CN113913552A - 小鼠肝炎病毒实时荧光rt-rpa检测的引物和探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT‑RPA检测的引物和探针、试剂盒及检测方法，包括上游引物、下游引物和探针，所述试剂盒用于小鼠肝炎病毒检测，试剂盒包括上述的上游引物、下游引物、探针，还含有逆转录酶、结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白酶、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管、阳性对照以及阳性对照。优点是：特异性高，准确度高，并且易保存运输，拥有良好的稳定性，可以监测整个检测过程。

Description

小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针、试剂盒及 检测方法

技术领域

本发明属于生物核酸分子检测技术领域，具体涉及一种应用实时荧光反转录后重组酶依赖扩增技术检测(Reverse Transcript RecombinasePloymerase Amplification,RT-RPA)检测的引物和探针及试剂盒。

背景技术

冠状病毒科病毒是一类极为重要的致病病原体，感染的宿主范围较广，包括人、鸟类及多种哺乳类动物，可引起上呼吸道、胃肠道、肝脏及中枢神经系统等疾病。鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus MHV)属于冠状病科冠状病属，不同年龄、品系和免疫状态的小鼠均可感染，感染可引起肝炎、脑脊髓炎和肠炎等不同症状。但在临床上小鼠多表现为隐性带毒感染，一旦与某些微生物发生混合感染，或在某些条件的刺激下，就会发生爆发流行。鼠肝炎病毒是感染啮齿类实验动物各种病毒中最难清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群，各种免疫应答参数会发生改变，对实验结果产生各种影响，是实验动物国家标准GB14922-2011(实验动物微生物等级及监测)强制规定必检排除病原体之一。

目前，国内鼠肝炎病毒感染的诊断方法有很多，包括病毒分离与电镜观察和ELISA等传统方法，但这些方法即复杂又繁琐，耗时费力、灵敏性低等，不利于鼠肝炎病毒常规监测。美国Charles river和欧盟FELASA等实验动物质量检测实验室都推荐采用PCR技术作为实验动物病原的检测方法，然而PCR方法需要精确度高、操作复杂和价格昂贵的PCR仪，并且需要良好的实验条件和熟练的技术人员，且不适合用于现场快速检测，因此目前国内检测实验室对核酸检测方法的应用较少，虽然也有TR-LAMP检测技术用于鼠肝炎病毒检测，但TR-LAMP等温检测一般需要45-60min，需要较长时间完成检测，且需要同时精确设计6条引物，难度高操作复杂。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification RPA)，是由英国TwistDx Inc公司开发出来的一种不同于PCR的新型等温扩增技术。该技术主要包括：在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下实现延伸。与普通PCR和荧光定量PCR相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，不需要昂贵的仪器，缩短了反应时间，操作简便，可满足现场应急对病原体快速诊断需求，近年来已经成为分子诊断行业的热点。RPA 在核酸扩增方面与PCR和其他技术一样有效，并且在简化实验条件和缩短反应时间方面取得了重大突破，目前国内外还没有将RPA技术应用于鼠肝炎病毒检测的报道。因此建立实时荧光RPA检测鼠肝炎病毒的方法十分必要。

RPA作为快速检测方法，反应灵敏，特异性敏感性高，但目前RNA病毒标准品的制备主要以RNA片段和整个病毒颗粒作为原料，但裸露的病毒片段易降解，不稳定，全病毒颗粒仍具有毒性，安全性较低。且由于其易受环境影响，易污染产生假阳性，准确度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可监测整个检测过程，特异性高，准确度高，并且易保存运输，拥有良好的稳定性的小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针、试剂盒及检测方法。

本发明的技术方案是：

第一方面，一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针，所述引物分为上游引物和下游引物，上游引物、下游引物和探针序列分别如下：

上游引物：M-MHV(82-113)-F3:5’-CTACTCTTTATTACTATCATACTACAGTTCGG-3’；

下游引物：M-MHV(317-286)-R3:5’-GTCCTGATAAACAACCTAATGCTATTAACAAA-3’；探针：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCTT_F-T-G-THF-A—

