CN115807134A - 一种高保真重组酶聚合酶扩增试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高保真重组酶聚合酶扩增试剂盒及应用。发明人基于重组酶聚合酶扩增的反应原理，开发出合适的目标蛋白酶对RPA反应体系进行重新组合和优化，实现RPA的国产化，同时完善RPA和PCR技术的比较临床验证，为RPA应用于临床提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及重组酶聚合酶扩增技术，具体涉及一种高保真重组酶聚合酶扩增试剂盒及应用。
背景技术
目前临床实验室开展诊断病毒感染的方法主要包括靶向病原体抗原的胶体金免疫法，靶向病原体特异性抗体的化学发光法/酶联免疫吸附法和靶向病毒核酸的实时荧光定量PCR法。核酸检测阳性是目前诊断病毒感染的金标准，但是实时荧光定量PCR对实验环境、实验设备和操作人员的素质要求很高，限制了其在基层医院的开展。为了进一步扩大病毒核酸检测的应用，提高病毒感染诊断的准确性，临床上迫切需要开发一种简单、快捷、廉价的核酸检测方法。
20世纪90年代以来，恒温核酸扩增技术迅速发展。等温核酸扩增只需要单一的孵育温度，从而降低了对设备的要求，同时不需要重复的加热和冷却步骤，减少了反应时间。最重要的是，多个分子反应可以同时进行，而不是在热循环中顺序操作，这极大地增加了反应效率。目前已报道的等温核酸扩增技术包括：转录介导的扩增(Transcription-mediatedamplification)、环介导的等温扩增(Loop-mediated amplification)、链置换扩增(Strand displacement amplification)、解旋酶依赖的扩增(Helicase-dependentamplification)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase-Polymerase Amplification)等。其中，重组酶聚合酶扩增(Recombinase-Polymerase Amplification，RPA)虽然引入相对较晚，但其设备要求简单、反应迅速，近年来经历快速地发展。在进行核酸扩增时，首先重组酶在重组酶负载因子的作用下与引物结合形成核酸-蛋白复合物，然后该复合物延DNA双链寻找与引物互补的序列进行杂交并置换下另一条DNA单链，置换下来的DNA单链与单链结合蛋白结合防止其再与互补链杂交，最后重组酶在ATP的作用下与引物解离，聚合酶与引物结合并延模板进行延伸。
目前，国内的生物技术公司基于不同反应原理开发了适用于临床的恒温核酸检测试剂盒，例如，上海仁度生物科技公司的结核分枝杆菌检测试剂盒(SAT-RNA实时荧光恒温扩增)，杭州优思达生物技术有限公司的结核分枝杆菌检测试剂盒(交叉引物扩增)，成都博奥晶芯生物科技有限公司的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(恒温芯片扩增)。但是，这些试剂的单个反应成本高于100元/人份，价格高昂，不能真正意义上实现廉价、快捷检测。RPA反应成分简单，开发成本低廉，但是RPA的知识产权归英国TwistDx公司，所售卖的试剂盒价格昂贵，目前只有少部分实验室作为科研试剂使用。不能实现RPA技术的国产化是目前RPA应用于临床的最大阻碍。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，第一方面，本发明的目的在于提供一种高保真重组酶聚合酶扩增试剂盒。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种高保真重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，包括单链结合蛋白SSB、DNA聚合酶UmuC、重组酶RecA和重组酶负载因子RecR；所述单链结合蛋白SSB、DNA聚合酶UmuC、重组酶RecA和重组酶负载因子RecR的氨基酸序列如下：
单链结合蛋白——SSB 255aa
DNA聚合酶——UmuC 650aa
重组酶——RecA364aa
重组酶负载因子——RecR 135aa
进一步，上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶终浓度为5-120ng/ul，重组酶负载因子终浓度为10-200ng/ul，聚合酶终浓度为10-200ng/ul,单链结合蛋白终浓度为10-5000ng/ul。
更进一步，上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括适量的Tris-HCL，DTT，dNTP，CK，磷酸肌酸，KOAc，ATP和PEG35K。
