CN101914631A - 小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101914631A CN101914631A CN2010101102682A CN201010110268A CN101914631A CN 101914631 A CN101914631 A CN 101914631A CN 2010101102682 A CN2010101102682 A CN 2010101102682A CN 201010110268 A CN201010110268 A CN 201010110268A CN 101914631 A CN101914631 A CN 101914631A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- fluorescent
- real
- reaction system
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000711466 Murine hepatitis virus Species 0.000 title claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 42
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 10
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 7
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 7
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012306 spectroscopic technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000594182 Sarcophaga sigma Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，反向引物的序列为：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；所述荧光探针的序列为：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒检测方法，具体的地说是一种小鼠肝炎病毒(MHV)实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)可引起小鼠发生肝炎、脑炎和肠炎，一般呈亚临床感染或慢性感染，而机体抵抗力低时可引起急性发病死亡，导致实验失败。MHV可改变各种免疫应答参数，影响酶的活性，从而对实验产生严重的干扰。
目前，检测各种病毒的方法很多，如血清学实验、组织块培养和共培技术、核酸杂交和常规PCR检测技术等，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且实验时间也相对较长。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效方法。实时荧光定量PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法的检测灵敏度可达到1.0×104个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。
按照本发明提供的技术方案，所述小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法包括步骤如下：
1、标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得小鼠肝炎病毒的保守基因，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子；
2、特异性引物及荧光探针的设计：以步骤1中选取的高度保守序列为基准，设计一对特异性引物及一条荧光探针；设计原则为：每条引物的长度为18-25个碱基，荧光探针长度为20-30个碱基；特异性引物和荧光探针中GC含量要求在40-60％，理论Tm＞50℃；特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的3’端避免碱基配对；选用的特异性引物和荧光探针要设计在小鼠肝炎病毒基因中的保守区，只对小鼠肝炎病毒特异，和其他物种无交叉反应；荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域；
所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中
正向引物的序列为：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’；
反向引物的序列为：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；
所述荧光探针的序列为：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’；
3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤：
(1)模板的制备：
将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.94×109拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；
(2)实时荧光定量PCR反应体系：
25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；
(3)循环反应：
根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线；
4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备，包括步骤：
(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA；
(2)采用Invitrogen公司提供的SuperScriptTM Preamplification System forFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒做反转录，制备cDNA；
5、有效性验证及结果检测判定：
(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染MHV小鼠的cDNA，1μl；
利用感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染MHV小鼠的cDNA，1μl；
(2)循环反应：
按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
(3)有效性验证：
荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无CT值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其CT值应＜32，否则重做。
本发明采用实时定量荧光PCR进行小鼠肝炎病毒的特异性检测，具有以下优点：
(1)、特异性好：由于TagMan荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别，具有很高的准确性，同时，靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低。
(2)、灵敏度高：荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术，因此TagMan检测的灵敏度很高。
(3)、线性关系好：由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。
(4)、操作简单，自动化程度高、防污染；使用TagMan荧光探针定量扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。同时扩增和检测一步完成，操作简单，易于实现自动化。
附图说明
图1为小鼠肝炎病毒(MHV)的检测标准曲线。
图2为小鼠肝炎病毒(MHV)PCR电泳图谱。
具体实施方式
一、实验材料：
1、阳性样本：取自感染小鼠肝炎病毒(MHV)小鼠(来自无锡市血防所动物实验室)的肝脏组织。
2、实验试剂：裂解液Trizol(购于美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶及引物(购于美国Promega公司)，液氮、氯仿、异丙醇、75％乙醇、DEPC处理水、dNTPs、DL2000 Marker(其余试剂均购自美国Sigma公司)。
实验仪器：
超细匀浆器(F6/10，上海fluko公司)、离心机(CT15RT，上海天美电化仪器设备工程有限公司)、实时荧光定量PCR仪(FQD-48A，杭州博日科技有限公司)、普通PCR仪(TC-96/G/H(b)A杭州博日科技有限公司)、紫外分光光度仪(ND-1000，美国Thermo Fisher Scientific公司)、扫描仪(YLN-26、北京市朝阳区京南机电综合服务部)、数码照相机(索尼WX1)、冰箱(MDF-382E(N)，三洋电机国贸公司)。
二、实验方法：
1、标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得小鼠肝炎病毒的保守基因，该保守基因序列的NC号为001846.1，基因片段从9221～9570；利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的质粒为PUC57(由金斯瑞公司提供)，由金斯瑞公司提供合成。
2、特异性引物及荧光探针的设计：以步骤1中选取的高度保守序列为基准，按照发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)的特异性引物及一条荧光探针：其中
正向引物的序列(SEQ ID NO.1)为：
5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，
反向引物的序列(SEQ ID NO.2)为：
5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；
荧光探针的序列(SEQ ID NO.3)为：
5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’；
3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线：
(1)模板的制备：
将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.94×109拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；