T_QTTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’；

其中T_F表示连接有荧光集团的T，T_Q表示连接有淬灭集团的T，T_F和T_Q之间是THF，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基因；所述荧光集团FAM、HEX、TET、JOE、 VIC中的一种；所述淬灭集团为BHQ，即BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种。

进一步的优选，修饰后的探针序列为：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCT-FAMdT-G-THF-A-BHQ1dT-TTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’。

第二方面，一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测引物和探针的检测试剂盒，所述试剂盒用于小鼠肝炎病毒检测，试剂盒包括上述的上游引物、下游引物、探针，以及阳性对照和阳性对照；

其中，阳性对照为标准质控品，标准质控品是将噬菌体与小鼠肝炎病毒序列如SEQID No:4进行连接，并在其5’端和3’端进行修饰，插入至原核表达载体pet28b中，构建重组质粒pet28b-MS2-M转化至BL21宿主菌中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，形成含小鼠肝炎病病毒M片段RNA的MS2噬菌体样假病毒颗粒。

进一步的优选，所述试剂盒还含有逆转录酶、结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白酶(SSB)、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管中至少一种。

第三方面，一种实时荧光RT-RPA检测小鼠肝炎病毒的方法，该方法为非疾病的诊断和治疗方法；包括以下步骤：

1)提取检测样本RNA；

2)配制含有所述引物和探针的RT-RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和RPA扩增反应；

3)分析扩增产物

反应体系总体积为50μL，其中，再水化缓冲液29.2μL-30μL、Uvs X 120ng、Uvs Y60ng、聚合酶Bsu 30ng/μL、单链DNA结合蛋白酶(SSB)600ng/μL、浓度为10μM上游引物1.0μL-2.4μL、浓度为10μM的下游引物1.0μL-2.4μL、10μM探针0.6μL，模板2μL、浓度为280mM的醋酸镁2.5μL，去离子水补齐至50μL，并加入启动反应；

RT-RPA扩增条件为：35℃-41℃，20min-30min；

步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待检样本中是否含有小鼠肝炎病毒；如果有相应的扩增曲线表示待测样本含有小鼠肝炎病毒，结果为阳性，如果没有扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到小鼠肝炎病毒，结果为阴性。

进一步的优选，所述再水化缓冲液成分为：pH7.9的Tris-HCl溶液50mM，醋酸钾100mM； dNTPs 200μM，肌酸激酶100ng/μL，二硫苏糖醇2mM，磷酸肌酸50mM，ATP 3mM，PEG35K占再水化缓冲液体积的5％。

进一步的优选，反应体系中再水化缓冲液为29.5μL，上游引物和下游引物分别为1.2μ L。

进一步的优选，RT-RPA扩增条件为：37℃等温扩增反应30min。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次采用实时荧光定量RT-RPA技术建立快速检测小鼠肝炎病毒的方法，并通过特异性、灵敏度及稳定性评价，可为小鼠肝炎病毒的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。

(2)本发明引物和探针组合是根据靶序列设计的多对RPA引物、探针，特异性好，与其它病毒无较差反应，能将小鼠肝炎病毒与其他感染小鼠病毒如仙台病毒、细小病毒、诺如病毒、出血热病毒有效鉴别开来。

(3)通过RPA反应能够将痕量的核酸模板扩增到可检出的水平，本发明所建立的检测方法可准确检出。

(4)检测速度快，与常规qPCR相比，不经过变温历程，约20min即可完成反应，尤其适应于基层实验室和现场快速核酸检测。

为了增强诊断的准确性，避免假阴性的出现，本试剂盒配套标准质控品。

通过pet28b原核表达系统，将鼠肝炎病毒M靶基因序列插入噬菌体MS2基因下游，转入宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，在得到与野生噬菌体形态相同的病毒样颗粒同时，也将靶基因M转录出的RNA包装，将RNA片段包裹到衣壳蛋白内，该颗粒内部能够包裹RNA 分子，且具有耐核酸酶的特性。这种蛋白-RNA复合体的结构与RNA病毒相似，在进行病毒检测操作时基本能准确体现病毒RNA的提取过程，能大大减少操作过程中出现的错误率，另外该病毒样颗粒自身无法复制，具有很好的生物安全性这样制成的病毒样颗粒既无生物危险性，又能和阳性病毒样本一样，监控整个检测过程，耐受RNase的降解，易于保存和运输。

