CN112760308A

CN112760308A - LdCsm-dCsm3突变型复合物、含该复合物的检测系统及其在RNA检测中的应用

Info

Publication number: CN112760308A
Application number: CN202011435126.3A
Authority: CN
Inventors: 佘群新; 于振霄; 冯旭; 冯明霞; 王媛
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN112760308B

Abstract

本发明提供LdCsm‑dCsm3突变型复合物、含该复合物的检测系统及其在RNA检测中的应用。本发明所述LdCsm‑dCsm3突变型复合物由Csm1～Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸。LdCsm‑dCsm3突变型复合物常温下的储存稳定性好，在克服Cas13a蛋白和Cas13a的crRNA的缺陷的同时，对于RNA检测具有检测特异性强，灵敏度高，对于来自非目标RNA的干扰的抗性强的优势，并且本发明crRNA可以与LdCsm‑dCsm3突变型复合物一起合成并与之牢固结合，不需要单独合成与纯化，在检测中不需要单独添加。

Description

LdCsm-dCsm3突变型复合物、含该复合物的检测系统及其在 RNA检测中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体涉及LdCsm-dCsm3突变型复合物、含该复合物的检测系统及其在RNA检测中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

疾病诊断对于减少疾病对人类的生命威胁，减少因治疗带来的经济损失至关重要。高效、便捷的诊断方式对于诊断和治疗疾病是不可或缺的。CRISPR-Cas(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR associated)系统是一种原核生物中的获得性免疫系统，Cas蛋白可以在小RNA介导下特异性的结合并降解外来的核酸，实现对外来感染的防御(Barrangou R et al.,2007；Horvath P et al.,2010)。根据标志性Cas蛋白的差异，不同CRISPR-Cas系统被划分为I～VI型。其中I，III，IV型RNP复合物含多种不同功能的Cas蛋白，归类为Class 1；而II，V，VI型只有单体多功能的Cas蛋白，归类为Class 2(Koonin E et al.,2017)。基于其中VI型系统的Cas蛋白Cas13a的免疫机理，已开发了一种RNA检测手段，利用被目标RNA特异性激活的Cas13a蛋白的“附属”Rnase核酸酶活性切割RNA荧光报告子，通过检测荧光信号的强度实现对目标RNA序列的检测(GootenbergJ et al.,2017)。

然而发明人发现这一技术仍有不足。首先，使用的产品Cas13a蛋白受非特异性RNA干扰的程度较大，对目标RNA的检测结果易受影响。Cas13a检测体系中除了用于产生检测信号的具有荧光集团标记和淬灭基团标记的RNA报告子，还有用于识别目标RNA的crRNA，以及被检测的RNA样品本身。当它们的浓度较高时，会影响Cas13a的“附属”Rnase核酸酶活性对RNA报告子的切割。当待测样品中非特异性RNA含量提高时，Cas13a检测体系释放的荧光信号强度也会明显降低。第二，Cas13a蛋白在常温下的稳定性不好，不能长时间保持活性，对运输过程中的冷冻条件要求较高，为了保持低温，运输配送过程中会产生额外的成本。

发明内容

为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种突变型的Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus(Ld)的III-A亚型Csm(LdCsm)复合物(以下简称LdCsm-dCsm3突变型复合物)，表达该复合物的系统，以及包含该复合物的检测系统和检测试剂盒，以及LdCsm-dCsm3突变型复合物、其表达系统，以及包含该复合物的检测系统和检测试剂盒在检测RNA中的应用，及检测RNA的方法。本发明的LdCsm-dCsm3突变型复合物常温下的储存稳定性好，能够替代现有方法中的Cas13a蛋白和Cas13a的crRNA，在克服Cas13a蛋白和Cas13a的crRNA的缺陷的同时，对于RNA检测具有检测特异性强，灵敏度高，对于来自非目标RNA的干扰的抗性强的优势，并且本发明crRNA可以与LdCsm-dCsm3突变型复合物一起合成并与之牢固结合，不需要单独合成与纯化，在检测中不需要单独添加。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种LdCsm-dCsm3突变型复合物，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)。

在本发明的一些实施方式中，Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的化学计量关系为Csm1₁2₃3₄4₁5₁:crRNA₁。

在本发明的一些实施方式中，Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的空间关系为Csm3(约4个)和Csm2(约3个)亚基沿crRNA形成双螺旋状的骨架，Csm1(约1个)亚基与Csm4(约1个)亚基结合在(1个)crRNA的5’端，Csm5(约1个)亚基结合在(同一个)crRNA的3’端。

在本发明的一些实施方式中，crRNA的长度为34～38个碱基，5’端前8个碱基序列为5’-ACGAGAAC-3’。其余碱基与需要检测的目标RNA匹配。

在本发明的一些实施方式中，所述复合物的分子量为317kDa。

在本发明的一些实施方式中，所述LdCsm-dCsm3突变型复合物通过三种质粒pUCE-X，p15AIE-Cas-Csm3^D34A和pET30a-Csm2在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达合成；其中，pUCE-X质粒中，X表示目标RNA。

在本发明的实施方式中，提供了pUCE-X质粒的构建方法其包括：(1)根据目标RNA选定Spacer；(2)Spacer与Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus CRISPR array的Repeat序列组成Repeat-Spacer单元，根据Repeat-Spacer单元设计重叠延伸引物；(3)引物通过重叠延伸获得有多个重复的Repeat-Spacer单元，将片段插入pUCE质粒获得表达crRNA的质粒pUCE-X。