(2)实时荧光定量PCR反应体系：
25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；
(3)循环反应：
根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线(如图1所示)；
对图1所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上，表明当基因拷贝数在1.0×108-1.0×104范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线性关系；回归分析显示，R2＝0.9923；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性能良好。
4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备：
(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA；具体步骤为：
(a)、将小鼠肝组织按照每50-100mg，加入1ml Trizol液的比例加入到5ml离心管中，并在超细匀浆器中生成研磨液，(注意：组织的总体积不能超过所用Trizol体积的10％)，然后转入新离心管中；
(b)、将上述的研磨液在室温下放置5分钟，然后按照每1mlTrizol液加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡离心管15秒，4℃下12000g离心15分钟；
(c)、吸取上述离心后的上层水相加入到另一个新的离心管中，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000g离心10分钟；
(d)、弃去上清液，按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
(e)、小心弃去上清液，室温晾干或真空干燥5～10分钟(注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度)；
(f)、将干燥后的RNA溶于水中，必要时可55℃～60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70％乙醇并保存于-70℃条件下。
(2)cDNA的制备：
采用Invitrogen公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒做反转录，具体步骤为：
(a)、在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC水使总体积达11μl；向微量离心管中加入10μM Oligo(dT)15μl，轻轻混匀、离心；
(b)、将微量离心管70℃加热10min后立即插入冰浴中至少1min；然后加入下列混合试剂，混合试剂的成分为：10×PCR buffer，2μl；25mM MgCl2，2μl；10mM each dNTPmix，1μl；0.1M DTT，2μl；然后轻轻混匀，4℃下10000g离心1min；然后转入42℃水浴中下孵育2-5min；
(c)、加入反转录酶200U1μl，在42℃水浴中继续孵育50min；
(d)、将微量离心管70℃加热15min，终止反应；
(e)、将微量离心管插入冰中，加入RNase H 1μl，在37℃下孵育20min，降解残留的RNA，反转录的最终体系为35μl，最后补足DEPC水165μl，得最终cDNA为200μl，置于-20℃保存备用。
5、有效性验证及结果检测判定
(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染MHV小鼠的cDNA，1μl；
利用步骤4中制备的感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染MHV小鼠的cDNA，1μl；
(2)循环反应：
按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
(3)有效性验证：
荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点(如图1所示)；阴性对照在本检测试验中无CT值并且无扩增曲线，表明该反应体系中无小鼠肝炎病毒；图中的阳性对照点位于标准曲线上，并且其CT值＜32，实验有效，可见，本发明的检测方法能够准确有效地检测出小鼠肝炎病毒。
三、常规PCR检测：
(1)以DL2000 Marker作为参照，采用步骤1中构建的标准质粒作为模板，以未感染MHV小鼠的cDNA作为样本cDNA，进行PCR电泳检测，分为参照组、阴性对照组、阳性对照组和样本组a、b、c，各组的反应体系成分如表1所示：
表1：常规PCR电泳检测中的各组的反应体系成分
其中，8.25μl的混合液由2.5μl的10×PCR buffer，0.5μl的10mMdNTPs，0.25μl的1.25U Tag DNA聚合酶，2.5μl的300nM PrimerF和2.5μl的300nM PrimerR组成。
(2)常规PCR反应：反应循环程序及参数为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环后反应结束，得到反应产物；
(3)将上述反应产物进行常规凝胶电泳检测(120V 40min)，检测结果如图2所示(泳道M：参照组DL2000 Marker，泳道1：阴性对照组，泳道2：阳性对照组，泳道3：样品组a，泳道4：样品组b，泳道5：样品组c)，由图可见，泳道1未跑出条带，说明本实验方法的非特异性较好。
本发明采用的实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间，简化了实验操作。而且荧光检测的结果由电脑分析读数，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。同时，本发明中采用的阳性对照是根据小鼠肝炎病毒的保守基因序列设计构建的标准质粒分子，相对于以往采用灭活病毒液作为阳性品的检测，更增加了安全性，标准质粒分子还可以大量进行复制，使得阳性标准品的来源更加稳定和可靠，避免了阳性病毒株在每次试验中的使用。
序列表
<110>无锡奥瑞生物医药科技有限公司
<120>小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法
<160>3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’
Claims (3)
1.小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定，其特征在于，所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中
正向引物的序列为：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，
反向引物的序列为：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；
所述荧光探针的序列为：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’。
2.如权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为：
(1)模板的制备：
将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.94×109拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；
(2)实时荧光定量PCR反应体系：
25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；
(3)循环反应：
根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线。
3.如权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述有效性验证及结果检测判定的步骤为：
(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染MHV小鼠的cDNA，1μl；
利用感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染MHV小鼠的cDNA，1μl；
(2)循环反应：
按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
(3)有效性验证：
荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无CT值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其CT值应＜32，否则重做。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010101102682A CN101914631B (zh) | 2010-02-03 | 2010-02-03 | 小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010101102682A CN101914631B (zh) | 2010-02-03 | 2010-02-03 | 小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101914631A true CN101914631A (zh) | 2010-12-15 |
| CN101914631B CN101914631B (zh) | 2012-11-07 |
Family
ID=43322267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010101102682A Active CN101914631B (zh) | 2010-02-03 | 2010-02-03 | 小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101914631B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102367494A (zh) * | 2011-11-02 | 2012-03-07 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于鼠源rna病毒多重实时荧光pcr检测的引物、探针及其试剂盒 |
| CN108753933A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-06 | 陕西科技大学 | 一种基于金属钌配合物的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN113913552A (zh) * | 2021-09-28 | 2022-01-11 | 锦州医科大学 | 小鼠肝炎病毒实时荧光rt-rpa检测的引物和探针、试剂盒及检测方法 |
