CN108753933B - 一种基于金属钌配合物的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于金属钌配合物的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。本发明建立了以金属钌配合物做为荧光染料进行实时荧光定量PCR的检测方法，结果显示，金属钌配合物做为荧光染料可在一个较宽浓度范围内使用，并可生成熔解曲线进行特异性扩增验证以及多重PCR检测，同时具有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优点，可进行大面积推广及应用。

Description

一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种PCR检测方法及其应用，特别涉及将金属钌配合物应用于核酸扩增检测体系中，如用于实时荧光定量PCR(qPCR)的检测方法。
背景技术
核酸扩增检测对环境检测以及食品质量与安全等领域具有十分重要的意义。聚合酶链式反应(PCR)通过体外扩增产生大量特定核酸序列，已经广泛应用于分子生物学检测中。传统聚合酶链式反应常需要电泳来进行扩增产物验证，费时费力，无法定量起始模板浓度，且容易造成扩增子污染。为克服电泳法终点检测的缺点，开发了实时荧光定量PCR技术，每轮PCR循环产生相应的荧光信号，再通过分析已知标准品的循环阈值获得标准曲线，可对未知样品中核酸浓度实现精确计算。
实时荧光定量PCR主要分为DNA结合染料法和探针法，探针法具有较强的特异性，不需PCR后处理，但需要根据特定序列合成探针，成本相对较高；荧光DNA结合染料在溶液中几乎不发荧光，当结合到DNA上时发强荧光，并与PCR产生的DNA总量成正比。DNA结合染料以一种非序列特异性结合到DNA双链上，因此不需要根据特定序列合成探针，成本相对较低，但是非特异性扩增产物同样也会产生荧光信号，需要通过测量扩增产物的熔解曲线鉴别PCR扩增产物的特异性。
目前在实时荧光定量PCR中常用的较成熟的染料如SYBR Green I和Eva Green是成本较高的进口商品化试剂。且应用最广泛的SYBR Green I在扩增的过程中存在对反应产生较大的抑制以及信噪比较低等问题，在应用中还发现SYBR Green I在高温以及光源激发时存在稳定性较差的现象。所以，有必要开发经济环保、光稳定性好、实用性强的新型荧光染料应用于核酸检测和便携试剂盒中。
有报道将金属钌配合物核酸分子“光开关”，例如钌多吡啶配合物([Ru(phen)2(dppz)]2+、[Ru(bpy)2(dppz)]2+，dppz＝dipyrido[3,2-a:2’,3’-c]phenazine,bpy＝2,2’-bipyridine,phen＝1,10-phenanthroline)应用于核酸检测，并且也具有一些优于其它有机结合染料的性质，例如荧光背景低、水溶性强、斯托克斯(stokes)位移大等优点(详见参考文献：J.Am.Chem.Soc.1990,112,4960；Microchemical Journal 1999,63,356；Microchimica Acta 2000,134,57；Analytica Chimica Acta 2000,403,209；AnalyticaChimica Acta 2001,436,207；Dalton Transactions 2016,45,13261)。还有研究表明，钌金属配合物可以用于凝胶电泳分析PCR扩增产物的荧光染料(Method Enzymol.1993,226,576)。但是，在实时PCR分析领域目前尚未见到其应用的研究和报道，原因包括：1)目前金属钌配合物的研究主要集中在生物无机化学领域，而PCR反应体系具有自身特点，进行实时PCR扩增研究还需要有分子生物学的背景，属于交叉学科研究领域；2)由于金属钌配合物特殊的荧光性质，并不是市面上所有的实时PCR仪都能够高灵敏的检测出它们的荧光信号，硬件上的要求在一定程度上限制了研究人员在PCR分析领域对金属钌配合物的应用展开研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的一个目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分；以拷贝数不同的多个核酸样品作为标准品，将各标准品分别作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序分别进行实时荧光定量PCR，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线；以未知拷贝数的核酸样品作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序进行实时荧光定量PCR，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的DNA拷贝数。