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其制备过程包括质粒构建、目的蛋白原核表达、目的蛋白纯化和重组酶聚合酶扩增反应(RPA)步骤，其特征在于，在质粒构建步骤中目的片段制备中SSB、UmuC、RecA、RecR、RuvC的扩增引物如下表1：
表1SSB、UmuC、RecA、RecR的扩增引物
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，在质粒构建步骤中目的片段制备中扩增体系(20ul)：2x Taq.DNA polymerase 10ul,10uM正向引物和反向引物各0.5ul,菌液1ul和无酶水8ul；扩增程序为95℃2min，95℃15s，55℃30s，72℃2min，34个循环。
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的模板为chitin synthase[Candida albicans；引物为下表中7对引物中的至少一对；
引物序列和模板序列如下表2：
表2引物序列和模板序列
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的最佳引物为表3所示序列：
表3重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的引物序列
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应温度为41℃-43℃，反应时间优选20min以内。
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒在作为细菌或病毒检测试剂盒中的应用。进一步，上述重组酶聚合酶扩增试剂盒在作为金黄色葡萄球菌或乙型肝炎病毒检测试剂盒中的应用。
有益效果
本发明提供一种高保真重组酶聚合酶扩增试剂盒及应用。发明人基于重组酶聚合酶扩增的反应原理，开发出合适的目标蛋白酶对RPA反应体系进行重新组合和优化，实现RPA的国产化，同时完善RPA和PCR技术的比较临床验证，为RPA应用于临床提供基础。
附图说明
图1是PET-28a质粒图谱；
图2是目标蛋白酶原核表达及纯化结果图；
图3是RPA反应体系验证结果图；
图4是RPA反应条件优化结果图，其中A为筛选出的RPA酶体系表达纯化，B.引物筛选，C-D.最佳反应温度、时间；
图5是RPA反应体系实用性验证结果图；
图6变异在扩增片段各位点分布概率图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品。
主要试剂
实施例1
实验方法
1.1质粒构建
发明人从枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和大肠杆菌T4噬菌体四个物种中筛选了36种蛋白酶。
(1)目的片段制备。在NCBI上查找到目的蛋白酶的核酸序列并设计对应的引物，以菌液作为模板进行PCR扩增得到纯化的目的片段，用PCR仪扩增目的片段(包括DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、重组酶、重组酶介导因子、解旋酶共36种蛋白酶),扩增体系(20ul)：2xTaq.DNApolymerase 10ul,10uM正向引物和反向引物各0.5ul,菌液1ul和无酶水8ul.扩增程序为95℃2min，95℃15s，55℃30s，72℃2min，34个循环。
(2)目的片段和载体酶切。扩增产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳和胶回收纯化。利用核酸内切酶BamH1和Xho1在37℃条件下进行酶切2h，酶切后的产物利用乙醇沉淀法进行纯化；酶切体系(20ul)：BamH1 1ul,Xho1 1ul buffer 2ul,目的片段5.5ul(1ug),无酶水10.5ul。
(3)连接目的片段和载体。纯化后的酶切产物和T4 DNA连接酶在16℃过夜连接；连接反应体系(20ul)：载体PET 28a 1ul(40ng)，目的片段4.2ul(约100ng),T4 DNA连接酶0.8ul,T4 buffer 2ul,无酶水12ul。
(4)阳性克隆筛选。连接产物转化入Top10感受态细胞后，在卡纳抗性的培养基上37℃培养12-16h，挑选单个菌落进行测序验证。
1.2目的蛋白原核表达
(1)质粒提取：加测序成功的菌液10ul到5mL LB培养液(硫酸卡那霉素抗性)中，37℃，200r培养16h。按照质粒提取试剂盒说明书操作，提取质粒并测定浓度；
(2)质粒转化：将提取的质粒加20ng到100ul的BL21/Rosseta感受态细胞，静置10分钟后加入电转杯(冰浴)，按照说明书操作电击穿孔机进行电转，加入200ul LB培养液(无抗)重悬细胞，吸取细胞悬液入1.5mlEP管，37℃，200r培养45min；细胞复苏结束后，吸取200ul细胞悬液涂布于硫酸卡那霉素抗性的固体培养基，37℃培养12h；