鼠肝炎病毒的RNA包含8个基因、4-6个结构蛋白，其中M蛋白是各株鼠肝炎病毒中保守的抗原决定蛋白，因此，以M蛋白基因与MS2载体序列连接更加稳定。以此将标准质控品与RPA检测方法相结合，完善了RPA技术易受环境影响的缺陷，准确度更高，稳定性更强。

附图说明

图1为引物对筛选结果；

图2为探针筛选结果；

图3为质粒pet28b-MS2-M的构建模式图；

图4为质粒pet28b-MS2-M的酶切鉴定结果；

图5为标准质控品的SDS-PAGE诱导蛋白表达结果；

图6为本发明鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA最佳引物与探针比筛选结果；

图7为本发明鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA最佳温度筛选结果；

图8为本发明鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA方法的敏感性分析结果；

图9为本发明鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA方法特异性分析结果。

具体实施方式

本发明利用1对引物和1条探针建立一种可以快速检测鼠肝炎病毒的实时定量RT-RPA 检测方法，该方法不仅可以快速检测鼠肝炎病毒，而且不需要价格昂贵的PCR扩增仪等仪器，可实现对鼠群鼠肝炎病毒日常监测、流行病学调查。结合具体实施方式对本发明做以下说明，但本发明不限于此。

实施例1特异性RPA引物和探针的设计与筛选

根据登录号为FJ6647223基因序列，通过分析其保守基因M基因序列，设计6对RAP引物，并设计出2条与靶基因序列互补的Probe探针备选，如表1所示。

引物对以质粒pet28b-MS2-M为模板进行RPA扩增，扩增条件：37℃，30分钟；并通过1.4％的琼脂凝胶电泳观察结果，对6对RAP引物(如表1)进行筛选，与其他引物对相比，引物对M-MHV-F3和M-MHV-R3在相同条件下获得的目的带最明亮清晰，扩增效率更高，如图1所示。

表1用于RPA检测的备选引物对与探针

最后，选择灵敏度和特异性较好引物对M-MHV-F3和M-MHV-R3用于RAP检测引物，所述引物对核苷酸序列如下：

M-MHV-F3:5’-CTACTCTTTATTACTATCATACTACAGTTCGG-3’(SEQ ID No:1)；

M-MHV-R3:5’-GTCCTGATAAACAACCTAATGCTATTAACAAA-3’(SEQ ID No:2)；

扩增片段长度205bp；

在此基础上，进行RPA扩增，扩增条件：37℃，30分钟；对设计的2条探针Probe-M(MHV) -1和Probe-M(MHV)-2(如表1)进行筛选，如图2所示，探针Probe-M(MHV)-2反应更为灵敏。

最终确定探针Probe-M(MHV)-2用于RAP检测，序列如下：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCT-FAMdT-G-THF-A-BHQ1dT-TTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’(SEQ ID No:3)

这里要说明的是，引物和探针的有效设计是决定本发明成功的最关键环节。然而，RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。PCR引物并不适用于RPA。目前实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选。该技术引物设计要求极其严格，个别碱基的替换或增减都会对检测结果产生重要影响，必须经过准确的设计及后期实验验证检测后，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。

本发明引物及探针设计时以下几条成为主要影响因素：

(1)引物长度要求为30-35bp(引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性)，探针长度要求为46-52bp，GC含量在 40％-60％(5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，这样能促引物与扩增靶基因的结合，对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能)，避免引物内部出现二级结构且避免引物出现重复序列；(2)检测扩增片段小于500bp；(3)引物与探针设计时应当避免容易形成二级结构、引物-引物互作、引物-探针互作、发夹结构的序列，减少二聚体的形成。