优选的，所述金属钌配合物在实时荧光定量PCR反应体系中的终浓度为0.5-10μM。所述反应体系的终体积为10-20μL。
优选的，所述金属钌配合物选自[Ru(phen)2(dppz)]2+、[Ru(bpy)2(dppz)]2+等钌多吡啶配合物中的一种。为了增强qPCR分析性能，或选自对钌多吡啶配合物的phen、bpy、dppz等配体进行进一步结构修饰获得的其它具有核酸分子光开关行为的金属钌配合物中的一种。
优选的，所述实时荧光定量PCR的延伸阶段利用一定的荧光通道采集信号，荧光通道的荧光激发波长和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。
优选的，若核酸样品为RNA，则扩增前将提取的RNA反转录为DNA。
优选的，所述实时荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：
1)设计引物
根据检测目的及样品的不同选取靶序列并设计引物；
2)配制反应体系
将热稳定DNA聚合酶、引物、dNTP、反应缓冲液、模板DNA以及上述金属钌配合物等加入PCR反应管中，加水补齐至终体积；
3)实时荧光定量PCR
根据靶序列及引物的不同，确定扩增程序；以已知初始浓度的DNA样品为模板，对模板进行预变性后按扩增程序循环反应并在循环反应的延伸步骤进行信号收集，荧光信号的收集通道为：激发波长400-500nm，发射波长550-750nm；循环反应结束后再次进行延伸；然后根据收集的信号建立扩增曲线，由扩增曲线确定该DNA样品的循环阈值；
4)重复步骤3)，得到不同初始浓度的DNA样品各自的循环阈值，结合对应DNA样品的浓度建立标准曲线；
5)按照步骤3)对未知初始浓度的DNA样品进行扩增，获得相应的循环阈值并带入步骤4)获得的标准曲线中，从而计算得到该DNA样品的初始浓度。
优选的，所述扩增程序为：对经过预变性的模板加热变性，然后使引物与热变性得到的单链模板复性，然后在DNA聚合酶的作用下延伸。
优选的，所述未知初始浓度的DNA样品利用试剂盒法提取并纯化得到。
本发明的另一个目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述金属钌配合物、热稳定DNA聚合酶、4种核苷酸(dNTP)以及金属离子混合物。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过将金属钌配合物与实时荧光定量PCR技术相结合，利用金属钌配合物作为荧光染料与核酸(例如，dsDNA)结合时荧光强度大幅度上升的特点，实现对核酸进行实时扩增并定量检测。本发明采用作为核酸分子光开关的金属钌配合物为荧光染料，具有容易合成、结构稳定、水溶性好等优点，广泛适用于各类样品的核酸定量中。因此可以代替现有商品化有机染料，并作为一种应用于实时荧光定量PCR检测的新型、有开发前景的DNA结合染料，对研发核酸检测试剂具有重要意义。
附图说明
图1A为金属钌配合物在95℃孵育时荧光信号的稳定性；其中Ru-bpy代表[Ru(bpy)2(dppz)]2+，Ru-phen代表[Ru(phen)2(dppz)]2+。
图1B为[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为荧光染料时对PCR扩增反应的抑制性电泳图；其中：+代表实验组，-代表空白组
图1C为以[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的扩增曲线图。
图1D为以[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的熔解曲线图。
图1E为以[Ru(phen)2(dppz)]2+作为染料的扩增曲线图。
图1F为以[Ru(phen)2(dppz)]2+作为染料的熔解曲线图。
图2A为以[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的模板浓度梯度扩增曲线图。
图2B为以[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的模板浓度梯度熔解曲线图。
图2C为以[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的金黄色葡萄球菌模板的量与Ct值线性拟合示意图。
图3A为以[Ru(phen)2(dppz)]2+作为染料的模板浓度梯度扩增曲线图。
图3B为以[Ru(phen)2(dppz)]2+作为染料的模板浓度梯度熔解曲线图。
图3C为以[Ru(phen)2(dppz)]2+作为染料的金黄色葡萄球菌模板的量与Ct值线性拟合示意图。