在本发明的一些实施方式中，pUCE-X质粒的构建方法包括：

(1)根据目标RNA X选定Spacer。截取目标RNA的40个碱基作为Protospacer序列，保证这一段碱基序列3’下游的邻近序列不能与5’-ACGAGAAC-3’匹配。获得这40个碱基的反向互补DNA序列，即为目标RNA X的Spacer序列。将Spacer序列拼接到Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus CRISPR array的Repeat序列(Ld Repeat)的3’末端，即为新的“Repeat+Spacer单元”。比如，在本发明的一个实施方式中，如图1所示。

(2)设计重叠延伸引物。Spacer与Ld Repeat序列组成Repeat-Spacer单元，根据Repeat-Spacer单元设计重叠延伸引物Re-X-F，Re-X-R，X-R。三种引物各有部分序列分别与Ld Repeat序列和Spacer序列同源，互为底物进行重叠延伸，可以获得含多个Repeat-Spacer单元的重叠延伸产物。比如，在本发明的一个实施方式中，如图2所示。

(3)pUCE-X质粒的构建。重叠引物互为底物进行重叠延伸，获得有一系列含有不同数量“Repeat-Spacer单元”的重叠延伸产物。重叠延伸产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取含十个左右“Repeat-Spacer单元”的片段进行切胶回收。将回收的片段插入pUCE质粒的BglII位点，获得表达crRNA的质粒pUCE-X。

本发明的LdCsm-dCsm3突变型复合物在常温下具有较强的储存稳定性，对冷链的依赖性小，能够节省用于维持冷链的成本。比如在一些实施方式中，蛋白浓度1～1.3mg/ml的LdCsm-dCsm3突变型复合物产品可以在常温下7～14天内保持90％以上的活性，在常温下28天内保持60～70％的活性。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种表达系统用以表达合成LdCsm-dCsm3突变型复合物，该表达系统包括pUCE-X质粒、p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒和pET30a-Csm2质粒，以及利用该所述三种质粒获得的表达菌株。

其中，在本发明的实施方式中，pUCE-X质粒根据目标RNA序列设计并构建用于表达crRNA的前体；p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒用以表达Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基和用于处理crRNA前体的Cas6蛋白；pET30a-Csm2质粒用以表达带有His-tag的Csm2亚基，用于纯化LdCsm-dCsm3突变型复合物；在表达菌株中，经过Cas6蛋白处理(切割处理)的crRNA与Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基形成(组装成)完整的LdCsm-dCsm3突变型复合物。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种表达合成上述第一方面中所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物的方法，其采用上述第二方面中所述的表达系统，包括：将pUCE-X转入含有p15AIE-Cas-Csm3^D34A和pET30a-Csm2的表达菌株比如E.coli BL21(DE3)菌株中，经IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达前体crRNA，Cas6蛋白和Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5五种蛋白亚基。Cas6蛋白将前体crRNA切割为单体crRNA，单体crRNA与Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5五种蛋白亚基组装形成成熟的LdCsm-dCsm3突变型复合物。进一步地，诱导结束后，离心收集菌体，高压破碎细胞并收集破碎上清。破碎上清分别过His柱和分子筛进行纯化，即可获得LdCsm-dCsm3突变型复合物产品。

在本发明的一些实施方式中，合成的LdCsm-dCsm3突变型复合物通过Csm2亚基上的His-tag可进一步获得纯化的LdCsm-dCsm3突变型复合物，比如使用镍柱进行亲和纯化，然后使用分子筛进一步纯化。纯化获得的产品蛋白浓度为1～1.3mg/ml，摩尔浓度为4100nM，工作浓度为50～100nM。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种检测系统，该系统基于III-A型CRISPR-Cas系统，其包括上述第一方面中所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物；以及，还包括DNA荧光报告子和10×反应Buffer。

本发明的检测系统可以实现检测目标RNA的效果，检测特异性强，灵敏度高，对于来自非目标RNA的干扰的抗性强。

在本发明的一些实施方式中，所述DNA荧光报告子5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团。

在本发明的一些实施方式中，所述DNA荧光报告子的序列为5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。

在本发明的一些实施方式中，所述10×反应Buffer中包含Tris-Cl、MgCl₂、KCl和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。在一个具体地实施方式中，10×反应Buffer的成分为500mM Tris-Cl(pH 6.8)，100mM MgCl₂，500mM KCl，1mg/ml bovine serumalbumin(BSA)。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种RNA检测试剂盒，其包含上述第一方面中所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物或者上述第三方面所述的检测系统。

在本发明的第六方面，本发明提供了上述第一方面中所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物或者上述第四方面所述的检测系统或者上述第五方面所述的RNA检测试剂盒在RNA检测或在表达目标RNA的病原体的检测中的应用。

进一步地，本发明所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物、检测系统或者RNA检测试剂盒在疾病诊断、病理分析等医疗卫生相关应用领域使用。根据目标RNA合成的LdCsm-dCsm3突变型复合物能够专一性的识别目标RNA，在反应体系中释放荧光信号，高效地对目标RNA，以及表达目标RNA的病原体的存在，进行检测。

在本发明的一些实施方式中，本发明所述的RNA检测为检测某种目标RNA的有无。所述目标RNA包括但不限于天然RNA、DNA体外转录产生的RNA、以及DNA经过体外扩增后再经过体外转录产生的RNA。

