CN112301016B

CN112301016B - 新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用

Info

Publication number: CN112301016B
Application number: CN202010715154.4A
Authority: CN
Inventors: 刘华勇; 陈翀; 季宇; 谢婵芳; 黄嘉恩
Original assignee: Guangzhou Magigen Biotechnology Corp
Current assignee: Guangzhou Magigen Biotechnology Corp
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: CN112301016A

Abstract

本发明公开了新型mlCas12a蛋白及其在核酸检测方面的应用。本发明研究发现一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型mlCas12a蛋白，可作为新型CRISPR/mlCas12a系统应用于核酸检测，为基于CRISPR/Cas12a的分子检测方法提供了一种新的必要工具选择。同时提供了一种包括mlCas12a蛋白和gRNA的新型核酸检测系统和试剂盒，可在25℃‑37℃的室温下实现高灵敏、高特异性的分子检测，成本低廉、操作方便、快捷、应用范围广，在核酸检测方面具有良好的应用前景。

Description

新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用。

背景技术

2015年，一种全新的第二类CRISPR-Cas系统-V型系统被发现，该系统中的效应蛋白被命名为Cpf1/Cas12a。张锋团队于2015年11月22日在《Cell》发表的一篇题为“Cpf1 isa single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas system”的文章。该系统基本的工作流程与CRISPR/Cas9类似，还是借助CRISPR序列的“黑名单”系统对入侵者进行打击。但是gRNA形成的方式与CRISPR/Cas9系统不同：Cpf1/Cas12a蛋白会与未成熟的gRNA复合，并对gRNA进行加工，gRNA则会与PAM附近的互补区域杂交。最后，外源双链DNA（doublestrand DNA，dsDNA）会被剪切，其基因表达也会被沉默。然而，在切割靶dsDNA的同时，激活了的Cpf1/Cas12a还会降解靶dsDNA邻近的单链DNA（single strand DNA，ssDNA），称之为“附属切割”，这种活性是新开发的核酸检测平台的关键特征。2018年4月27日，Doudna团队和张锋团队同时在《Science》发表了两篇题为“Two distinct RNase activities ofCRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”和“Multiplexed andportable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”的论文。表明Cpf1/Cas12a在切割靶dsDNA的同时，还会降解靶dsDNA邻近的ssDNA。这两个独立的实验室分别改造了靶向dsDNA的V型CRISPR系统，使其成为了快速、便宜且高度灵敏的诊断工具。这一发现有望为科学研究以及全球公共卫生带来变革性的影响。利用这种新的CRISPR技术：CRISPR-Cpf1/Cas12a，可以高灵敏度检测包括寨卡病毒感染，登革热病毒感染等在内的疾病，其原理在于将CRISPR-Cpf1/Cas12a与等温核酸扩增结合，检测特异性的RNA或DNA。另外，该系统还包含有一个切割时发出荧光的报告ssDNA。当Cpf1/Cas12a检测到靶标dsDNA序列时，其ssDNase活性就会切割报告ssDNA，释放可检测的荧光信号。将这两种技术结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和单DNA分子，具有很好的应用前景。另外根据张锋团队的研究结果显示，Cpf1/Cas12a蛋白同族间具有较大的差异，某些同族蛋白无活性。

发明内容

本发明涉及一种用于核酸检测的mlCas12a蛋白或其功能变体，所述mlCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述mlCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明还涉及一种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统，包括上述的mlCas12a蛋白或其功能变体，还包括gRNA。

本发明还涉及基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统的核酸检测方法，其利用上述的mlCas12a蛋白或其功能变体、对应靶标序列的gRNA进行CRISPR核酸检测。

本发明还涉及上述mlCas12a蛋白或其功能变体的应用，包括：

在切割DNA方面的应用；

在作为或制备DNA切割工具方面的应用；

在核酸检测方面的应用；

在基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方面的应用；

在作为或制备核酸检测工具方面的应用；

在作为或制备基于CRISPR/Cas12a的核酸检测工具方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型Cas12a蛋白，可作为新型CRISPR/mlCas12a系统应用于核酸检测，为基于Cas12a的核酸分子检测提供了一种必要工具的新选择。

而且基于mlCas12a蛋白的核酸检测系统可在25-37℃实现高灵敏、高精度的分子检测，具有很好的特异性和兼容性，且检测成本低廉、操作方便、快捷、应用范围广，在核酸检测方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为mlCas12a蛋白三维结构图。

图2为mlCas12a片段PCR扩增结果。

图3为mlCas12a蛋白表达结果。

图4为mlCas12a蛋白纯化结果。

图5为mlCas12a gRNA纯化结果。

图6为基于CRISPR/mlCas12a的核酸检测结果。

图7为基于CRISPR/mlCas12a体系配对的gRNA框架序列筛选结果。

图8为基于CRISPR/mlCas12a的核酸特异性检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克( Sambrook )、弗里奇( Fritsch )和马尼亚蒂斯( Maniatis )，《分子克隆：实验室手册》( MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL )，第2次编辑( 1989 )；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY )( F .M .奥苏贝尔( F .M .Ausubel )等人编辑，( 1987 ))；《酶学方法》( METHODS IN ENZYMOLOGY )系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》( PCR 2:A PRACTICAL APPROACH )( M .J .麦克弗森( M .J .MacPherson )、B.D .黑姆斯( B .D .Hames )和G .R .泰勒( G .R .Taylor )编辑( 1995 ))、哈洛(Harlow )和拉内( Lane )编辑( 1988 )《抗体：实验室手册》( ANTIBODIES ,A LABORATORYMANUAL )，以及《动物细胞培养》( ANIMAL CELL CULTURE )(R .I .弗雷谢尼(R .I.Freshney )编辑(1987 ))。

如下述实施例中所用的异丙基硫化-D-半乳糖苷（IPTG）购买自Sigma公司。NiSepharose FF购买自GE Healthcare。蛋白纯化耗材购买自碧云天公司。Amicon 4 30kDa超滤管购买自Millipore公司。Phusion DNA聚合酶、FastDigestNotI、FastDigestAscI内切酶、T4连接酶购买自Thermo公司。PCR clean up和凝胶回收试剂盒均购买自Qiagen公司。

如本文所用，术语“gRNA”是指向导RNA，其引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA。

如本文所用，术语“CRISPR”是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。

如本文所用，术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型(type V-A)的酶。

如本文所用，术语“PAM”是指靶向序列邻近的前间隔序列邻近基序（protospaceradjacent motif），是CRISPR/Cas系统特异识别靶DNA的重要组成部分。

如本文所用，术语“Cas核酸酶”是能够在gRNA的配合下特异性切割靶序列（DNA或RNA）的酶。

本发明的第一方面在于提供一种用于核酸检测的mlCas12a蛋白或其功能变体，所述mlCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述mlCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明为基于Cas12a的核酸分子检测提供了一种必要工具的新选择，提供一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型CRISPR/Cas12a系统的蛋白- mlCas12a蛋白，可应用于特异性核酸检测。

另外，除了本发明所述的mlCas12a蛋白本身，其功能变体或其同源物或直向同源物皆有可能保留部分或全部蛋白质活性，即mlCas12a蛋白的功能变体或其同源物或直向同源物的应用，也应在本发明的范围之内。