图4A为以[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌实时荧光双重PCR检测扩增曲线图。
图4B为以[Ru(phen)2(dppz)]2+作为染料的金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌实时荧光双重PCR检测熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明的限定。
(一)金属钌配合物用于实时荧光定量PCR中荧光染料的可行性
采用金黄色葡萄球菌fem基因保守序列为扩增的靶序列，在2017年8月完成扩增引物的设计，扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化，具体序列如下：
前引物(5’-3’)：TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT；
后引物(5’-3’)：TTTTCATAATCRATCACTGGAC。
1、金属钌配合物在高温孵育时荧光信号的稳定性
将金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+、[Ru(phen)2(dppz)]2+分别在pH8.0的Tirs缓冲溶液中于95℃高温孵育，隔一定时间(例如0.5h)进行荧光强度信号的检测，结果如图1A所示，在3小时内荧光信号只存在小范围内的波动，并无明显下降，说明金属钌配合物可在PCR碱性扩增条件以及高温变性步骤中保持荧光强度稳定。
2、实时荧光定量PCR扩增
1)菌的培养扩增与DNA的提取：利用LB培养基进行增菌处理后用试剂盒进行基因组DNA的提取。
2)qPCR反应体系的建立：反应体系为10μL；其中上步提取的DNA模板1μL(200ng/μL)，2×Taq PCR Mastermix 5μL，前、后引物各1μL(4μM)，20μM金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+1.5μL，不足以超纯水补齐，以NTC无模板对照。
3)qPCR采用三步法PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，共30个循环；68℃再延伸5min。熔解曲线60-95℃，0.5℃测量一次，增温速率5℃/s。
4)实验结果：
使用提取的DNA作为模板，加入特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增实验，可得到如图1C所示扩增曲线以及图1D所示扩增序列的特征熔链峰，并对产物进行电泳验证，证明该金属钌配合物作为荧光染料应用于实时荧光定量PCR中的可行性。
用相同方法对另一金属钌配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+进行实时荧光定量PCR扩增，可获得如图1E、图1F所示扩增曲线、熔解曲线，具有与[Ru(bpy)2(dppz)]2+相同效果。
3、染料浓度对PCR反应的抑制效应
在PCR反应体系中加入不同终浓度(2、3、4、5、6μM)的金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+扩增后进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，以NTC无模板对照，结果如图1B所示，实验组(+，扩增靶序列)在所有浓度下均有扩增产物条带，表明金属钌配合物在一定浓度范围(1-10μM)内对PCR扩增几乎没有抑制作用，可适用于实时荧光定量PCR中，而超出这个范围则会发生明显的抑制。从空白组(-，无模板对照)可以看出，目的扩增片段均未出现，表明未发生交叉污染。典型反应体系体积为10-20μL。
(二)金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+进行实时荧光定量PCR检测的线性范围和灵敏度的分析
1)菌培养、模板DNA提取同(一)。
2)引物合成同(一)。
3)将模板DNA原液(1×107copies/μL)以10倍梯度稀释成1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。
4)qPCR反应体系同(一)。
5)qPCR反应程序同(一)。
6)实验结果：
结果如图2A、图2B及图2C所示，不同稀释度的DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增实验时可以检测出1×102copies/μL模板浓度，表明检测体系具有较高的检测灵敏度和较宽的动态范围。且线性相关系数R2>0.99，表明实时荧光定量PCR在此浓度范围内线性较好，可以准确的对目的基因进行定量。因此，[Ru(bpy)2(dppz)]2+应用于实时荧光定量PCR的扩增实验具有较好的适用性。