-
2010
- 2010-02-03 CN CN2010101102682A patent/CN101914631B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 袁文: ""小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立"", 《中国实验动物学报》 * |
| 邵伟娟: ""小鼠肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立和比较研究"", 《中国实验动物学报》 * |
| 高骏: ""小鼠肝炎病毒研究进展"", 《上海农业学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102367494A (zh) * | 2011-11-02 | 2012-03-07 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于鼠源rna病毒多重实时荧光pcr检测的引物、探针及其试剂盒 |
| CN108753933A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-06 | 陕西科技大学 | 一种基于金属钌配合物的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN108753933B (zh) * | 2018-06-22 | 2021-07-23 | 陕西科技大学 | 一种基于金属钌配合物的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| US11634759B2 (en) | 2018-06-22 | 2023-04-25 | Shaanxi University Of Science & Technology | Real-time fluorescence quantitative PCR detection method and kit based on metal ruthenium complex |
| CN113913552A (zh) * | 2021-09-28 | 2022-01-11 | 锦州医科大学 | 小鼠肝炎病毒实时荧光rt-rpa检测的引物和探针、试剂盒及检测方法 |
| CN113913552B (zh) * | 2021-09-28 | 2024-02-20 | 锦州医科大学 | 小鼠肝炎病毒实时荧光rt-rpa检测的引物和探针、试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101914631B (zh) | 2012-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Woźniakowski et al. | Polymerase cross-linking spiral reaction (PCLSR) for detection of African swine fever virus (ASFV) in pigs and wild boars | |
| CN101818207A (zh) | 甲型流感病毒、h1n1及h3n2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒 | |
| CN101158634A (zh) | 乙型肝炎病毒(hbv)荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN105861641A (zh) | 一种用于检测cho细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN110551851A (zh) | 一种用于扩增asfv的camp引物组及试剂盒和应用 | |
| CN103397105A (zh) | 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途 | |
| CN102140529A (zh) | 登革热病毒荧光定量pcr检测新方法及登革热病毒检测pcr体系 | |
| CN101294223B (zh) | 一种用于检测ⅱ型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN113416799A (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒的cda引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN101962689B (zh) | 一种食品中戊型肝炎病毒的四重荧光定量pcr鉴别检测方法 | |
| CN101914631B (zh) | 小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN102925558B (zh) | 一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒 | |
| CN100352944C (zh) | 快速检测细小脲原体的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN105567874A (zh) | 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法 | |
| CN102071263A (zh) | 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒 | |
| CN102154523B (zh) | 检测人bk病毒核酸的引物与荧光探针及其应用 | |
| CN103103287A (zh) | 基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量rt-pcr检测试剂 | |
| CN101899535B (zh) | 猪蓝耳病病毒实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN102329889B (zh) | 用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法 | |
| CN101928784A (zh) | 仙台病毒实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN101838708A (zh) | 一种检测犬流感的方法 | |
| Flannery et al. | Improved PCR diagnostics using up-to-date in silico validation: an F-gene RT-qPCR assay for the detection of all four lineages of peste des petits ruminants virus | |
| CN101294224B (zh) | 一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN103320528B (zh) | 一种用于以荧光rt-pcr检测样品中禽流感病毒的引物对、探针和包含其的试剂盒 | |
| CN102071264A (zh) | 禽流感病毒通用型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20101215 Assignee: WUXI HESHENG MEDICAL DEVICES Co.,Ltd. Assignor: Wuxi Aury Biological Pharmaceutical Inc. Contract record no.: 2013320000392 Denomination of invention: Real-time fluorescent quantitative PCR detection method for mouse hepatitis virus Granted publication date: 20121107 License type: Exclusive License Record date: 20130427 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231212 Address after: 5 / F, c30303, C5, area C, Wuxi Huishan life science and Technology Industrial Park, 1699 Huishan Avenue, Huishan District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214000 Patentee after: WUXI SHENRUI BIO-PHARMACEUTICALS Co.,Ltd. Address before: 214091 Public Service Platform for Biological Outsourcing Service Area, No. 88 Meiliang West Road, Mashan Town, Binhu District, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee before: Wuxi Aury Biological Pharmaceutical Inc. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240918 Address after: Room 101, Public Service Platform, No. 88 Meiliang Road, Mashan Street, Binhu District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214000 Patentee after: Jiangsu Ruichang Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 5 / F, c30303, C5, area C, Wuxi Huishan life science and Technology Industrial Park, 1699 Huishan Avenue, Huishan District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214000 Patentee before: WUXI SHENRUI BIO-PHARMACEUTICALS Co.,Ltd. Country or region before: China |