所述功能变体可以包括mlCas12a突变体（可以是插入，缺失或替换序列的突变体）、多晶型等。所述功能变体也包括mlCas12a蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质或多肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的，也可以是人造的。

因此，mlCas12a蛋白或其功能变体的应用均应在本发明的范围之内：

在切割DNA方面的应用；

在作为或制备DNA切割工具方面的应用；

在核酸检测方面的应用；

在基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方面的应用；

在作为或制备核酸检测工具方面的应用；

在作为或制备基于CRISPR/Cas12a的核酸检测工具方面的应用。

另外基于上述应用，本发明的第二方面在于提供基于CRISPR/mlCas12a的核酸检测系统，包括mlCas12a蛋白和gRNA。

其中，所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述与 Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO.10~ 15中至少一种所示。

其中所述gRNA的设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。

作为一种可选择的案例，当靶序列如SEQ ID NO4所示时，gRNA的序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明的第三方面在于提供基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统的核酸检测方法，其利用上述的mlCas12a蛋白或其功能变体、对应靶标序列的gRNA进行CRISPR核酸检测。

具体地，所述基于CRISPR/mlCas12a的核酸检测方法为：将待测核酸样品、mlCas12a蛋白、gRNA、非特异单链荧光探针和反应所需缓冲液混合为反应体系，进行检测反应。具体是反应体系置于荧光分析仪(BioTek)进行荧光分析，以激发波长530nm/发射波长580nm读取反应孔荧光值。

优选地，检测体系包括：2μl RPA产物，45nM SsCas12a，22.5nM gRNA，100nM非特异单链DNA荧光探针，及检测缓冲液。

所述缓冲液的各组分在检测体系的终浓度为：20 mM Tris, 60 mM NaCl, 10 mMMgCl₂, pH 7.3。

反应条件为：37℃下反应1-3小时。

另外，基于本发明的上述技术方案，应当涵盖如下内容：

（1）本发明通过mlCas12a附属切割带荧光基团与粹灭基团的报告DNA链，释放荧光基团，然后将反应体系置于荧光分析仪中检测核酸产物。除本发明所述的核酸检测信号报告方法，本发明也可通过其他利用激活mlCas12a产生附属切割效应后，实现信号检测的方案来检测样本中存在的一种或多种靶分子。

（2）本发明在其他特异性核酸检测方案中，一种或多种gRNA可被设计为靶向一种或多种诊断疾病状态的靶分子。所述疾病，可以是人类疾病，动物疾病，植物疾病；

（3）根据（2），所述人类疾病，可以是人类感染性疾病，癌症，器官疾病，血液疾病，免疫系统疾病，脑和神经系统疾病，内分泌疾病，遗传性疾病。

（4）根据（3），所述人类感染性疾病，可以是由病毒、细菌或真菌引起。可以是呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、季节性流感病毒、副流感病毒、腺病毒、人鼻病毒、人偏肺病毒、腮腺炎病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌、中东呼吸综合征冠状病毒、百日咳杆菌、嗜肺军团杆菌、A链球菌；可以是人类免疫缺陷病毒、淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、单纯疱疹病毒、人细小病毒；可以是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒；可以是人巨细胞病毒、人疱疹病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒EV71/CA16、登革热病毒、沙门氏菌、志贺氏菌、幽门螺旋杆菌、诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、埃博拉病毒。登革热病毒。

（5）根据（3），癌症可以是肺癌、结直肠癌、胃癌、胃肠间质瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。

（6）根据（3），血液疾病及遗传性疾病可以是：地中海贫血、血友病、镰刀型细胞贫血、Rett综合征、囊性纤维化、亨廷顿病、脆性X综合征、13三体综合征、18三体综合征、21三体综合征、遗传性代谢疾病、遗传性耳聋、遗传多囊肾病、先天性糖基化病、G6PD缺乏症、苯丙酮尿症、酪氨酸血症、肝豆状核变性、白化病、糖原累积病、遗传性乳腺癌、遗传性卵巢癌、遗传性结直肠癌等；

（7）根据（3），所述器官疾病，免疫系统疾病，脑和神经系统疾病，内分泌疾病，可以是脑卒中、高血压、冠心病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、阿尔兹海默病、过敏性疾病、类风湿、多发性硬化症、遗传性过敏性皮炎、糖尿病、黄斑变性、强直性脊柱炎等。

（8）根据（2），所述动物疾病可以是：猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒A群、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫、蓝耳病、猪瘟、猪圆环病毒、非洲猪瘟、猪伪狂犬病毒、猪日本乙型脑炎、猪细小病毒、猪流感、蓝耳病、猪链球菌、猪丹毒杆菌、牛瘟、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、多杀性巴氏杆菌、禽流感、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸡马立克氏病病毒、鸡传染性法氏囊病毒、猫衣原体、猫冠状病毒、猫支原体、猫传染性腹膜炎、猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫泛白细胞减少症、犬支原体、犬腺病毒、犬副流感、犬甲型流感、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、狂犬病毒、巴尔通体、弓形虫、钩端螺旋体、巴贝斯虫、布氏杆菌、对虾传染性肌肉坏死病毒、对虾黄头病病毒、对虾淘拉综合症病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、炭疽杆菌等。

（9）本发明在其他特异性核酸检测方案中，一种或多种指导RNA可被设计为靶向一种或多种微生物抗性基因。所述抗性基因，可以是四环素耐药、氨基糖苷类药物耐药、耐消毒剂、红霉素耐药、大环内酯外排、万古霉素耐药、多药耐药外排泵、莫匹罗星耐药、磺胺类耐药、泰洛星耐药、氟喹诺酮耐药、beta内酰胺酶类耐药、头孢菌素耐药、碳青霉烯酶耐药、金黄色葡萄球菌耐药、氯霉素酰基转移酶基因、博来霉素基因、嘌呤霉素基因、卡那霉素基因、氨苄霉素基因、超广谱 β- 内酰胺酶耐药基因等。

（10）本发明在其他特异性核酸检测方案中，一种或多种指导RNA可被设计为靶向一种或多种个体基因型的靶分子。所述个体基因型，可以是人类单核苷酸多态性及基因型，动物基因型，植物基因型等。

（11）根据（10），所述人类单核苷酸多态性及基因型可以是疾病相关多态性位点，包括VKORC1、CYP2C9、CYP2C19等；可以是性状相关多态性位点，包括乳糖耐受基因、咖啡因代谢、酒精代谢、皮肤抗氧化、味觉敏感度、脱发等；可以是人类白细胞抗原（HLA）；

（12）根据（10），所述动物基因型，植物基因型，可以是单核苷酸多态性、等位基因、育种鉴定、转基因鉴定等。

（13）本发明在其他特异性核酸检测方案中，一种或多种指导RNA可被设计为靶向一种或多种检测环境样本状态的靶分子。所述环境样品来自食品样品，饮料样品，纸张表面，织物表面，金属表面，木材表面，塑料表面，土壤样品，水样品，大气或其他气体样品，或其组合。所述检测环境样本状态，可以是病毒，细菌，真菌等各类微生物核酸存在状态，也可以是动物，植物基因组来源核酸存在状态，也可以是转基因核酸存在状态；