(三)金属钌配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+进行实时荧光定量PCR检测的线性范围和灵敏度的确定
1)菌培养、模板DNA提取同(一)。
2)引物合成同(一)。
3)将模板DNA原液(1×107copies/μL)以10倍梯度稀释成1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。
4)qPCR反应体系同(一)。
5)qPCR反应程序同(一)。
6)实验结果
结果如图3A、图3B及图3C所示，以不同稀释度的DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增实验可以检测出1×102copies/μL模板浓度，表明检测体系具有较高的检测灵敏度和较宽的动态范围。且线性相关系数R2>0.98，表明实时荧光定量PCR在此浓度范围内线性较好，可以准确的对目的基因进行定量。因此，[Ru(phen)2(dppz)]2+应用于实时荧光定量PCR的扩增实验具有较好的适用性。
(四)基于金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的多重实时荧光PCR检测
金黄色葡萄球菌所用的引物同(一)；
利用阪崎肠杆菌Esa16S基因保守序列为扩增的靶序列，在2017年11月完成扩增引物的设计，扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化，具体序列如下：
前引物(5’-3’)：TCCGCAGGAGTTGAAGAGG；
后引物(5’-3’)：CAGCAGCGTGTCTGTTTCA；
1)菌培养以及模板DNA提取同(一)
2)qPCR的反应体系：
无菌操作，同时添加金黄色葡萄球菌与阪崎肠杆菌两组前、后引物，使各引物在反应体系中的最终浓度为0.2μM，2×Taq PCR Mastermix 5μL，20μM金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+或[Ru(phen)2(dppz)]2+1.5μL作为荧光染料，分别设置金黄色葡萄球菌模板(金葡组)、阪崎肠杆菌模板(阪崎肠组)、金黄色葡萄球菌加阪崎肠模板(金葡+阪崎肠组)、NTC无模板对照(空白组)共四组样品。
3)qPCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，68℃延伸30s并采集荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，共30个循环；68℃再延伸5min。熔解曲线60-95℃，每0.1℃测量一次信号，增温速率5℃/s。
4)实验结果：
如图4A及图4B所示，扩增后进行熔解曲线分析后发现：单一金黄色葡萄球菌DNA的熔解曲线峰出现在86℃左右；单一的阪崎肠杆菌DNA扩增产物的熔解曲线峰出现在91℃左右，当同时加入两种菌的模板DNA进行扩增时，其扩增产物在84℃和90℃分别出现一个熔解曲线峰。上述结果表明，本发明所用的荧光染料即金属钌配合物以及基于此染料建立的双重实时荧光PCR检测方法，可准确分析体系中不同DNA序列。金属钌配合物可作为荧光染料应用于多重PCR检测中。
(五)实时荧光定量PCR检测试剂盒的制备
将10×PCR缓冲液1μL、Taq Polymerase(5U/μL)0.125μL，dNTP(2.5mM)2μL，MgCl2(100mM)0.375μL，KCl(1M)1.25μL，Tris-HCl(1M pH8.3)0.25μL以及金属钌配合物染料(100μM)0.75μL共同包装，得到实时荧光定量PCR检测试剂盒。使用时根据实验样品需要加入引物和模板以及ddH2O补足25μL即可。
以上实施例表明：本发明所用金属钌配合物荧光染料，灵敏度高、稳定性佳，可作为一种核酸染料应用于实时荧光定量PCR技术中。
总之，具有独特核酸分子“光开关”性质的金属钌配合物可满足实时PCR扩增检测的要求，通过对其性质以及在实时荧光定量PCR中的应用研究发现其具有以下优势：
1)金属钌配合物在PCR高温及酸碱环境下可保持性质稳定；(2)金属钌配合物与qPCR扩增产物DNA双链结合后，荧光信号显著增强，并在本发明选定的信号通道的激发和发射波长下，可以通过实时监测钌配合物染料的荧光信号变化，获得qPCR扩增曲线；(3)在较宽的浓度范围内，对qPCR扩增反应没有抑制作用，可以使用高浓度的钌配合物，使荧光达到较高的信号强度；(4)qPCR扩增完成后，可以利用实时qPCR仪获得熔解曲线，用于区分特异性和非特异性扩增产物；(5)在优化的实验条件下，检测灵敏度与商品化染料SYBR Green I和EvaGreen相当；(6)通过设计优化引物序列，产生具有明显不同Tm值的PCR产物，可以用熔解曲线分析实现多重实时qPCR分析，以达到节省试剂、样品和提高样品通量的目的。