本发明基于III-A型LdCsm复合物，III-A型LdCsm复合物能够识别目标RNA并被激活自身的Cas10亚基，激活的Cas10亚基具有“附属的”非特异性的Dnase活性，可以切割任意单链DNA，同时骨架蛋白Csm3可以切割目标RNA。基于此，在反应体系中加入5端标记有荧光基团而3’端标记有荧光淬灭基团的单链DNA荧光报告子，被激活的III-A型LdCsm复合物切开后可以释放荧光信号。根据荧光信号的强弱，即可判断目标RNA的存在与多少，实现对目标RNA的检测。比如，在本发明的一些实施方式中，该过程如图3A所示。

在本发明的实施方式中，对野生型LdCsm复合物进行了骨架蛋白Csm3亚基的失活突变，通过将Csm3的第34位天冬氨酸突变为丙氨酸，获得了Csm3亚基失去了对目标RNA的切割能力的LdCsm-dCsm3突变型复合物。由于LdCsm-dCsm3突变型复合物不切割目标RNA，在相同浓度目标RNA作用下，LdCsm-dCsm3突变型复合物切割DNA荧光报告子的效率更高，释放的荧光信号更强，比如，在本发明的一些实施方式中，该过程如图3B所示。本发明改进后的LdCsm-dCsm3突变型复合物对目标RNA的检测效率是野生型LdCsm复合物的2～3倍。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种RNA检测方法，包括将第一方面所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物、和DNA荧光报告子以及反应buffer加入待测RNA后在37℃下反应；或者，所述检测方法包括将上述第四方面中所述的检测系统加入待测RNA后在37℃下反应；或者，所述检测方法包括将上述第五方面所述的RNA检测试剂盒加入待测RNA后在37℃下反应。

在本发明的一些实施方式中，所述DNA荧光报告子5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团。比如，在本发明的一个或多个实施方式中，所述DNA荧光报告子的序列为5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。

在本发明的一些实施方式中，上述两种检测方法可通过荧光信号的数值反映目标RNA的有无。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述方法包括：RNA检测反应体系共20μl。LdCsm-dCsm3突变型复合物稀释8倍，添加1～2μl(终浓度50～100nM)，DNA荧光报告子添加1～2μl(终浓度0.5～1μM)，10×反应Buffer添加2μl。反应体系于冰上配制，开始反应前，实验组加入待测RNA(1～100ng)，空白对照加入等体积DEPC(diethyl procarbonate，二乙基焦碳酸酯)水，用DEPC H₂O补齐至20μl后，各自混匀。反应体系加入黑色384孔酶标板，放入37℃预热的酶标仪进行荧光检测。检测波长为λex:485nm，λem:535nm。反应时间30min，每5min读数一次。各组的荧光数值减去空白对照的背景荧光值，然后计算5～15min内的荧光值变化速率。通过荧光值变化速率的大小反映LdCsm-dCsm3突变型复合物的激活与否，推断目标RNA的有无和含量多少。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

与现有的基于CRISPR-Cas系统的RNA检测技术，比如使用Cas13a蛋白进行的RNA检测技术相比，本发明使用LdCsm-dCsm3突变型复合物对来自检测样品中存在的非特异性RNA的抗干扰能力更强。在被检测样品中非特异性RNA与目标RNA的比例达到20:1以上时，Cas13a蛋白对目标RNA的检测信号仅剩20～30％，而LdCsm-dCsm3突变型复合物的检测信号能够维持在80％以上。实际检测应用中，待测样品中的RNA种类往往是复杂多样的，对非特异性RNA的抗性更好的LdCsm-dCsm3突变型复合物比Cas13a有着更好的应用价值。

另一方面，LdCsm-dCsm3突变型复合物在常温下的储存稳定性强，蛋白浓度1～1.3mg/ml的LdCsm-dCsm3突变型复合物产品可以在常温下7～14天内保持90％以上的活性，在常温下28天内保持60～70％的活性。而Cas13a蛋白产品在常温下7天内基本失活，失去检测能力。在常温下稳定的LdCsm-dCsm3突变型复合物在运输和储存中对冷链的依赖性小，能够节省用于维持冷链成本，有更好的市场竞争性。

此外，本发明中，crRNA可以与LdCsm-dCsm3突变型复合物一起合成并与之牢固结合，不需要单独合成与纯化，在检测中不需要单独添加，更为便捷。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例2中用于构建pUCE-S1质粒的Repeat+Spacer单元的设计流程示意图。目标RNA S1序列中，标注下划线的序列即是Protospacer序列的3’下游邻近序列，这一段序列不能与5’-ACGAGAAC-3’匹配。

图2为实施例2中用于构建pUCE-S1质粒的重叠延伸引物的设计原理图。三个重叠延伸引物各有部分序列分别和Ld Repeat序列和Spacer序列同源。引物序列中标下划线的部分是和Spacer同源的部分。

图3中A为野生型LdCsm复合物用于目标RNA检测的原理示意图，B为改进后的LdCsm-dCsm3突变型复合物用于目标RNA检测的原理示意图。

图4为实施例2中纯化获得的LdCsm-dCsm3突变型复合物产品的SDS-PAGE验证结果。M为蛋白Marker。

图5中A为实施例3中LdCsm-dCsm3突变型复合物对目标RNA S1和非特异性RNA S10进行检测时的荧光信号的时间曲线，B为这些检测反应在开始后5～15min内荧光信号的变化速率。