（14）本发明在其他特异性核酸检测方案中，一种或多种样本类型可用于核酸检测。所述样本类型，可以是组织样本，唾液，血液，血浆，血清，粪便，尿液，痰液，粘液，淋巴液，滑液，脑脊液，腹水，胸腔积液，血清肿，脓或皮肤或粘膜表面的拭子，盥洗液等；

（15）本发明在其他特异性核酸检测方案中，该核酸检测反应可以承载于不同基质上；所述基质，可以是试管，液滴，固体腔路，微孔，特定基质（如纸基质）等。

（16）本发明在其他特异性核酸检测方案中，该核酸检测反应可以承载于不同基质上；所述基质，可以是试管，液滴，固体腔路，微孔，特定基质（如纸基质）等。

实施例1 mlCas12a基因的发现

本研发团队在研究结膜炎摩拉克氏菌（Moraxella lacunata）（GenBank:PEZQ01000008.1）过程中，发现了其基因组中有CRISPR/Cas系统特征，即Cas1、Cas2/3及基因簇附近的重复序列区段在数种微生物中鉴定出其中的CRISPR/Cas系统，该系统包含一个Cas12a家族蛋白、Cas1、Cas2/3、和重复序列区段，其中标签为“NCTC10359_01020”的基因编码的蛋白（WP_115006085.1）具有Cas12蛋白结构中的关键结构结构域，RuvC内切核酸酶结构域和Nuc结构域。通过重组表达纯化后，发现此蛋白在gRNA介导下对外源靶标序列进行特异性识别且具有非特异切割单链DNA的活性。该蛋白长度为1261 个氨基酸，由于来源于结膜炎摩拉克氏菌（Moraxella lacunata）菌株，我们称之为mlCas12a蛋白。

结膜炎摩拉克氏菌（Moraxella lacunata）基因且中编码mlCas12a蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明中为了提高mlCas12a重组蛋白的表达量，我们对其蛋白表达质粒进行了密码子优化，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示。mlCas12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，三维结构图如图1所示。

然后我们利用CRISPRfinder（http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/），在上述重复序列区段中找出可能存在的gRNA骨架，体外转录出mlCas12a的gRNA。在体外把双链DNA底物、mlCas12a蛋白、gRNA、标记荧光基团的非特异单链DNA加入反应体系，发现标记荧光基团的非特异单链DNA可在gRNA介导下被mlCas12a蛋白特异切割。

同时，本发明人团队研究发现，在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构，在此gRNA设计原则下，mlCas12a具有特异性识别体外DNA序列且具有非特异切割单链DNA的活性。

以下实施例给出了mlCas12a蛋白的制备以及活性验证实验案例。

实施例2 mlCas12a基因的克隆和蛋白表达

1、PCR扩增Cas12a序列

（1）设计引物

根据mlCas12a序列设计了上下游引物，序列如下：

上游引物（SEQ ID NO.6所示）：

Atgttatttcaagactttactca；

下游引物（SEQ ID NO.7所示）：

Ttagcggttttgagcaaagtttcg。

（2）PCR扩增

利用上述的上下游引物，使用高保真DNA聚合酶（phusion DNA聚合酶）在不同退火温度下对目的片段进行PCR扩增。结果如附图2所示，PCR目的条带（约4000bp）。

2、构建重组质粒pET-28a-mlCas12a

（1）PCR扩增产物纯化：PCR扩增后产物通过Qiagen公司的纯化试剂盒（Clean up试剂盒）进行纯化处理；

（2）使用Thermo公司的快速限制性内切酶NotI（FastDigestNotI）和NotI（FastDigestAscI）进行双酶切；

（3）酶切产物通过Qiagen公司的微量样品凝胶回收试剂盒（MiniElute）纯化回收；

（4）纯化回收的产物连接至同样经过NotI和AscI双酶切处理的pET28a-ccdB-CmR载体上，得到重组质粒pET-28a-mlCas12a；

其中，所用pET-28-ccdB-CmR载体为本实验室保存，是以原核表达载体pET28a（购于生物通代理）基础，经改造在HindIII和XhoI酶切位点之间添加NotI-ccdB-CmR-AscI序列，制成pET-28-ccdB-CmR载体。

3、重组质粒pET-28a-mlCas12a的鉴定

为鉴定pET-28a-mlCas12a重组载体正确与否，我们对重组质粒pET-28a-mlCas12a进行酶切鉴定和测序鉴定。

分别使用Asc I或NotI单酶切和Asc I或NotI双酶切进行酶切鉴定。实验结果表明，所有实验组的酶切产物大小均为与预期相符，因而可初步判断我们得到的载体为正确的pET-28a-mlCas12a载体。

另外，测序结果也表明mlCas12a序列被正确地克隆至pET28a。

4、mlCas12a蛋白的原核表达

（1）将鉴定正确的重组质粒pET-28a-mlCas12a转化至BL21（DE3）表达菌株（购于Transgen公司）中。经过阳性鉴定获得重组菌。

（2）挑取重组菌的单克隆至50mL LB培养基中37℃培养过夜。按照1：100的接种量，将过夜菌种接种至1L LB培养基中37℃培养至OD600=0.6，冰水浴30min，加IPTG至终浓度为0.5mM，于15℃继续培养4h。离心收集菌体于-80℃保存。

5、检测并优化mlCas12a蛋白表达

将重组质粒pET-28a-mlCas12a转入BL21（DE3）中，在37℃以0.2mM诱导蛋白表达，并对裂解后沉淀和上清进行电泳分析。（如附图3所示）。

实施例3 mlCas12a蛋白的纯化

1、mlCas12a蛋白的纯化方法

诱导表达后的菌液进行离心，将菌体重悬于裂解缓冲液中，进行超声破碎（70%振幅，2s On/4s Off，3分钟，Sonics 750w超声仪），离心分离上清液。将蛋白裂解上清上样至平衡后的Ni Sepharose FF，以大于30倍柱床体积的裂解缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱缓冲液进行洗脱，以Superdex 200，Tricorn 10/300凝胶色谱柱进行纯化。洗脱后进行SDS-PAGE分析观察结果以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas12a蛋白。其中，裂解缓冲液包含50mMTris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、5%甘油、20mM咪唑。洗脱缓冲液包含50mM Tris-HCl、pH8.0300mM NaCl、5%甘油、250mM咪唑。

得到的蛋白以50mM Tris-HCl pH8.0 300mM NaCl5%甘油稀释三倍，并以30kDa超滤管浓缩。添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃。

2、mlCas12a蛋白纯化结果

在优化纯化步骤后再次进行大量纯化，目的条带约为130kDa。如附图4所示，可见纯化的纯度及产量较高。

本发明mlCas12a纯化方案简化了TEV切割标签步骤，大幅精简了纯化流程和纯化成本，同时，该方法能确保蛋白活性。

实施例4 基于CRISPR/Cas12a体系对mlCas12a的活性检测

1、制备靶标核酸片段

靶标核酸片段可经过PCR扩增、重组酶聚合酶扩增（RPA）， NASBA 等温扩增或环介导等温扩增（LAMP）、链置换扩增（SDA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）和切口酶扩增反应（NEAR）方式扩增靶标核酸片段。

重组酶聚合酶扩增RPA（Recombinase Polymerase Amplification）：采用NCBIPrimer blast 设计RPA引物，扩增片段大小为80-120nt，引物的变性温度可为54-67℃、Opt=60，长度为30-35nt，引物中GC含量为40-60%，根据设计序列合成DNA引物。