实施例2标准质控品假病毒样颗粒制备

将标准质控品为阳性对照，对整个反应过程和操作过程进行质量控制，以排除操作不当及其他因素造成的假阴性结果。选取GenBank中已公布的噬菌体MS2基因(登录号：NC_001417.2)与小鼠肝炎病毒(登录号：FJ6647223)M基因特异性保守序列(19-348bp)，进行连接，并在其5’端和3’端进行修饰，在3’端加入poly-A修饰，并插入至原核表达载体pet28b中，获得重组质粒pet28b-MS2-M，构建模式图如图3所示。

用EcoRⅠ、HindⅢ与NcoⅠ、HindⅢ分别进行双酶切鉴定，如图4所示。

将构建质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中，取200ul涂布于含有Kana抗性的平板上，37℃过夜培养。挑单菌落到LB液体培养基中，37℃、200r/min，振摇14h。取含有10mlLB液体培养基的15mL离心管，加入10ulKana抗生素，1ml过夜培养菌液，37℃，200r/min振摇至OD600约0.6-0.8。取2ml菌液分别加入终浓度为0.5nM/L、1.0nM/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，28℃，220r/min诱导8h。收集菌液，12000r，离心2min，弃上清，沉淀用500ulPBS溶解。超声波破碎5min，至菌液澄清透明后，12000r，离心3min，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。结果显示，沉淀物中出现约14KD特异性条带(如图5所示)，表明获得含MHV-M基因保守序列的假病毒样颗粒。

实施例3检测MHV实时荧光RT-RPA检测方法建立

RT-PRA反应体系(总体积按50μL计)和条件为：其中再水化缓冲液(成分：Tris-HClpH7.9 50mM；醋酸钾100mM；dNTPs 200μM；肌酸激酶100ng/μL；二硫苏糖醇2mM；磷酸肌酸50mM，ATP 3mM；PEG35K 5％)29.2μL-30μL(本实施例取29.5μL)、Uvs X 120ng、Uvs Y 60ng、聚合酶Bsu 30ng/μL、单链DNA结合蛋白酶(SSB)600ng/μL、MHV-F、 MHV-R(终浓度为10μM)各1.0-2.4μL(本实施例以1.2μL为例)、探针(10μM)0.6μ L，模板2μL、2.5μL的醋酸镁(终浓度为280mM)，去离子水补齐至50μL，并加入启动反应。RT-RPA反应在等温扩增反应30min。

在此基础上，对最佳引物与探针比进行优化，引物与探针比例为3：1反应更灵敏，其次为2：1，考虑到现实因素，实验损耗等原因，选择MHV-F、MHV-R(终浓度为10μM)1.2 μL、探针(10μM)0.6μL为实验最终引物与探针比例，如图6所示。

在此基础上，对检测方法最佳反应温度进行优化，反应温度37℃扩增效率最高，如图7 所示。

因此得到最终RT-PRA反应体系(总体积按50μL计)和条件为：其中再水化缓冲液(成分：Tris-HCl pH7.9 50mM；醋酸钾100mM；dNTPs 200μM；肌酸激酶100ng/μL；二硫苏糖醇2mM；磷酸肌酸50mM，ATP 3mM；PEG35K 5％)29.2μL-30μL(优选29.5μL)、Uvs X 120ng、Uvs Y60ng、聚合酶Bsu 30ng/μL、单链DNA结合蛋白酶(SSB)600ng/μL、MHV-F、 MHV-R(终浓度为10μM)各1.0-2.4μL(优选1.2μL)、探针(10μM)0.6μL，模板2μL、2.5μL 的醋酸镁(终浓度为280mM)，去离子水补齐至50μL，并加入启动反应。RT-RPA反应在 37℃等温扩增反应30min。