(3)细菌扩大培养：挑取(2)平板的单个菌落于3mlLB培养液(硫酸卡那霉素抗性)中，37℃，200r培养6h；待菌液OD值达到0.5-0.6时再吸取2ml菌液加入200mlLB培养液(硫酸卡那霉素抗性)中在恒温摇床继续培养，待OD值约为0.5时，加入1M诱导剂IPTG 40ul，温度降为16℃继续培养15-20h。
1.3目的蛋白纯化
(1)细胞裂解：4000r于4℃30min离心收取表达目的蛋白的细菌，加入适量BindingBuffer重悬细菌，在冰水浴中超声波破碎细菌(push 3s,down 7s,200circles)；破碎结束后12000r 4℃30min离心获得蛋白上清液，并用0.22um的除菌滤器过滤；
(2)Ni2+-His亲和层析：Ni2+琼脂糖凝胶柱用Binding Buffer润洗后，用蛋白上清液过柱(1ml/min),结束后用Binding Buffer缓冲柱子，再设置0-100％ Elution Buffer线性梯度洗杂蛋白，在紫外吸收峰(280nm)达到峰值时收集目的蛋白；将蛋白上清液、洗杂液和洗脱液留取的样本进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色；
(3)目的蛋白浓缩：使用浓缩离心管浓缩(2)中的目的蛋白至2ml，然后加入10mlBinding Buffer混匀后继续浓缩至2ml,重复3次，最终浓缩至1ml；
(4)测定浓度：浓缩的蛋白液中加入甘油使其终浓度为10％，用BCA法测定蛋白浓度，然后标记日期分装保存。
1.4RPA反应
(1)配制酶混合液：从-80℃取出蛋白酶4℃缓慢解冻，用BCA法测定蛋白酶浓度，按照30ul反应体系配制酶混合液；重组酶终浓度为5-120ng/ul，重组酶负载因子终浓度为10-200ng/ul，聚合酶终浓度为10-200ng/ul,单链结合蛋白终浓度为10-5000ng/ul；
(2)加入模板(10-20ng)和引物(终浓度为0.2-0.4um)；扩增体系：酶混合液，30uM正向引物和反向引物各0.5ul，模板1ul(10-20ng),2x RPAbuffer 15ul,用蒸馏水补足至28.5ul,混匀并瞬时离心；
(3)加入280mM MgoAc启动剂1.5ul，混匀后42℃孵育4min，颠倒混匀并瞬时离心，继续42℃孵育16min；
(4)反应结束后加入30ul核酸提取液(24：25：1)剧烈震荡萃取1min，12000r离心10min，吸取上清；
(5)吸取的上清加入6xDNAloading，进行核酸电泳。
步骤(2)的引物序列和模板序列如下表4：
表4步骤(2)的引物序列和模板序列
1.5核酸电泳
(1)配置TBE胶(10ml)：蒸馏水3.95ml，30％丙烯酰胺4ml，5xTBE 2ml，10％APS0.01ml，TEMDE 0.0065ml，加入制胶模具中待其凝固；
(2)加入Marker、10ul样本/孔，90V 60min电泳(1xTBE)；
(3)配制3x Gelred泡染液：用蒸馏水将Gelred 10000x储液稀释约3300倍到0.1MNaCI中；
(4)将凝胶加入染液中浸泡25min-35min后显影。
2结果
2.1筛选和表达候选目的蛋白酶
发明人根据RPA反应原理，筛选了可能参与RPA反应的目标蛋白酶：DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、重组酶、重组酶介导因子、解旋酶。发明人从枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和大肠杆菌T4噬菌体四个物种中筛选了36种蛋白酶。首先，发明人在NCBI上查找到目的蛋白酶的核酸序列并设计对应的引物，以菌液作为模板进行PCR扩增得到纯化的目的片段。含有PET-28a质粒的宿主菌在IPTG诱导剂下可将宿主本身的表达几乎全部转为目的基因的表达，在低温诱导数小时后目的蛋白的表达可超过细菌总蛋白的50％。同时该表达载体N端带有一个6xHis标签，C端带有一个可选择的6xHis标签，进一步提高目的蛋白的对Ni2+的亲和力，有助于后续利用Ni2+亲和层析柱进行目的蛋白纯化，所以发明人选用PET-28a质粒作为表达载体(图1)。接着，发明人应用DNA重组技术将目的片段插入PET-28a表达质粒并进行测序验证。最终，发明人成功构建了33种表达质粒，包括5种聚合酶、4种重组酶、8种重组酶负载因子和4种单链DNA结合蛋白和12种解旋酶(表5)。如图2所示，发明人将带有目的基因的重组质粒转入大肠杆菌BL21/Rosseta感受态细胞进行原核细胞表达和目的蛋白Ni2+-His亲和层析纯化。在对表达和纯化条件进行充分优化后，发明人得到23种活性蛋白酶。
表5筛选的候选蛋白酶
2.2RPA反应体系优化