图6中A为实施例4中LdCsm-dCsm3突变型复合物与野生型Ldcsm复合物分别检测目标RNA S1和非特异性RNA S10时荧光信号的时间曲线，B为这些检测反应在开始后5～15min内荧光信号的变化速率。

图7为实施例4中不同浓度非特异性RNA干扰下，LdCsm-dCsm3突变型复合物和Cas13a在对不同浓度目标RNA S1-46进行定量检测的结果。纵轴为检测反应在开始后5～15min内荧光信号的变化速率。2nM目标RNA S1对应的质量浓度为0.07ng/μL。

图8为实施例4中在不同温度下储存不同时间后，LdCsm-dCsm3突变型复合物和Cas13a对目标RNA S1的检测结果。以反应5min～15min之内荧光值的增长速率(min^-1)为检测效率。纵轴为相对检测效率，以储存0天时样品的相对检测效率为1。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明所述的RNA检测为检测某种目标RNA的有无。注意本发明的用途不限于检测实施案例中的目标RNA，本发明能够检测的目标RNA包括但不限于天然RNA、DNA体外转录产生的RNA、以及DNA经过体外扩增后再经过体外转录产生的RNA。下述实施例中的目标RNA仅用于展示检测效果。

本发明涉及的序列如表1-3中所示。

表1本发明中使用或涉及的RNA序列

表2本发明中涉及的DNA序列

注：标注下划线的部分与LdCsm-dCsm3-crRNA的5’端8个碱基同源。

表3本发明使用的引物

实施例1

检测既定的目标RNA S1使用的物质：包括LdCsm-dCsm3突变型复合物，RNA标准品，DNA荧光报告子，10×反应buffer，DEPC H₂O。长期储藏条件-20℃。

(1)性质与成分介绍：

LdCsm-dCsm3突变型复合物，是整合有crRNA的多亚基核酸蛋白复合物，五种蛋白亚基和crRNA的化学计量关系为Csm1₁2₃3₄4₁5₁:crRNA₁，总分子量317kDa。crRNA的核酸序列见表1。形态为液体，总体积1mL，蛋白浓度为1.3mg/ml，复合物的摩尔浓度4100nM，储存buffer成分为10mM Tris-HCl(pH8.5)，125mM NaCl和50％甘油。

RNA S1标准品，含46个碱基的核糖核酸样品，序列见表1。形态为干粉，使用时加320μL DEPC H₂O溶解，液体浓度5μM。

DNA荧光报告子，含16个碱基的脱氧核糖核酸样品，5’端修饰有FAM荧光集团，3’端修饰有BHQ1荧光淬灭基团，序列为5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。形态为干粉，使用时加800μL DEPC H₂O溶解，液体浓度10μM。

10×反应buffer，液体，总体积1mL，液体成分500mM Tris-HCl(pH7.0)，100mMMgCl₂，500mM KCl，1mg/ml bovine serum albumin(BSA)。

DEPC H₂O，液体，总体积10mL。

(2)用途与来源介绍：

LdCsm-dCsm3突变型复合物，用于检测既定的目标RNA S1。LdCsm-dCsm3突变型复合物在野生型LdCsm复合物的基础上突变而来，特点是Csm3亚基的第34位氨基酸从天冬氨酸变为丙氨酸，失去对目标RNA的切割能力。LdCsm-dCsm3突变型复合物由p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒，pET30-Csm2质粒和pUCE-S1质粒在E.coli BL21(DE3菌株中共同表达产生，经过纯化获得产品。p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒表达Csm1～5五种蛋白亚基和Cas6蛋白，其中对编码Csm3亚基的序列进行了点突变，导致第34位天冬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，使得表达产生的LdCsm-dCsm3突变型复合物中，Csm3亚基带有第34位天冬氨酸到丙氨酸的突变。pET30-Csm2质粒表达带有his-tag的Csm2亚基蛋白，使LdCsm-dCsm3突变型复合物带有his-tag，从而可以使用镍柱亲和层析进行纯化。pUCE-S1质粒表达特定crRNA的前体(含10个crRNA的连续重复单元)，经Cas6切割后产生单体crRNA。crRNA整合进LdCsm-dCsm3突变型复合物后，引导复合物特异性的识别目标RNA，并激活复合物的检测活性。表达特定crRNA的质粒是根据目标RNA的序列，即S1的序列进行设计的。p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒中点突变的引入过程，pUCE-S1质粒的设计和构建过程，以及LdCsm-dCsm3突变型复合物的纯化过程，具体见实施例2。

RNA S1标准品，目标RNA标准样品，用于展示产品检测活性，作为阳性对照。RNA S1的序列见表1，订购自金维智公司。

DNA荧光报告子，序列为5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。用于释放检测信号。订购自金维智公司。

10×反应buffer，用于在检测反应中提供适宜的pH环境以及金属离子。

DEPC H₂O，用于补足反应体系的总体积。购自Solibio公司。

实施例2

本部分描述LdCsm-dCsm3突变型复合物表达系统的构建以及LdCsm-dCsm3突变型复合物的纯化过程。

(1)p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒的构建。

p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒在p15AIE-Cas质粒基础上进行改造，表达Csm1，Csm2，Csm3^D34A，Csm4，Csm5五种构成LdCsm-dCsm3突变体复合物的蛋白亚基以及Cas6蛋白。