将配制好RT-PRA反应体系的反应管放置于荧光检测仪，根据仪器检测到的荧光信号，观察是否生成荧光信号曲线。结果判定如下

在30分钟内，有明显的扩增曲线生成，判定为阳性样本；

在30分钟内，没有明显的扩增曲线生成，判定为阴性样本。

实施例4本发明检测小鼠肝炎病毒的实时定量荧光RT-RPA方法特异性与敏感性试验

3.1方法

灵敏度试验：将质粒pet28b-MS2-M用ddH₂O以10倍的比例稀释至7个浓度，稀释后的模板拷贝数分别为3.703×10⁸拷贝/μL、3.703×10⁷拷贝/μL、3.703×10⁶拷贝/μL、3.703× 10⁵拷贝/μL、3.703×10⁴拷贝/μL、3.703×10³拷贝/μL、3.703×10²拷贝/μL。

特异性试验：通过检测含有鼠肝炎病毒阳性核酸以及来自其他病原体的核酸来确定建立的RPA方法的特异性，其他病原体的核酸包括仙台病毒、汉坦病毒、鼠细小病毒、鼠肺炎病毒、呼肠弧病毒Ⅲ型。

3.2结果

灵敏度：将质粒pet28b-MS2-M进行10倍倍比稀释，作为模板进行RPA检测，模板浓度共7个梯度，最低检测值为3.703×10²拷贝/μL(如图8所示)。

特异性：通过检测鼠肝炎病毒以及其他鼠源病原体仙台病毒、汉坦病毒、鼠细小病毒、鼠肺炎病毒、呼肠弧病毒Ⅲ型确定RPA方法的特异性，检测结果如图9所示，除了鼠肝炎病毒出现特异性曲线外，其他病原体没有扩增，证明该方法具有良好的特异性。

实施例5本发明检测鼠肝炎病毒的实时定量RT-RPA方法用于临床样品检测

用建立的RT-RPA方法对来自锦州市疾病控制中心保存的32个样本进行检测，样品采样来自鼠肝脏或肺脏。

同时，为评估构建的鼠肝炎病毒实时RT-RPA方法符合性，使用常规RT-qPCR法对32份临床样本进行检测、对比。结果显示，RT-RPA方法检出阳性样品15例，与RT-qPCR方法结果一致，两种方法符合率100％，如表2所示

表2临床样品检测

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 锦州医科大学

<120> 小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针、试剂盒及检测方法

<130> 2021

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 上游引物序列

<400> 1

ctactcttta ttactatcat actacagttc gg 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 下游引物序列

<400> 2

gtcctgataa acaacctaat gctattaaca aa 32

<210> 3

<211>

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 探针序列

<400> 3

AATTGCGTGT ATGCGCTAAA TAATGTGTAT CT-FAMdT-G-THF-A-BHQ1dT-TTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer

<210> 4

<211> 1660

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 保守基因M基因序列

<400> 4

tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag gtttgacctg tgcgagcttt 60

tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc gttcgcgttt acgcggacgg 120

tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg aactggactc ccggtcgttt 180

taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc tctccgtatt cacggggggc 240

gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga agtgggtcat cgtggggtcg 300

cccgtacgag gagaaagccg gtttcggctt ctccctcgac gcacgctcct gctacagcct 360

cttccctgta agccaaaact tgacttacat cgaagtgccg cagaacgttg cgaaccgggc 420

gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt aaccttggtg ttgctttagc 480

agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc attgcgctcg tgaaggcgta 540

cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc taccttgccc taaacgaaga 600

tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg gagttgcagt tcggttggtt 660

accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt acgaaggttc accttcaaga 720

gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac atcaagttag atggccgtct 780

gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata tcgcgacgta tcgtgatatg 840

gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct ctaggtatct tgaacccact 900

aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc gactggctcc tacctgtagg 960

taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc tacatgtcag gaacagttac 1020

tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct ccctacgggt ggactgtgga 1080

gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat cgaggggtac aatccgtatg 1140

gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg gtccatacct tagatgcgtt 1200

agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa ccggagtttg aagcatggct 1260

tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa ctggcgacgt gactgtcgcc 1320

ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct ctaactcgcg ttcacaggct 1380

tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga atcgcaaata caccatcaaa 1440

gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg tagagcttcc tgtagccgca 1500

tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt tcgctacgaa ttccgactgc 1560

gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg gaaacccgat tccctcagca 1620

atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca 1660

Claims (8)

1.一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针，所述引物分为上游引物和下游引物，其特征是：

上游引物、下游引物和探针序列分别如下：

上游引物：M-MHV(82-113)-F3:5’-CTACTCTTTATTACTATCATACTACAGTTCGG-3’；

下游引物：M-MHV(317-286)-R3:5’-GTCCTGATAAACAACCTAATGCTATTAACAAA-3’；探针：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCTT_F-T-G-THF-A—

T_QTTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’；

其中T_F表示连接有荧光集团的T，T_Q表示连接有淬灭集团的T，T_F和T_Q之间是THF，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基因；所述荧光集团FAM、HEX、TET、JOE、VIC中的一种；所述淬灭集团为BHQ，即BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种。

2.根据权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针，其特征是：

修饰后的探针序列为：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCT-FAMdT-G-THF-A-BHQ1dT-TTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’。

3.含有权利要求1所述的一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测引物和探针的检测试剂盒，其特征是：所述试剂盒用于小鼠肝炎病毒检测，试剂盒包括权利要求1所述的上游引物、下游引物、探针，以及阳性对照和阳性对照；

其中，阳性对照为标准质控品，标准质控品是将噬菌体与小鼠肝炎病毒序列如SEQ IDNo:4进行连接，并在其5’端和3’端进行修饰，插入至原核表达载体pet28b中，构建重组质粒pet28b-MS2-M转化至BL21宿主菌中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，形成含小鼠肝炎病病毒M片段RNA的MS2噬菌体样假病毒颗粒。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征是：所述试剂盒还含有逆转录酶、结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白酶(SSB)、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管中至少一种。

5.一种实时荧光RT-RPA检测小鼠肝炎病毒的方法，其特征是：

该方法为非疾病的诊断和治疗方法；

包括以下步骤：

1)提取检测样本RNA；

2)配制含有所述引物和探针的RT-RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和RPA扩增反应；

3)分析扩增产物

反应体系总体积为50μL，其中，再水化缓冲液29.2μL-30μL、Uvs X 120ng、Uvs Y 60ng、聚合酶Bsu 30ng/μL、单链DNA结合蛋白酶(SSB)600ng/μL、浓度为10μM上游引物1.0μL-2.4μL、浓度为10μM的下游引物1.0μL-2.4μL、10μM探针0.6μL，模板2μL、浓度为280mM的醋酸镁2.5μL，去离子水补齐至50μL，并加入启动反应；

RT-RPA扩增条件为：35℃-41℃，20min-30min；

步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待检样本中是否含有小鼠肝炎病毒；如果有相应的扩增曲线表示待测样本含有小鼠肝炎病毒，结果为阳性，如果没有扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到小鼠肝炎病毒，结果为阴性。

6.根据权利要求5所述的实时荧光RT-RPA检测小鼠肝炎病毒的方法，其特征是：所述再水化缓冲液成分为：pH7.9的Tris-HCl溶液50mM，醋酸钾100mM；dNTPs 200μM，肌酸激酶100ng/μL，二硫苏糖醇2mM，磷酸肌酸50mM，ATP 3mM，PEG35K占再水化缓冲液体积的5％。

7.根据权利要求5所述的实时荧光RT-RPA检测小鼠肝炎病毒的方法，其特征是：反应体系中再水化缓冲液为29.5μL，上游引物和下游引物分别为1.2μL。

8.根据权利要求5所述的实时荧光RT-RPA检测小鼠肝炎病毒的方法，其特征是：RT-RPA扩增条件为：37℃等温扩增反应30min。

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