发明人首先根据RPA反应所需组分确定了2x RPA反应液，包括100mM Tris-HCL，4mM DTT，2mM dNTP，200ug/mL CK，100mM磷酸肌酸，200mM KOAc，10mM ATP和10％ PEG35K。然后将重组酶、重组酶负载因子、聚合酶、单链结合蛋白、解旋酶等进行组合反应，保证反应体系内重组酶终浓度为5-120ng/ul，重组酶负载因子终浓度为10-200ng/ul，聚合酶终浓度为10-200ng/ul,单链结合蛋白终浓度为10-5000ng/ul,解旋酶终浓度为5-300ng/ul。
单链结合蛋白——SSB 255aa
DNA聚合酶——UmuC 650aa
重组酶——RecA364aa
重组酶负载因子——RecR 135aa
解旋酶RuvC
上述重组酶聚合酶扩增试剂盒，在质粒构建步骤中目的片段制备中SSB、UmuC、RecA、RecR、RuvC的扩增引物如下表6：
表6SSB、UmuC、RecA、RecR的扩增引物
发明人按照以下体系进行优化，优化体系见表7-13(表中数字代表图3中的条带)。筛选出8种能进行反应且反应效果较好的体系：1，2，22，23，35，41，42，47，通过优化最终确定了反应体系(图3)。
确定反应组分后，发明人从反应时间和反应温度对RPA反应进行了优化，优化结果表明在41℃-43℃反应20min可达到最佳的反应效果(图4)。
表7RPA反应体系反应时间优化
通过将温度固定在42摄氏度，反应时长20min-1h不等如表7，发现42℃反应20min时扩增效果最佳，扩增产物核酸电泳条带单一明亮如图3A，因此，后续体系中将反应时间定于20min。
表8RPA反应体系重组酶负载因子浓度优化
为确定反应体系中重组酶负载因子最佳反应浓度，配置了重组酶负载因子RecR浓度为30ng/ul-120ng/ul不同的体系如表8，结果显示RecR浓度为60ng/ul时扩增效果较好如图3B。
表9RPA反应体系重组酶优化
为确定反应体系中重组酶最佳反应浓度以及对比重组酶UvsX和RecA的活性，配置了重组酶UvsX浓度为125ng/ul-250ng/ul不同的反应体系以及重组酶为RecA120ng/ul的反应体系如表9；结果显示在以上酶组合中UvsX在各浓度时均没有扩增，RecA活性高于UvsX如图3C。
表10RPA反应体系重组酶负载因子种类优化
为比较不同物种的重组酶负载因子对RPA反应的影响以筛选出最佳的重组酶负载因子，分别配置了来自大肠杆菌T4噬菌体，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的不同重组酶负载因子的反应体系如表10。在其他条件相同的情况下，来自大肠杆菌T4噬菌体的重组酶负载因子RecR的体系扩增效果最好如图3D。
表11RPA反应体系聚合酶优化
通过比较不同种聚合酶Sapol和UmuD在反应体系中的活性，体系如表11，发现其他条件相同时，Sapol活性优于UmuD，但扩增效果任然不佳，活性低于UmuC如图3E，3A。
表12RPA反应体系解旋酶优化
为进一步提高RPA扩增效率，在以上能扩增的反应体系中加入解旋酶RuvC，并检测20min-40min不同时间内反应体系的扩增效果以及RuvC在0ng/ul、60ng/ul、120ng/ul不同浓度的体系扩增效果，体系如表12，扩增产物通过TBE胶进行核酸电泳，结果显示，加入解旋酶后各体系均没有扩增条带如图3F，并没有达到提高RPA扩增效率的目的，因此，在后续实验体系中排除解旋酶，仅使用重组酶、重组酶负载因子、聚合酶、单链结合蛋白四种酶组合。
表13RPA反应体系聚合酶优化
为进一步确定反应体系中聚合酶最佳反应浓度以及对比聚合酶Sapol和UmuC的活性，分别配置了聚合酶Sapol浓度为30ng/ul-50ng/ul不同的反应体系以及聚合酶UmuC浓度为30-60ng/ul的反应体系如表9；扩曾结果显示在以上酶组合中Sapol在各浓度时均没有扩增，UmuC活性高于Sapol如图3G，且UmuC浓度为50ng/ul时扩曾效果最好如图3A，3C，3D，3F。
2.3RPA反应性能验证
为验证RPA扩增体系的实用性，发明人用其检测金黄色葡萄球菌菌株R18耐热核酸酶(nuc)基因和乙型肝炎病毒(HBV)的S蛋白基因(pHBVS)，核酸电泳结果显示RPA反应体系对两种基因均有较好扩增效果(图5)。接下来，为检测RPA酶体系扩增的保真性，发明人用PCR和RPA分别扩增同一段基因序列，其中PCR分别用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和TaqDNA polymerase，将扩增产物送擎科生物有限公司做高通量测序。
the S protein gene from Hepatitis B virus(HBV,pHBVS)134bp AACCTCCAATCACTCACCAA CCTCTTGTCC TCCAACTTGT CCTGGTTATC GCTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATCTTCCTCTTCAT CCTGCTGCTA TGCCTCATCT TCTTGTTGGTTCTTCTGGAC TATC