尽管荧光DNA结合染料很多，但并不是所有荧光染料都适用于实时qPCR，例如EB(溴化乙锭)。适用于实时qPCR的DNA荧光染料，需要满足：(1)与PCR扩增条件兼容(如耐高温、耐pH变化)；(2)不抑制PCR的扩增反应；(3)有足够高的检测灵敏度，可以获得可用于定量的实时扩增曲线。这些条件是否满足，只能通过实验确定，无法通过理论推测。而本发明通过实验发现，金属钌配合物核酸分子“光开关”和PCR扩增实验条件兼容；并且添加在PCR反应溶液中不抑制PCR的扩增反应；有足够高的检测灵敏度，可以获得可用于定量的实时扩增曲线等条件。因此，无机钌金属配合物可以作为一类新型的实时qPCR结合染料，具有SYBRGreen I和Eva Green等有机分子DNA结合染料所不具有的优异性质，具有广阔的应用前景。

Claims (6)

1.一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分；以拷贝数不同的多个核酸样品作为标准品，将各标准品分别作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序分别进行实时荧光定量PCR，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线，线性浓度范围达1×102copies/μL模板浓度；以未知拷贝数的核酸样品作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序进行实时荧光定量PCR，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的DNA拷贝数；
所述金属钌配合物为[Ru(phen)2(dppz)]2+或[Ru(bpy)2(dppz)]2+；
所述金属钌配合物在反应体系中的终浓度为4-10μM；
实时荧光定量PCR采用三步法PCR反应程序，延伸阶段利用一定的通道收集荧光信号：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500 nm和550-750 nm，共30个循环；68℃再延伸5min，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。
2.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述核酸样品为DNA或由提取的RNA反转录而成的DNA。
3.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：
1）设计引物
根据检测目的及样品的不同选取靶序列并设计引物；
2）配制反应体系，反应体系包括热稳定DNA聚合酶、引物、dNTP、模板DNA以及所述金属钌配合物；
3）实时荧光定量PCR
根据靶序列及引物的不同，确定扩增程序；以已知初始浓度的DNA样品为模板，对模板进行预变性后按扩增程序循环反应并在循环反应的延伸步骤进行荧光信号收集，荧光信号的收集通道为：激发波长为400-500 nm，发射波长为550-750 nm；循环反应结束后再次进行延伸；然后根据收集的信号建立扩增曲线，由扩增曲线确定该DNA样品的循环阈值；
4）重复步骤3），得到不同初始浓度的DNA样品各自的循环阈值，结合对应DNA样品的浓度建立标准曲线；
5）按照步骤3）对未知初始浓度的DNA样品进行扩增，获得相应的循环阈值并带入步骤4）获得的标准曲线中，从而计算得到该DNA样品的初始浓度。
4.根据权利要求3所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述未知初始浓度的DNA样品利用试剂盒提取并纯化得到。
5.根据权利要求1或3所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述反应体系的终体积为10-20μL。
6.一种金属钌配合物在实时荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于：以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分，所述金属钌配合物在反应体系中的终浓度为4-10μM；所述金属钌配合物为[Ru(phen)2(dppz)]2+或[Ru(bpy)2(dppz)]2+；
实时荧光定量PCR采用三步法PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500 nm和550-750 nm，共30个循环；68℃再延伸5min。
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