模板序列（SEQ ID NO.4）：

TTATCTTAAAAAATTACAGGATATTTATAAGAAGCTTGAGGGTCACCCCTTTCTTTTTAGTCCGTCGAAAACCAATGAAAAAGAGTTTATTACTCTGCTAAACCAAGCCTTGGCCTCGACGCAGCTTTACCGCAGCATACAACAGCTGTTTTTAACGATGTATAAGCTAGATCCCATTGGGTTTGTTAACTATATTAAAGCGAGTAAACAAGAGTATTTATGTCTGTTGATTAATCCTAAACTAGTCACTAAGTTTTTAAAAATAACGAGCTTTAAAATTTACATTAATTTCAGGCTAAAAACTTTCTATATAAGTCCTAATAA

引物序列：

上游引物（SEQ ID NO.8）：TACTCTGCTAAACCAAGCCTTGGCCTCGAC

下游引物（SEQ ID NO.9）：CTCTTGTTTACTCGCTTTAATATAGTTAAC

分别参考TwistAmp® Basic和 TwistAmp® BasicRT (TwistDx)试剂盒进行RPA反应，不同的是，在模板片段加入之前，先加入280mM的MgAc，即乙酸镁。在37℃下反应30分钟。

反应完成后的产物使用胶分离以及纯化（采用MinElute gel extraction kit(Qiagen) 试剂盒），纯化后的dsDNA从而获得靶标产物。

2、gRNA设计

gRNA引物序列设计原则：选取靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列；且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。可通过http://www.rgenome.net/cas-designer/ 在线软件辅助设计。

mlCas12a蛋白识别，不需要tracrRNA,只需要crRNA，其gRNA设计只需要crRNA框架和靶标序列即可。

gRNA结构为：“GTCTAATATCAATATTCAATTTCTACTTTCGTAGAT”—“靶标序列”。

其中“GTCTAATATCAATATTCAATTTCTACTTTCGTAGAT”序列可替换为“TCAATTTCTACTTTCGTAGAT”，可替换为“GTCTAACGACCTTTTAAATTTCTACTGTTTGTAGAT”可替换为“TAAATTTCTACTGTTTGTAGAT”。

靶标gRNA序列（SEQ ID NO.5）：TAATTTCTACTAAGTGTAGATACGATGTATAAGCTAGATCC

设计含T7启动子的引物进行扩增双链DNA。参照T7 RNA Polymerase（Thermo）试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再使用RNeasy minikit（Qiagen），获得纯化的gRNAs。（如附图5所示）

3、mlCas12a活性检测

检测体系包括：2μl RPA产物，45nM 纯化的mlCas12a，22.5nM gRNA， 100nM在mlCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QCSystem Thermo Scientific)，0.5μl RNase抑制剂(Promega)，及检测缓冲液(20 mM Tris,60 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ , pH 7.3)。同时设置CRISPR/LbCas12a体系作为对照组，检测体系包括2μl RPA产物，45nM 纯化的LbCas12a，22.5nM gRNA，100nM在mlCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QC System ThermoScientific)，0.5μl RNase抑制剂(Promega)，及检测缓冲液(20 mM Tris, 60 mM NaCl,10 mM MgCl₂ , pH 7.3)

反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，在37℃（除非另有说明）下反应1-3小时，荧光动力检测5分钟一次。

检测结果如图6所示，mlCas12a也具有与LbCas12a相同的在gRNA介导下对靶标序列进行特异性识别并具有非特异单链DNA的切割活性。

实施例5 CRISPR/mlCas12a体系配对的gRNA框架序列筛选

在CRISPR/mlCas12a体系中，与mlCas12a蛋白配套的gRNA序列至关重要，是mlCas12a蛋白能够特异性识别靶标序列的基础。gRNA包括与mlCas12a蛋白相互作用的框架核酸片段，以及与靶核酸结合的特异性核酸片段。如何寻找和确认与mlCas12a蛋白适配的gRNA的框架核酸序列，是搭建CRISPR/mlCas12a技术平台的关键。

本专利中，研发团队利用生物信息学的方法筛选mlCas12a蛋白gRNA的框架核酸序列，首先在结膜炎摩拉克氏菌（Moraxella lacunata）菌株的基因组序列中，分别在“NCTC10359_01020”基因的上游和下游2000-5000bp范围内寻找短片段重复序列，根据重复序列的长度及重复次数进行片段筛选；同时本研发团队还比对了与结膜炎摩拉克氏菌Moraxella lacunata近源的基因组序列，从中找到与编码mlCas12a蛋白“NCTC10359_01020”基因高度同源的基因序列，以同样的方式寻找可能短片段重复序列，筛选出的这些短片段重复序列可以做为mlCas12a蛋白gRNA的框架核酸序列。共筛选出10条候选的框架核酸序列，其序列信息如下：

框架序列1（SEQ ID NO.10）：GTCTAATATCAATATTCAATTTCTACTTTCGTAGAT

框架序列2（SEQ ID NO.11）：AATATCAATATTCAATTTCTACTTTCGTAGAT

框架序列3（SEQ ID NO.12）：TCAATTTCTACTTTCGTAGAT

框架序列4（SEQ ID NO.13）：GTCTAACGACCTTTTAAATTTCTACTGTTTGTAGAT

框架序列5（SEQ ID NO.14）：ACGACCTTTTAAATTTCTACTGTTTGTAGAT

框架序列6（SEQ ID NO.15）：TAAATTTCTACTGTTTGTAGAT

框架序列7（SEQ ID NO.16）：ATCTACAAAAGTAGAAATGTGCTATCTGTATTTGAG

框架序列8（SEQ ID NO.17）：GTCTAATATCAATATTCAATTTCTACTTTCGTAGAT

框架序列9（SEQ ID NO.18）：TCAATTTCTACTTTCGTAGAT

框架序列10（SEQ ID NO.19）：GAAACTGTAAGCGGAATGTCTACT

mlCas12a蛋白的gRNA结构包括gRNA框架序列和靶标序列，将上述寻找到的“NCTC10359_01020”基因及其同源基因周围的短片段重复序列与我们要检测的靶标序列结合，就得到了gRNA序列。

研发团队通过大量生物信息学比对和序列筛选，设计了含T7启动子的引物进行扩增含有gRNA序列的双链DNA。参照T7 RNA Polymerase（Thermo）试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再使用RNeasy mini kit（Qiagen），获得纯化的gRNAs。然后按照实施例4中的mlCas12a活性检测方法验证所筛选出的gRNA框架序列与mlCas12a蛋白是否匹配。

通过系列的实验，筛选结果如图7所示，筛选出6条与mlCas12a蛋白适配的gRNA框架序列，分别为框架序列1（SEQ ID NO.10）、框架序列2（SEQ ID NO.11）、框架序列3（SEQ IDNO.12）、框架序列4（SEQ ID NO.13）、框架序列5（SEQ ID NO.14）、框架序列6（SEQ IDNO.15）。

通过生信分析和生物学实验验证，我们发现与mlCas12a蛋白适配的gRNA框架序列长度在20-36bp之间，其中框架序列的核心区域20-25bp，围绕核心区域进行截短设计均在本专利覆盖范围内。