以申请人所在实验室保存的p15AIE-Cas质粒为模板，分别以引物对StuI-L-D34A-F:L-D34A-R，和R-D34A-F:KpnI-R-D34A-R进行PCR扩增。引物订购自青岛擎科，序列见表2。使用Phanta polymerase进行扩增。胶回收纯化试剂盒购自康为世纪公司。反应体系和反应条件如下。

L-D34A片段，50μL PCR反应体系

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在841bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得L-D34A片段。

R-D34A片段，50μL PCR反应体系

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在903bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得R-D34A片段。

以L-D34A片段，R-D34A片段为模板，以引物对StuI-L-D34A-F:KpnI-R-D34A-R进行融合PCR扩增。反应体系和反应条件如下。

D34A片段，50μL融合PCR反应体系

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在1724bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得D34A片段。

p15AIE-Cas质粒和D34A片段分别使用StuI和KpnI进行双酶切。StuI和KpnI限制性内切酶购买自Thermo Scientific公司。反应体系如下。

p15AIE-Cas质粒，50μL双酶切反应体系

37℃反应1h，85℃ 10min失活，置于冰上待用。双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在8400bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，获得p15AIE-Cas双酶切片段。

D34A片段，50μL双酶切反应

37℃反应1h，85℃ 10min失活，置于冰上待用。双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在1705bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，获得D34A双酶切片段。

p15AIE-Cas双酶切片段和D34A双酶切片段进行T4连接反应和转化。T4连接酶购买自Thermo Scientific公司。E.coli DH5α感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。反应体系和反应过程如下。

p15AIE-Cas双酶切片段与D34A双酶切片段，10μL T4连接反应体系

16℃反应6h，置于冰上待用。连接产物加入E.coli DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃ 220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得单菌落。

p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒的验证。质粒提取试剂盒购买自康为世纪公司。单菌落接种10ml LB(Amp 100μg/ml)，37℃ 220rpm培养16h，取1mL菌液保菌，其余菌液提取质粒。提取的质粒样品送青岛擎科生物公司测序，测序引物为StuI-L-D34A-F:KpnI-R-D34A-R。经过测序结果与p15AIE-Cas的比对，确定成功获得了p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒。

(2)pUCE-S1质粒的构建

pUCE-S1质粒在pUCE质粒基础上插入多个重复的“Repeat+Spacer”单元获得。Spacer序列与目标RNA S1的序列互补。pUCE-S1质粒转录产生前体crRNA(覆盖多个“Repeat+Spacer”)，经过p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒表达的Cas6蛋白处理后，产生单体crRNA(序列见表1)。单体crRNA与p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒表达的Csm1，Csm2，Csm3^D34A，Csm4，Csm5五种蛋白亚基整合为完整的LdCsm-dCsm3突变体复合物，可以特异性识别目标RNA S1，激活复合物的检测活性，以实现对S1的检测。

用于识别S1的“Repeat+Spacer”单元的设计过程如下。根据S1序列选择40nt的片段作为Protospacer，保证这一段碱基序列3’下游的邻近序列不与5’-ACGAGAAC-3’匹配。将Protospacer序列转换为反向互补的DNA序列，作为S1-Spacer，序列见表2。Ld Repeat序列(见表2)与S1-Spacer序列拼接成“Repeat+Spacer”单元序列。获取“Repeat+Spacer”单元的详细流程见图1。根据获得的“Repeat+Spacer”单元序列，设计三个重叠延伸引物，Re-S1-F，Re-S1-R，S1-R，设计原理如图2，引物序列见表3。使用三种引物互为底物进行重叠延伸，获得有多个重复的“Repeat+Spacer”单元的重叠延伸片段。引物订购自青岛擎科生物公司。使用Phanta polymerase进行扩增。胶回收纯化试剂盒购自康为世纪公司。反应体系和反应条件如下。

多个重复的“Repeat+Spacer”单元片段，50μL重叠延伸反应体系

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，有一系列长度不同的条带，选择长度918bp左右的条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得10个重复的“Repeat+Spacer”单元片段。

pUCE质粒进行BglII单酶切。BglII限制性内切酶购买自Thermo Scientific公司。反应体系如下。

pUCE质粒，50μL双酶切反应体系

37℃反应1h，85℃ 10min失活，置于冰上待用。双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在3561bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，获得pUCE单酶切片段。

pUCE单酶切片段和10个重复的“Repeat+Spacer”单元片段进行T4连接反应和转化。T4连接酶购买自Thermo Scientific公司。E.coli DH5α感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。反应体系和反应过程如下。

pUCE单酶切片段和10个重复的“Repeat+Spacer”单元片段，10μL T4连接反应体系

16℃反应16h，置于冰上待用。连接产物加入E.coli DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃ 220rpm孵育1h。菌液涂布氯霉素(Cm)25μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得单菌落。

pUCE-S1质粒的验证。质粒提取试剂盒购买自康为世纪公司。单菌落接种10ml LB(Amp 100μg/ml)，37℃ 220rpm培养16h，取1mL菌液保菌，其余菌液提取质粒。提取的质粒样品送青岛擎科生物公司测序，测序引物为pUCE-S1-F:pUCE-S1-R(序列见表3)。经过测序结果与pUCE质粒序列以及“Repeat+Spacer”单元片段序列的比对，确定成功获得了pUCE-S1质粒。

