY-IN-P组成第一套引物探针组合，用于对VSV-IND进行特异性检测。Seq ID No.4所示序列的正向引物KY-NJ-F02、Seq ID No.5所示序列的反向引物KY-NJ-R02和Seq ID No.6所示序列的探针KY-NJ-P1007组成第二套引物探针组合，用于对VSV-NJ进行特异性检测。
3.特异性检测结果
本例分别采用了两套特异性引物探针组合对各供试核酸进行RPA检测，特异性检测结果如图1和图2所示。图1为第一套特异性引物探针组合对VSV-IND的特异性检测结果图，图中1为VSV-IND核酸样品的荧光曲线，可见，仅VSV-IND样品有荧光曲线，而其它样品和水空白对照都没有荧光曲线，本例的第一套引物探针组合能够特异性的对VSV-IND进行扩增检测，对VSV-NJ和其它病毒核酸都不会有扩增。图2为第二套特异性引物探针组合对VSV-NJ的特异性检测结果图，图中1为VSV-NJ核酸样品的荧光曲线，可见，仅VSV-NJ样品有荧光曲线，而其它样品和水空白对照都没有荧光曲线，本例的第二套引物探针组合能够特异性的对VSV-NJ进行扩增检测，对VSV-IND和其它病毒核酸都不会有扩增。可见，本例的两套引物探针组合都具有良好的特异性。
4.灵敏度试验结果
试验结果显示，本例的两套引物探针组合的RPA最低可以检测到10-5梯度稀释的模板，与作为对比的OIE中所建立的实时荧光RT-PCR法一致。可见，本申请的RPA检测方法和现有的实时荧光RT-PCR具有相当的检测灵敏度；并且，本申请的检测方法在20min内可判读检测结果，检测周期仅为实时荧光RT-PCR方法的1/4至1/3，大大缩短了检测时间，提升了检测效率。
实施例二
采用实施例一筛选出的引物和探针，对67份临床样品进行检测，并分别以实施例一中所抽提的VSV-IND核酸、VSV-NJ核酸为阳性对照；同时参照OIE中水泡性口炎参考文献(Hole et al.,2010)所建立的实时荧光RT-PCR法进行平行检测。本例采用的67份临床样品由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保存。
检测结果显示，RPA与实时荧光RT-PCR法检测结果完全一致，仅阳性对照出现典型的扩增曲线，其它67份样品均无扩增曲线出现。结果表明本申请设计的两套引物探针具有很好的特异性，RPA检测操作简便，反应时间短，可快速准确鉴别出VSV-IND核酸和VSV-NJ核酸。需要说明的是，我国尚未有检出VS，因此，67份临床样品都是具有类似临床症状的样品。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
<120> 一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂、检测方法及应用
<130> 16I23378
<160> 31
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgatgatgc atgatcctgc tcttcgtcaa tcatt 35
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aatgagagac tttctgttac gggatctggg aaggc 35
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aaacattaca gctatctttt tgagatgagg ctc 33
Claims (4)
1.一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于水泡性口炎病毒重组酶聚合酶扩增检测的第一套引物探针组合和第二套引物探针组合；
所述第一套引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.1所示序列，反向引物为Seq IDNo.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；
所述第二套引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.4所示序列，反向引物为Seq IDNo.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-TTGATGATGCATGATCCTGCTCTTCGTCAATCATT-3’
Seq ID No.2：5’-AATGAGAGACTTTCTGTTACGGGATCTGGGAAGGC-3’
Seq ID No.3：
5’-CTTGCACAGTTCTACTTTCAAATACGCCATGTTGTATTTGGACCCTT-3’
Seq ID No.4：5’-CTCTGAGCCTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGT-3’
Seq ID No.5：5’-TTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCTATCAGA-3’
Seq ID No.6：
5’-TCCAATTGCCAAATTCAGGATAGAGCATATCAATAAGTTATTAGAG-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的第一套引物探针组合的探针中，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第31个碱基替换为dSpacer，第32个碱基修饰BHQ1-dT，3’末端修饰C3 Spacer；Seq IDNo.6所示序列的第二套引物探针组合的探针中，第28个碱基修饰HEX-dT，第29个碱基替换为dSpacer，第30个碱基修饰BHQ2-dT，3’末端修饰C3 Spacer。
2.根据权利要求1所述的试剂在制备水泡性口炎病毒检测试剂盒中的应用。
3.一种用于水泡性口炎病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的试剂。
4.一种非诊断治疗目的的水泡性口炎病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的试剂，对待测样品进行重组酶聚合酶扩增检测，所述重组酶聚合酶扩增检测的温度和条件为40℃反应20分钟，并采用荧光检测仪收集荧光。
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