实施例6 基于CRISPR/mlCas12a的核酸检测特异性

1、制备靶标核酸片段

按照实施例4的方法，分别参考TwistAmp® Basic和 TwistAmp® BasicRT (TwistDx)试剂盒，将靶标核酸、4个非靶标核酸加入RPA体系，在37℃下反应30分钟。

2、CRISPR/mlCas12a检测

检测体系包括：2μl RPA产物，45nM 纯化的mlCas12a，22.5nM gRNA，100nM在mlCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QCSystem Thermo Scientific)，0.5μl RNase抑制剂(Promega)，及检测缓冲液(20 mM Tris,60 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ , pH 7.3)。

结果分析：为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光（无靶核苷酸或无gRNA的条件下）会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。

检测结果如图8所示，CRISPR/mlCas12a体系具有良好的反应特异性。

序列表

<110> 广州美格生物科技有限公司

<120> 新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1261

<212> PRT

<213> mlCas12a氨基酸序列(SEQ ID NO.1)

<400> 1

Met Leu Phe Gln Asp Phe Thr His Leu Tyr Pro Leu Ser Lys Thr Val

1 5 10 15

Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Leu Glu His Ile His Ala

20 25 30

Lys Asn Phe Leu Ser Gln Asp Lys Thr Met Ala Asp Met Tyr Gln Lys

35 40 45

Val Lys Ala Ile Leu Asp Asp Tyr His Arg Asp Phe Ile Ala Asp Met

50 55 60

Met Gly Glu Val Lys Leu Thr Lys Leu Ala Glu Phe Cys Asp Val Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Phe Arg Lys Asn Pro Lys Asp Asp Gly Leu Gln Lys Gln Leu

85 90 95

Lys Asp Leu Gln Ala Val Leu Arg Lys Glu Ile Val Lys Pro Ile Gly

100 105 110

Asn Gly Gly Lys Tyr Lys Val Gly Tyr Asp Arg Leu Phe Gly Ala Lys

115 120 125

Leu Phe Lys Asp Gly Lys Glu Leu Gly Asp Leu Ala Lys Phe Val Ile

130 135 140

Ala Gln Glu Ser Glu Ser Ser Pro Lys Leu Pro Gln Ile Ala His Phe

145 150 155 160

Glu Lys Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Gly Phe His Asp Asn Arg Lys Asn

165 170 175

Met Tyr Ser Ser Asp Asp Lys His Thr Ala Ile Ala Tyr Arg Leu Ile

180 185 190

His Glu Asn Leu Pro Arg Phe Ile Asp Asn Leu Gln Ile Leu Ala Thr

195 200 205

Ile Lys Gln Lys His Ser Ala Leu Tyr Asp Gln Ile Ala Ser Glu Leu

210 215 220

Thr Ala Ser Gly Leu Asp Val Ser Leu Ala Ser His Leu Gly Gly Tyr

225 230 235 240

His Lys Leu Leu Thr Gln Glu Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Arg Ile Ile

245 250 255

Gly Glu Val Asn Ser Tyr Thr Asn Lys His Asn Gln Ile Cys His Lys

260 265 270

Ser Glu Arg Ile Ala Lys Leu Arg Pro Leu His Lys Gln Ile Leu Ser

275 280 285

Asp Gly Met Gly Val Ser Phe Leu Pro Ser Lys Phe Ala Asp Asp Ser

290 295 300

Glu Met Cys Gln Ala Val Asn Glu Phe Tyr Arg His Tyr Ala Asp Val

305 310 315 320

Phe Ala Lys Val Gln Ser Leu Phe Asp Arg Phe Asp Asp Tyr Gln Lys

325 330 335

Asp Gly Ile Tyr Val Glu His Lys Asn Leu Asn Glu Leu Ser Lys Arg

340 345 350

Ala Phe Gly Asp Phe Gly Phe Leu Lys Arg Phe Leu Glu Glu Tyr Tyr

355 360 365

Ala Asp Val Ile Asp Pro Glu Phe Asn Glu Lys Phe Ala Lys Thr Glu

370 375 380

Pro Asp Ser Asp Glu Gln Lys Lys Leu Ala Gly Glu Lys Asp Lys Phe

385 390 395 400

Val Lys Gly Val His Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gln Val Ile Glu Tyr

405 410 415

Tyr Thr Ala Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Val Gln Ala Asp Lys Leu Gly

420 425 430

Gln Tyr Phe Lys His Arg Leu Ala Gly Val Asp Asn Pro Ile Gln Lys

435 440 445

Ile His Asn Ser His Ser Thr Ile Lys Gly Phe Leu Glu Arg Glu Arg

450 455 460

Pro Ala Gly Glu Arg Ala Leu Pro Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Pro

465 470 475 480

Glu Met Thr Gln Leu Arg Gln Leu Lys Glu Leu Leu Asp Asn Ala Leu

485 490 495

Asn Val Val His Phe Ala Lys Leu Val Ser Thr Glu Thr Val Leu Asp

500 505 510

Thr Arg Ser Asp Lys Phe Tyr Gly Glu Phe Arg Pro Leu Tyr Val Glu

515 520 525

Leu Ala Lys Ile Thr Thr Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asp Tyr Leu Ser

530 535 540

Gln Lys Pro Phe Ser Thr Glu Lys Tyr Lys Leu Asn Phe Gly Asn Pro

545 550 555 560

Thr Leu Leu Asn Gly Trp Asp Leu Asn Lys Glu Lys Asp Asn Phe Gly

565 570 575

Val Ile Leu Gln Lys Asp Gly Cys Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Asp Lys

580 585 590

Ala His Lys Lys Val Phe Asp Asn Ala Pro Asn Thr Gly Lys Ser Val

595 600 605

Tyr Gln Lys Met Val Tyr Lys Gln Ile Ala Asn Ala Arg Arg Asp Leu

610 615 620

Ala Cys Leu Leu Ile Ile Asn Gly Lys Val Val Arg Lys Thr Lys Gly

625 630 635 640

Leu Asp Asp Leu Arg Glu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asp Ile Tyr Lys Ile

645 650 655

Tyr Gln Ser Glu Ser Tyr Lys Val Leu Ser Pro Asn Phe Asn His Gln

660 665 670

Asp Leu Val Lys Tyr Ile Asp Tyr Asn Lys Ile Leu Ala Ser Gly Tyr

675 680 685

Phe Glu Tyr Phe Asp Phe Arg Phe Lys Glu Ser Ser Glu Tyr Lys Ser

690 695 700

Tyr Lys Glu Phe Leu Asp Asp Val Asp Asn Cys Gly Tyr Lys Ile Ser

705 710 715 720

Phe Cys Asn Ile Asn Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Leu Val Glu Gln Gly

725 730 735

Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Pro Lys Ala

740 745 750

His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Lys Ala Leu Phe Ser

755 760 765

Glu Asp Asn Leu Ala Asn Pro Ile Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Gln

770 775 780

Ile Phe Tyr Arg Lys Ala Ser Leu Asp Met Asn Glu Thr Thr Ile His

785 790 795 800

Arg Ala Gly Glu Val Leu Glu Asn Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Gln