(3)LdCsm-dCsm3突变型复合物的纯化

LdCsm-dCsm3突变体复合物表达菌株的获得。E.coli BL21(DE3)感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。30ng p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒，30ngpUCE-S1，以及30ng pET30a-Csm2质粒(Lin et al.Cell Discovery(2020)6:29)加入100μLE.coli BL21(DE3)感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃ 220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，卡那霉素(Kan)50μg/ml,氯霉素(Cm)25μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得表达菌株的单菌落。

LdCsm-dCsm3突变体复合物的诱导表达。IPTG购买自Coolaber公司。LdCsm-dCsm3突变体复合物表达菌株单菌落接种20mL LB(Amp100μg/ml，Kan 50μg/ml，Cm 25μg/ml)作为种子液，37℃ 220rpm培养16h。种子液按1％接种1L LB(Amp 100μg/ml，Kan 50μg/ml，Cm 25μg/ml)，37℃ 220rpm培养3h至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度0.3mM，25℃180rpm诱导表达20h。

LdCsm-dCsm3突变体复合物的收集与纯化。30kDa超滤管购买自Merck公司。HiTrap吸附柱，Superdex 200分子筛，和AKTA蛋白纯化系统购买自GE Healthcare公司。菌液16℃5000rpm离心10min，菌泥用50mL Buffer A(20mM Tris-HCl，0.25M NaCl，20mM咪唑和10％甘油，pH8.5)重悬，4℃下压力破碎，4℃ 10,000rpm离心60min去除破碎沉淀，上清液过0.22uM滤膜。过滤的上清液以1mL/min的流速上样经过Buffer A平衡的HiTrap吸附柱(GEHealthcare)。上样结束后，使用使用Buffer B(20mM Tris-HCl，0.25M NaCl，200mM咪唑和10％甘油，pH8.5)梯度洗脱复合物(30min内浓度由0％提升至100％)。系统检测到OD₂₈₀开始上升后(Buffer B浓度12％)，开始收集HiTrap纯化产物，共收集6mL样品。HiTrap吸附柱纯化样品加入30kDa超滤管，4℃ 10000rpm离心45min将样品总体积浓缩至0.5mL。用Buffer C(20mM Tris-HCl，0.25M NaCl和5％甘油，pH8.5)以0.5mL/min的流速冲洗Superdex 200分子筛60min，之后浓缩样品上样AKTA系统，在Buffer C冲洗下经过Superdex 200分子筛进行纯化。系统检测到OD₂₈₀开始上升后，开始收集Superdex 200纯化产物，共收集3mL样品。样品使用SDS-PAGE分析，蛋白条带分布如图4。使用Nanodrop检测蛋白样品浓度为2.6mg/ml，加3mL甘油混匀。最终产品中，蛋白浓度为1.3mg/mL，LdCsm-dCsm3突变体复合物的摩尔浓度为4100nM。放入-80℃保存待用。

实施例3

本部分描述使用LdCsm-dCsm3突变型复合物检测目标RNA的方法以及检测效果。

冰上配制3个20μL RNA检测反应体系。LdCsm-dCsm3突变型复合物使用DEPC H₂O稀释8.2倍，反应体系中添加2μL，终浓度为50nM。DNA荧光报告子反应体系中添加2μL，终浓度1μM。10×反应buffer添加2μL。DEPC H₂O添加12μL。

S1 RNA标准品为检测对象，使用DEPC H₂O作为检测的空白对照，使用非特异性RNAS10作为阴性对照。S10序列见表1，订购自金维智公司。

S1 RNA标准品(5μM)和S10 RNA(5μM)分别用DEPC H₂O稀释十倍。三个反应体系中分别加2μL DEPC H₂O(空白对照组)，2μL S1 RNA标准品(检测组)，和2μL S10 RNA(阴性对照组)。反应体系中S1 RNA标准品和S10 RNA的终浓度都为50nM。

使用酶标仪测定RNA检测反应的信号。384孔黑色酶标板购买自Grenier公司，荧光酶标仪品牌为Enspire。三个反应分别混匀，加入黑色384孔酶标板，放入37℃预热的酶标仪进行荧光动力学检测。检测波长λex:485nm；λem:535nm，37℃下每5min读数一次。

数据的处理。检测组和阴性对照组的荧光值减去空白对照组的背景荧光值，计算反应5min～15min之内荧光值的增长速率(min^-1)。

检测结果如图5。LdCsm-dCsm3突变型复合物能够特异性的识别目标RNA S1，使得反应体系释放高强度的荧光信号。相对的，非特异性RNA S10不能被LdCsm-dCsm3突变型复合物识别，反应体系的荧光信号没有显著提高。这说明本发明实现了对预定目标RNA S1的高特异性检测。

实施例4

本部分描述本发明所做改进带来的增益，以及与现有的相同类型产品相比的优势。

1.与野生型LdCsm复合物的对比

使用LdCsm-dCsm3突变型复合物，主要改进是对野生型LdCsm复合物进行了Csm3亚基的失活突变，具体过程见实施例2中(1)。野生型LdCsm复合物的合成过程与LdCsm-dCsm3突变型复合物相似，如实施例2中(3)，区别是使用p15AIE-Cas质粒替代p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒。保存的野生型LdCsm复合物浓度为1.3mg/mL。按照实施例3中的检测方法，检测野生型LdCsm复合物，以及LdCsm-dCsm3突变型复合物对目标RNA S1检测效率的差异。