HBs-F:AACCTCCAATCACTCACCAACCTCT
Hbs-R:GATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGA
Staphylococcus aureus strain R18 thermostable nuclease(nuc)gene,partial cds 288bp TTCTGAAGATCCAACAGTATACAGTGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAAACAATGACATTCAGACTATTATTGGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGG
Sa.NUC-F:TTCTGAAGATCCAACAGTATATAGTGCAACTTCAA Sa.NUC-R:CCACGTCCATATTTATCAGTTCTTTGACCTTTGTC
测序结果显示三个样品Phred分值>30的碱基数均在90％以上，并且RPA扩增产物碱基突变率和缺失率均低于普通DNA聚合酶(Taq酶)(表14、表15)，RPA酶扩增片段各位点的碱基变异概率分布与PrimeSTAR Max DNAPolymerase基本一致(图6)。
表14深度测序数据统计表
表15各反应体系扩增产物变异统计表
Claims (10)
1.一种重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，包括单链结合蛋白SSB、DNA聚合酶UmuC、重组酶RecA和重组酶负载因子RecR；所述单链结合蛋白SSB、DNA聚合酶UmuC、重组酶RecA和重组酶负载因子RecR的氨基酸序列如下：
单链结合蛋白——SSB 255aa
DNA聚合酶——UmuC 650aa
重组酶——RecA 364aa
重组酶负载因子——RecR 135aa
2.如权利要求1所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶终浓度为5-120ng/ul，重组酶负载因子终浓度为10-200ng/ul，聚合酶终浓度为10-200ng/ul,单链结合蛋白终浓度为10-5000ng/ul。
3.如权利要求1或2所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括适量的Tris-HCL，DTT，dNTP，CK，磷酸肌酸，KOAc，ATP和PEG35K。
4.如权利要求1-3任一项所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，其制备过程包括质粒构建、目的蛋白原核表达、目的蛋白纯化和重组酶聚合酶扩增反应(RPA)步骤，其特征在于，在质粒构建步骤中目的片段制备中SSB、UmuC、RecA、RecR，RuvC的扩增引物如下表1：
表1 SSB、UmuC、RecA、RecR的扩增引物
5.如权利要求4所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，在质粒构建步骤中目的片段制备中扩增体系(20ul)：2x Taq.DNA polymerase 10ul,10uM正向引物和反向引物各0.5ul,菌液1ul和无酶水8ul；扩增程序为95℃ 2min，95℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 2min，34个循环。
6.如权利要求1-5任一项所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的模板为chitin synthase[Candida albicans；引物为下表中2对引物中的至少一对；
表2引物序列和模板序列
7.如权利要求6所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的最佳引物为表3所示序列：
表3重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的引物序列
8.如权利要求7所述重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应温度为41℃-43℃，反应时间优选20min以内。
9.如权利要求1-8任一项所述重组酶聚合酶扩增试剂盒在作为细菌或病毒检测试剂盒中的应用。
10.如权利要求9所述重组酶聚合酶扩增试剂盒在作为金黄色葡萄球菌或乙型肝炎病毒检测试剂盒中的应用。
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