805 810 815

Arg Gln Phe Val Tyr Asp Ile Ile Lys Asp Lys Arg Tyr Thr Gln Asp

820 825 830

Lys Phe Met Leu His Val Pro Ile Thr Met Asn Phe Gly Val Gln Gly

835 840 845

Met Thr Ile Glu Gly Phe Asn Lys Lys Val Asn Gln Ser Ile Gln Gln

850 855 860

Tyr Asp Asp Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu

865 870 875 880

Leu Tyr Leu Thr Val Ile Asn Ser Lys Gly Glu Ile Leu Glu Gln Arg

885 890 895

Ser Leu Asn Asp Ile Ile Thr Thr Ser Ala Asn Gly Thr Gln Met Thr

900 905 910

Thr Pro Tyr His Lys Ile Leu Asn Lys Lys Lys Glu Gly Arg Leu Gln

915 920 925

Ala Arg Lys Asp Trp Gly Glu Ile Glu Thr Ile Lys Glu Leu Lys Ala

930 935 940

Gly Tyr Leu Ser His Val Val His Gln Ile Ser Gln Leu Met Leu Lys

945 950 955 960

Tyr Asn Ala Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys Arg

965 970 975

Gly Arg Leu Lys Val Glu Asn Gln Val Tyr Gln Asn Phe Glu Asn Ala

980 985 990

Leu Ile Lys Lys Leu Asn His Leu Val Leu Lys Asp Lys Thr Asp Asp

995 1000 1005

Glu Ile Gly Ser Tyr Lys Asn Ala Leu Gln Leu Thr Asn Asn Phe Thr

1010 1015 1020

Asp Leu Lys Ser Ile Gly Lys Gln Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro

1025 1030 1035 1040

Ala Arg Asn Thr Ser Lys Ile Asp Pro Glu Thr Gly Phe Val Asp Leu

1045 1050 1055

Leu Lys Pro Arg Tyr Glu Asn Ile Thr Gln Ser Gln Ala Phe Phe Gly

1060 1065 1070

Lys Phe Asp Lys Ile Cys Tyr Asn Thr Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe

1075 1080 1085

His Ile Asp Tyr Ala Lys Phe Thr Asp Glu Ala Lys Asn Ser Arg Gln

1090 1095 1100

Thr Trp Val Ile Cys Ser His Gly Asp Lys Arg Tyr Val Tyr Asn Lys

1105 1110 1115 1120

Thr Ala Asn Gln Asn Lys Gly Ala Thr Lys Gly Ile Asn Val Asn Asp

1125 1130 1135

Glu Leu Lys Ser Leu Phe Ala Cys His His Ile Asn Asp Lys Gln Pro

1140 1145 1150

Asn Leu Val Met Asp Ile Cys Gln Asn Asn Asp Lys Glu Phe His Lys

1155 1160 1165

Ser Leu Met Tyr Leu Leu Lys Ala Leu Leu Ala Leu Arg Tyr Ser Asn

1170 1175 1180

Ala Asn Ser Asp Glu Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Ala Asn Asp Glu

1185 1190 1195 1200

Gly Val Phe Phe Asn Ser Ala Leu Ala Asp Asp Thr Gln Pro Gln Asn

1205 1210 1215

Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Val

1220 1225 1230

Leu Glu Gln Ile Lys Asn Ser Asp Asp Leu Asp Lys Val Asp Leu Glu

1235 1240 1245

Ile Lys Asp Asp Glu Trp Arg Asn Phe Ala Gln Asn Arg

1250 1255 1260

<210> 2

<211> 3786

<212> DNA

<213> mlCas12a基因序列(SEQ ID NO.2)