检测结果如图6。目标RNA的浓度相同时，LdCsm-dCsm3突变型复合物的检测信号是野生型LdCsm复合物的2倍。证明LdCsm-dCsm3突变型复合物的检测效率得到了100％的提升。

2.与Cas13a蛋白检测试剂盒的对比

使用LdCsm-dCsm3突变型复合物作为检测工具，现有的基于CRISPR-Cas的RNA检测技术主要使用Cas13a蛋白和对应的crRNA作为检测工具。为检验LdCsm-dCsm3突变型复合物在RNA检测上的优势，从博徕斯公司购买了Cas13a的RNA检测试剂盒，并依据目标RNA S1序列自博徕斯公司订购了用来靶标S1的Cas13a专用的crRNA(浓度10μM，序列见表1)。Cas13a的RNA检测试剂盒包含：Cas13a蛋白(蛋白浓度0.27mg/mL，摩尔浓度1μM)，RNA荧光报告子(浓度100μM，序列为5’-FAM-UUUUU-BHQ1-3’)，10×反应buffer。

(1)抵抗非特异性RNA干扰能力的差异

检测中使用的非特异性RNA为E.coli BL21(DE3)菌株的总RNA。BL21(DE3)菌株单菌落接种20mL LB培养基，培养至OD600＝0.8，使用Trizol提取法提取总RNA。非特异性RNA的核酸浓度为800ng/μL。

目标RNA S1稀释至2nM，5nM，10nM，15nM，20nM五个浓度梯度。20nM S1的核酸浓度为0.7ng/μL。

分别配制LdCsm-dCsm3突变型复合物以及Cas13a的反应体系。

冰上配制3×5个LdCsm-dCsm3突变型复合物的RNA检测反应体系。添加LdCsm-dCsm3突变型复合物至终浓度100nM，添加DNA荧光报告子至终浓度1μM。其中5个属于组1，非特异性RNA的终浓度为0；5个属于组2，非特异性RNA的终浓度2ng/μL；5个属于组3，非特异性RNA的终浓度10ng/μL。10×反应buffer添加2μL，DEPC H₂O补齐至18μL。

冰上配制3×5个Cas13a突变型复合物的RNA检测反应体系。添加Cas13a至终浓度100nM，添加Cas13a的crRNA至终浓度100nM，添加RNA荧光报告子至终浓度1μM。其中5个属于组1，非特异性RNA的终浓度为0；5个属于组2，非特异性RNA的终浓度2ng/μL；5个属于组3，非特异性RNA的终浓度10ng/μL。Cas13a的10×反应buffer添加2μL，DEPC H₂O补齐至18μL。

上述每组的5个反应体系中，分别加入2μL 5个不同浓度梯度的目标RNA S1，使得5个反应体系中目标RNA S1的终浓度分别为0.2nM，0.5nM，1nM，1.5nM，2nM。空白对照中加入2μL DEPC H₂O。

数据的处理。各检测组的荧光值减去空白对照的背景荧光值，计算反应5min～15min之内荧光值的增长速率(min^-1)。

检测结果见图7。LdCsm-dCsm3突变型复合物在2ng/μL的非特异性RNA干扰下(非特异性RNA:目标RNA＝28:1)，检测信号能保持没有非特异性RNA干扰时的80％，在10ng/μL的非特异性RNA干扰下(非特异性RNA:目标RNA＝142:1)，检测信号能保持45％。相比之下，Cas13a在2ng/μL的非特异性RNA干扰下，检测信号只能保持26％，在10ng/μL的非特异性RNA干扰下，检测信号只剩5％。

这表明在RNA检测中，LdCsm-dCsm3突变型复合物对于来自非特异性RNA的干扰有更好的抗性。在对成分复杂的RNA样品进行检测以及定量时，LdCsm-dCsm3突变型复合物相比Cas13a有优势。

(2)储存稳定性的差异

自-80℃冰箱中取出的LdCsm-dCsm3突变型复合物(1.3mg/mL)与Cas13a蛋白(0.27mg/mL)分别取样在室温，4℃，-20℃，-80℃条件下存储。经过3天，7天，14天，21天，28天后，分别取出，用来检测目标RNA S1。

LdCsm-dCsm3突变型复合物的RNA检测反应体系。LdCsm-dCsm3突变型复合物使用DEPC H₂O稀释8.2倍，添加2μL，终浓度为50nM。DNA荧光报告子添加2μL，终浓度1μM。10×反应buffer添加2μL。DEPC H₂O添加12μL。

Cas13a的RNA检测反应体系。Cas13a蛋白添加1μL，终浓度为50nM。Cas13a的crRNA使用DEPC H₂O稀释10倍，添加1μL，终浓度为50nM。RNA荧光报告子使用DEPC H₂O稀释10倍，添加2μL，终浓度1μM。10×反应buffer添加2μL。DEPC H₂O添加12μL。

各实验组中S1 RNA标准品用DEPC H₂O稀释十倍，添加2μL，终浓度都为50nM。空白对照加2μLDEPC H₂O。

数据的处理。各组的荧光值减去空白对照的背景荧光值，计算反应5min～15min之内荧光值的增长速率(min^-1)，代表检测效率。以储存0h的LdCsm-dCsm3突变型复合物对S1进行检测的检测效率为1，计算在不同温度下存储不同时间后，两种产品的相对检测活性。