<400> 2

atgttatttc aagactttac tcatttatat cccctatcaa aaaccgtgcg ttttgaatta 60

aagcccattg gcaagacatt agagcatatc catgccaaaa actttttgag ccaagataag 120

accatggcgg acatgtacca aaaggtgaag gcgatactgg acgattatca tcgtgatttt 180

atcgctgata tgatgggcga agttaagcta actaagctgg cagaattttg tgatgtgtat 240

ttaaaattta gaaaaaatcc caaagacgat ggattgcaaa aacagctaaa ggacttgcaa 300

gcagttttaa gaaaagagat tgtgaagccc atcggtaatg gcggaaaata caaggtgggt 360

tatgaccgct tatttggggc aaagctcttt aaggacggca aagagcttgg tgatttggcg 420

aaatttgtca tcgcccaaga gagcgagtca tcacccaagc ttccccaaat tgcccatttt 480

gagaagttta gcacctactt tactggcttt catgacaacc gcaaaaacat gtacagcagt 540

gatgataagc ataccgccat tgcctatcgt ctgattcatg aaaatttgcc acgttttatc 600

gataatctac aaatattggc aaccatcaaa caaaagcatt cggcattgta tgatcagatt 660

gcaagtgaac tgactgcaag tggtttggat gtgtcgctag caagtcatct gggcggctat 720

cacaagcttt taacccaaga gggtatcacg gcttataata ggataatagg tgaagtgaat 780

agttatacga ataagcataa tcaaatttgc cacaaatccg aacgtatcgc caaattacgc 840

cccctgcaca aacaaatcct aagcgacggc atgggcgtgt cgtttttgcc aagcaaattt 900

gccgatgata gcgagatgtg tcaagcggtc aatgagtttt accgccatta tgctgatgtt 960

tttgctaagg tgcaaagctt atttgataga tttgatgact atcaaaagga cggcatttat 1020

gttgaacata aaaatctaaa tgagctatct aagcgagcat ttggtgattt tgggttttta 1080

aaacgattct tagaggagta ttatgcagat gtgattgacc cagagtttaa tgagaaattc 1140

gccaagaccg agcctgatag cgacgaacaa aaaaaactgg caggagaaaa agacaaattc 1200

gttaaaggcg tacattcctt ggcaagtctt gaacaggtga ttgagtatta taccgctggg 1260

tatgatgatg agtctgtaca agcagacaaa cttgggcagt atttcaaaca ccgtctggca 1320

ggcgtggata atccaatcca aaaaatacac aacagtcaca gtaccattaa ggggtttttg 1380

gagcgtgaac gtccagcagg cgagcgagca ttgcccaaaa ttaagtcaga taaaagtcct 1440

gaaatgacac aattaagaca actaaaagag ctactagaca acgccttaaa cgtggtgcat 1500

tttgctaagc tggtgtcgac cgaaaccgta ttagacactc gaagtgataa attttatggc 1560

gaatttagac ctttatatgt tgagcttgcc aagattacca cactttataa caaagtgcgt 1620

gattatctgt cgcaaaagcc atttagcacc gaaaaatata aattaaactt tggcaatccg 1680

acattattaa acggttggga tttgaataaa gaaaaagata attttggggt tatcttacaa 1740

aaagacggct gttattattt ggcgttattg gataaagctc ataaaaaagt atttgataat 1800

gctccaaata caggtaaaag cgtttatcaa aaaatggttt ataagcaaat agcaaatgct 1860

cgacgggact tagcttgttt attgattatt aatggtaagg tagttagaaa aacaaaagga 1920

ttggatgatt tacgtgagaa atatttacca tacgatattt ataaaattta tcaatccgag 1980

agctataagg ttttatcgcc aaattttaat catcaagact tggttaaata tattgattat 2040

aacaaaattt tagcatcggg atattttgag tattttgatt ttaggtttaa agaaagctct 2100

gaatataaga gctataaaga atttttggat gatgtagata actgtggtta taaaataagt 2160

ttttgtaata taaacgccga ttatattgat gagttggttg agcagggtca gttgtattta 2220

ttccagattt ataataaaga tttctcgccc aaggctcacg gtaagcccaa tttgcatact 2280

ttgtatttta aggcattatt tagtgaagat aatcttgcca atccgattta taagttaaat 2340

ggcgaggcac agatatttta tcgcaaggcg tctttggata tgaatgaaac caccattcat 2400

cgtgcaggcg aggtattaga aaataaaaat cccgataatc ccaaacagcg tcaatttgtc 2460

tatgacatca tcaaagacaa acgttatacc caagataagt ttatgctaca tgtgcctatt 2520

accatgaatt ttggtgtgca gggcatgacg attgaaggat ttaataaaaa agttaatcaa 2580

agcatacaac aatatgatga tgtgaatgtg attggcatag accgtggcga gcgacatctg 2640

ctatatctga ccgtgattaa cagcaaaggt gaaatcttag aacagcgtag tctcaatgac 2700

atcatcacca catcagcaaa cggcacacaa atgaccacgc cttatcataa aatcctaaat 2760

aaaaagaaag aagggcgttt gcaggctcgt aaggattggg gtgagattga aaccattaaa 2820

gagctaaaag caggctatct aagccatgtg gtacatcaaa tcagccagct tatgcttaaa 2880

tataatgcca ttgtggtgtt ggaagatttg aattttggat ttaagcgtgg tcgcctgaaa 2940

gtggagaatc aggtttatca aaactttgaa aacgccttaa tcaaaaagct aaaccatttg 3000

gtattaaaag ataagacaga tgatgagatt ggctcatata aaaatgccct gcaattgacc 3060

aataatttta ctgacctaaa aagcattggc aaacaaacgg gatttttatt ctatgtgcct 3120

gcacggaata ccagtaaaat agaccctgaa acgggctttg tggatttgtt aaaaccacgt 3180

tatgaaaata tcactcagtc gcaagcgttt tttggtaaat ttgataagat ttgttataac 3240

acagataagg gttattttga atttcatatt gattatgcca aattcactga cgaagccaaa 3300

aactctcgcc aaacatgggt catttgctcg catggcgata aacgctatgt gtataacaaa 3360

accgccaacc aaaataaagg ggcgaccaag ggtattaatg ttaatgatga attaaaatcg 3420

ctatttgctt gtcatcacat caatgacaaa cagccaaatc tggtcatgga tatttgccaa 3480

aataacgata aagaatttca taaatcgcta atgtatctgt taaaggcatt gcttgcatta 3540

cgatatagta acgccaatag cgatgaagat tttattttat cgcctgtggc aaatgatgag 3600

ggtgtgtttt ttaattcggc attggcggat gatacacagc cacaaaatgc ggacgccaat 3660

ggggcatatc atatcgcatt aaagggtttg tgggtactag aacaaatcaa aaacagcgat 3720

gatttggata aagttgatct cgaaattaaa gatgacgaat ggcgaaactt tgctcaaaac 3780

cgctaa 3786

<210> 3

<211> 3786

<212> DNA

<213> 优化后的mlCas12a基因序列(SEQ ID NO.3)