检测结果见图8。在室温储存28天后，LdCsm-dCsm3突变型复合物仍然保留62％的检测活性。在4℃储存28天后，LdCsm-dCsm3突变型复合物仍然保留83％的检测活性。相比之下，在室温储存7天后，,Cas13a的检测活性完全消失。在4℃储存28天后，Cas13a的检测活性也完全消失。这说明在室温或4℃条件下，LdCsm-dCsm3突变型复合物的储存稳定性明显好于Cas13a。在冷链不充足的条件下，LdCsm-dCsm3突变型复合物有更好的应用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> LdCsm-dCsm3突变型复合物、含该复合物的检测系统及其在RNA检测中的应用

<130> 202028697

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uguuaagucu gguuucccuc caggguaucu aagcuuugaa aaaaaa 46

<210> 2

<211> 46

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

auagaaugcc cccauuauac aauaucuacg uuuuagauga aaaaaa 46

<210> 3

<211> 38

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgagaacuu caaagcuuag auacccugga gggaaacc 38

<210> 4

<211> 63

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ucaaagcuua gauacccugg 60

agg 63

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctaacaact tatctccgct agaaggagac gagaac 36

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcaaagctt agataccctg gagggaaacc agacttaaca 40

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttttttttt tttttt 16

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgaggtaagg ccttcattta c 21

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atcgggttgg cgatcgcacc aatagccgca 30

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtgcgatcg ccaacccgat aattaaggat cc 32

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacagtggta ccgcgtataa gc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctccggcgta gaggatcgag 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atccggatat agttcctcc 19

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctaacaact tatctccgct agaaggagac gagaacttca aagctta 47

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gttctcgtct ccttctagcg gagataagtt gttagctgtt aagtctggt 49

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agctgttaag tctggtttcc ctccagggta tctaagcttt gaagtt 46

Claims

1.一种LdCsm-dCsm3突变型复合物，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物，其特征在于，Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的化学计量关系为Csm1₁2₃3₄4₁5₁:crRNA₁；

优选地，Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的空间关系为Csm3和Csm2亚基沿crRNA形成双螺旋状的骨架，Csm1亚基与Csm4亚基结合在crRNA的5’端，Csm5亚基结合在crRNA的3’端；

优选地，crRNA的长度为34～38个碱基，5’端前8个碱基序列为5’-ACGAGAAC-3’；

优选地，所述复合物的分子量为317kDa。

3.根据权利要求1所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物，其特征在于，所述LdCsm-dCsm3突变型复合物通过三种质粒pUCE-X，p15AIE-Cas-Csm3^D34A和pET30a-Csm2在Escherichiacoli BL21(DE3)菌株中表达合成；其中，pUCE-X质粒中，X表示目标RNA；

优选地，pUCE-X质粒的构建方法包括：(1)根据目标RNA选定Spacer；(2)Spacer与Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus CRISPR array的Repeat序列组成Repeat-Spacer单元，根据Repeat-Spacer单元设计重叠延伸引物；(3)引物通过重叠延伸获得有多个重复的Repeat-Spacer单元，将片段插入pUCE质粒获得表达crRNA的质粒pUCE-X。

4.一种权利要求1至3中任一项中所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物的表达系统，其包括pUCE-X质粒、p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒和pET30a-Csm2质粒，以及利用所述三种质粒获得的表达菌株；

其中，pUCE-X质粒用于表达crRNA的前体；p15AIE-Cas-Csm3^D34A质粒用以表达Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基和用于处理crRNA前体的Cas6蛋白；pET30a-Csm2质粒用以表达带有His-tag的Csm2亚基，用于纯化；在表达菌株中，经过Cas6蛋白处理的crRNA与Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基形成完整的LdCsm-dCsm3突变型复合物。

5.一种表达合成权利要求1至3中任一项中所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物的方法，其采用权利要求4所述的表达系统，包括：将pUCE-X转入含有p15AIE-Cas-Csm3^D34A和pET30a-Csm2的表达菌株中，经IPTG诱导表达前体crRNA，Cas6蛋白和Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5五种蛋白亚基，Cas6蛋白将前体crRNA切割为单体crRNA，单体crRNA与Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5五种蛋白亚基组装形成成熟的LdCsm-dCsm3突变型复合物。

6.一种检测系统，其基于III-A型CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述检测系统包括权利要求1至3中任一项所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物。

7.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，其还包括DNA荧光报告子和10×反应Buffer；

优选地，DNA荧光报告子5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团；

优选地，所述10×反应Buffer中包含Tris-Cl、MgCl₂、KCl和BSA。

8.一种RNA检测试剂盒，其包含权利要求1至3中任一项所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物，或者包含权利要求6或7中所述的检测系统。

9.权利要求1至3中任一项所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物或者权利要求6或7所述的检测系统或者权利要求8所述的RNA检测试剂盒在RNA检测或在表达目标RNA的病原体的检测中的应用；

优选地，所述RNA包括但不限于天然RNA、DNA体外转录产生的RNA、以及DNA经过体外扩增后再经过体外转录产生的RNA。

10.一种RNA检测方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1至3中任一项所述的LdCsm-dCsm3突变型复合物、DNA荧光报告子以及反应buffer加入待测RNA后在37℃下反应；或者，所述方法包括将权利要求6或7中所述的检测系统加入待测RNA后在37℃下反应；或者所述方法包括将权利要求8中所述的RNA检测试剂盒加入待测RNA后在37℃下反应；

优选地，所述DNA荧光报告子5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团。