<400> 3

atgctgtttc aggattttac ccatctgtat ccgctgagca aaaccgtgcg ctttgaactg 60

aaaccgattg gcaaaaccct ggaacatatt catgcgaaaa actttctgag ccaggataaa 120

accatggcgg atatgtatca gaaagtgaaa gcgattctgg atgattatca tcgcgatttt 180

attgcggata tgatgggcga agtgaaactg accaaactgg cggaattttg cgatgtgtat 240

ctgaaatttc gcaaaaaccc gaaagatgat ggcctgcaga aacagctgaa agatctgcag 300

gcggtgctgc gcaaagaaat tgtgaaaccg attggcaacg gcggcaaata taaagtgggc 360

tatgatcgcc tgtttggcgc gaaactgttt aaagatggca aagaactggg cgatctggcg 420

aaatttgtga ttgcgcagga aagcgaaagc agcccgaaac tgccgcagat tgcgcatttt 480

gaaaaattta gcacctattt taccggcttt catgataacc gcaaaaacat gtatagcagc 540

gatgataaac ataccgcgat tgcgtatcgc ctgattcatg aaaacctgcc gcgctttatt 600

gataacctgc agattctggc gaccattaaa cagaaacata gcgcgctgta tgatcagatt 660

gcgagcgaac tgaccgcgag cggcctggat gtgagcctgg cgagccatct gggcggctat 720

cataaactgc tgacccagga aggcattacc gcgtataacc gcattattgg cgaagtgaac 780

agctatacca acaaacataa ccagatttgc cataaaagcg aacgcattgc gaaactgcgc 840

ccgctgcata aacagattct gagcgatggc atgggcgtga gctttctgcc gagcaaattt 900

gcggatgata gcgaaatgtg ccaggcggtg aacgaatttt atcgccatta tgcggatgtg 960

tttgcgaaag tgcagagcct gtttgatcgc tttgatgatt atcagaaaga tggcatttat 1020

gtggaacata aaaacctgaa cgaactgagc aaacgcgcgt ttggcgattt tggctttctg 1080

aaacgctttc tggaagaata ttatgcggat gtgattgatc cggaatttaa cgaaaaattt 1140

gcgaaaaccg aaccggatag cgatgaacag aaaaaactgg cgggcgaaaa agataaattt 1200

gtgaaaggcg tgcatagcct ggcgagcctg gaacaggtga ttgaatatta taccgcgggc 1260

tatgatgatg aaagcgtgca ggcggataaa ctgggccagt attttaaaca tcgcctggcg 1320

ggcgtggata acccgattca gaaaattcat aacagccata gcaccattaa aggctttctg 1380

gaacgcgaac gcccggcggg cgaacgcgcg ctgccgaaaa ttaaaagcga taaaagcccg 1440

gaaatgaccc agctgcgcca gctgaaagaa ctgctggata acgcgctgaa cgtggtgcat 1500

tttgcgaaac tggtgagcac cgaaaccgtg ctggataccc gcagcgataa attttatggc 1560

gaatttcgcc cgctgtatgt ggaactggcg aaaattacca ccctgtataa caaagtgcgc 1620

gattatctga gccagaaacc gtttagcacc gaaaaatata aactgaactt tggcaacccg 1680

accctgctga acggctggga tctgaacaaa gaaaaagata actttggcgt gattctgcag 1740

aaagatggct gctattatct ggcgctgctg gataaagcgc ataaaaaagt gtttgataac 1800

gcgccgaaca ccggcaaaag cgtgtatcag aaaatggtgt ataaacagat tgcgaacgcg 1860

cgccgcgatc tggcgtgcct gctgattatt aacggcaaag tggtgcgcaa aaccaaaggc 1920

ctggatgatc tgcgcgaaaa atatctgccg tatgatattt ataaaattta tcagagcgaa 1980

agctataaag tgctgagccc gaactttaac catcaggatc tggtgaaata tattgattat 2040

aacaaaattc tggcgagcgg ctattttgaa tattttgatt ttcgctttaa agaaagcagc 2100

gaatataaaa gctataaaga atttctggat gatgtggata actgcggcta taaaattagc 2160

ttttgcaaca ttaacgcgga ttatattgat gaactggtgg aacagggcca gctgtatctg 2220

tttcagattt ataacaaaga ttttagcccg aaagcgcatg gcaaaccgaa cctgcatacc 2280

ctgtatttta aagcgctgtt tagcgaagat aacctggcga acccgattta taaactgaac 2340

ggcgaagcgc agatttttta tcgcaaagcg agcctggata tgaacgaaac caccattcat 2400

cgcgcgggcg aagtgctgga aaacaaaaac ccggataacc cgaaacagcg ccagtttgtg 2460

tatgatatta ttaaagataa acgctatacc caggataaat ttatgctgca tgtgccgatt 2520

accatgaact ttggcgtgca gggcatgacc attgaaggct ttaacaaaaa agtgaaccag 2580

agcattcagc agtatgatga tgtgaacgtg attggcattg atcgcggcga acgccatctg 2640

ctgtatctga ccgtgattaa cagcaaaggc gaaattctgg aacagcgcag cctgaacgat 2700

attattacca ccagcgcgaa cggcacccag atgaccaccc cgtatcataa aattctgaac 2760

aaaaagaaag aaggccgcct gcaggcgcgc aaagattggg gcgaaattga aaccattaaa 2820

gaactgaaag cgggctatct gagccatgtg gtgcatcaga ttagccagct gatgctgaaa 2880

tataacgcga ttgtggtgct ggaagatctg aactttggct ttaaacgcgg ccgcctgaaa 2940

gtggaaaacc aggtgtatca gaactttgaa aacgcgctga ttaaaaaact gaaccatctg 3000

gtgctgaaag ataaaaccga tgatgaaatt ggcagctata aaaacgcgct gcagctgacc 3060

aacaacttta ccgatctgaa aagcattggc aaacagaccg gctttctgtt ttatgtgccg 3120

gcgcgcaaca ccagcaaaat tgatccggaa accggctttg tggatctgct gaaaccgcgc 3180

tatgaaaaca ttacccagag ccaggcgttt tttggcaaat ttgataaaat ttgctataac 3240

accgataaag gctattttga atttcatatt gattatgcga aatttaccga tgaagcgaaa 3300

aacagccgcc agacctgggt gatttgcagc catggcgata aacgctatgt gtataacaaa 3360

accgcgaacc agaacaaagg cgcgaccaaa ggcattaacg tgaacgatga actgaaaagc 3420

ctgtttgcgt gccatcatat taacgataaa cagccgaacc tggtgatgga tatttgccag 3480

aacaacgata aagaatttca taaaagcctg atgtatctgc tgaaagcgct gctggcgctg 3540

cgctatagca acgcgaacag cgatgaagat tttattctga gcccggtggc gaacgatgaa 3600

ggcgtgtttt ttaacagcgc gctggcggat gatacccagc cgcagaacgc ggatgcgaac 3660

ggcgcgtatc atattgcgct gaaaggcctg tgggtgctgg aacagattaa aaacagcgat 3720

gatctggata aagtggatct ggaaattaaa gatgatgaat ggcgcaactt tgcgcagaac 3780

cgctaa 3786

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 靶标序列(SEQ ID NO.4)

<400> 4

ttatcttaaa aaattacagg atatttataa gaagcttgag ggtcacccct ttctttttag 60

tccgtcgaaa accaatgaaa aagagtttat tactctgcta aaccaagcct tggcctcgac 120

gcagctttac cgcagcatac aacagctgtt tttaacgatg tataagctag atcccattgg 180

gtttgttaac tatattaaag cgagtaaaca agagtattta tgtctgttga ttaatcctaa 240

actagtcact aagtttttaa aaataacgag ctttaaaatt tacattaatt tcaggctaaa 300

aactttctat ataagtccta ataa 324

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> gRNA序列(SEQ ID NO.5)

<400> 5

taatttctac taagtgtaga tacgatgtat aagctagatc c 41

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> PCR上游引物序列(SEQ ID NO.6)

<400> 6

atgttatttc aagactttac tca 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> PCR下游引物序列(SEQ ID NO.7)

<400> 7

ttagcggttt tgagcaaagt ttcg 24

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA上游引物序列(SEQ ID NO.8)

<400> 8

tactctgcta aaccaagcct tggcctcgac 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> RPA下游引物序列(SEQ ID NO.9)

<400> 9

ctcttgttta ctcgctttaa tatagttaac 30

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.10)

<400> 10

gtctaatatc aatattcaat ttctactttc gtagat 36

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.11)

<400> 11

aatatcaata ttcaatttct actttcgtag at 32

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.12)

<400> 12

tcaatttcta ctttcgtaga t 21

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.13)

<400> 13

gtctaacgac cttttaaatt tctactgttt gtagat 36

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.14)

<400> 14

acgacctttt aaatttctac tgtttgtaga t 31

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.15)

<400> 15

taaatttcta ctgtttgtag at 22

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.16)

<400> 16

atctacaaaa gtagaaatgt gctatctgta tttgag 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.17)

<400> 17

gtctaatatc aatattcaat ttctactttc gtagat 36

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.18)

<400> 18

tcaatttcta ctttcgtaga t 21

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> gRNA框架序列(SEQ ID NO.19)

<400> 19

gaaactgtaa gcggaatgtc tact 24

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统，其特征在于，包括mlCas12a蛋白和gRNA；

所述mlCas12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述mlCas12a蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；

所述gRNA包括a)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b)与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO.10～15中至少一种所示。

2.如权利要求1所述的核酸检测系统，当靶核酸如SEQ ID NO.4所示时，gRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。

3.一种基于权利要求1或2所述系统的非疾病诊断的核酸检测方法，其特征在于，利用所述的mlCas12a蛋白和gRNA进行CRISPR核酸检测。

4.一种基于权利要求1或2所述系统的非疾病诊断的核酸检测方法，其特征在于，核酸检测最终结果的获取通过可视化方法实现，所述可视化方法为基于所述mlCas12a蛋白附属切割活性的荧光信号检测方式、所述mlCas12a蛋白附属切割活性的其他信号检测方式、基于所述mlCas12a附属切割活性的胶体金侧向层析方式中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的非疾病诊断的核酸检测方法，其特征在于，所述mlCas12a蛋白附属切割活性的荧光信号检测方式为通过mlCas12a的附属切割活性切割标记了荧光基团与淬灭基团的报告DNA链后，反应体系置于荧光分析仪中检测荧光信号；或通过所述mlCas12a的附属切割活性切割标记了生物素、荧光基团、地高辛或其他基团的核酸片段后，反应体系通过胶体金侧向层析方式实现核酸产物检测；或通过所述mlCas12a的附属切割活性切割聚集化的标记有寡核苷酸的胶体金颗粒，使胶体金颗粒颜色发生变化，记录颜色变化实现检测。

6.权利要求1或2所述的核酸检测系统在制备的下述任一工具中的应用：

a)在制备DNA切割工具方面试剂盒中的应用；

b)在制备核酸检测工具方面试剂盒中的应用；

c)在制备基于CRISPR/Cas12a的核酸检测工具方面试剂盒中的应用。