KR20220147616A - 재프로그래밍된 tracrRNA를 사용한 RNA 검출 및 전사-의존적 편집 - Google Patents
재프로그래밍된 tracrRNA를 사용한 RNA 검출 및 전사-의존적 편집 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감지된 RNA와 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA 및 적어도 하나의 표적 핵산에 결합하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 사용하여 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법, 뿐만 아니라 이의 각각의 시스템 및 진단 및 치료 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 감지된 RNA와 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA 및 적어도 하나의 표적 핵산에 결합하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 사용하여 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법, 뿐만 아니라 이의 각각의 시스템 및 진단 및 치료 용도에 관한 것이다.
거의 모든 고세균과 약 절반의 박테리아는 클러스터된 규칙적으로 간격을 두고 배치된 짧은 회문 반복(CRISPR)-CRISPR-연관 유전자(Cas) 적응 면역 시스템을 보유하고 있으며, 이는 바이러스 및 핵산 게놈을 갖는 기타 외래 침입자로부터 원핵생물을 보호한다. CRISPR-Cas 시스템은 이펙터 복합체(effector complex)의 조성에 따라 기능적으로 클래스 1과 클래스 2로 나뉜다. 클래스 2는 단일-이펙터 뉴클레아제로 구성되며, 유형 II, V 및 VI CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템의 이용에 의해 게놈 편집의 일상적인 실행이 달성되었다. 유형 II 및 V는 DNA 또는 RNA를 표적화하는데 사용될 수 있는 반면 유형 VI는 RNA를 표적화하는데 사용된다(예를 들면, 참조; Koonin EV and Makarova KS Origins and evolution of CRISPR-Cas systems Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019 May 13;374(1772):20180087). 유형 II 및 V Cas 이펙터 뉴클레아제는 일반적으로 표적 DNA 인식의 첫 번째 단계로서 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif; PAM)에 의존하며, 이펙터 뉴클레아제는 단백질-DNA 상호작용을 통해 PAM 서열에 직접 결합하고 후속적으로 다운스트림 DNA 서열을 분리(unzip)한다. 그후 이펙터 단백질은 DNA 표적의 한 가닥과 CRISPR RNA(crRNA)의 가이드 부분 사이의 염기쌍의 정도에 대한 정보를 얻는다. 두 개 사이의 충분한 상보성이 표적 절단을 유도한다. PAM 서열은 시스템 간에 뿐만 아니라 유사한 뉴클레아제 간에도 상당히 다른 것으로 알려져 있으며, Cas 단백질이 PAM 인식을 변경하도록 조작될 수 있는 것으로 나타났다(Leenay and Beisel Deciphering, Communicating, and Engineering the CRISPR PAM. J Mol Biol. 2017 Jan 20;429(2):177-191). DNA를 표적화하는 것 외에도, 캄필로박터 제주니(C. jejuni ) Cas9, 나이세리아 메닌지티디스 (N. meningitidis ) Cas9, 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ) Cas9 및 미배양 고세균으로부터의 Cas12f1과 같은 일부 유형 II 및 V 단일-이펙터 뉴클레아제도 ssDNA 및 /또는 RNA를 표적화하는 것으로 나타났다(RNA-dependent RNA targeting by CRISPR-Cas9. Elife. 2018;7:e32724; DNase H Activity of Neisseria meningitidis Cas9. Mol Cell. 2015;60(2):242-255; Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes). 이러한 경우에는, PAM이 필요하지 않았다. 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes ) Cas9(SpyCas9)와 같은 일부 뉴클레아제는 ssDNA 또는 RNA를 즉시 표적화할 수 없었지만, 이중-가닥 PAM 영역을 생성하기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하면 SpyCas9가 단일-가닥 표적에 결합하여 이를 절단할 수 있다 (Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 2014;516(7530):263-266).
성숙 crRNA는 게놈 침입자에 대한 CRISPR-Cas 방어의 핵심 요소이다. 이러한 짧은 RNA는 Cas 단백질을 이들의 파괴를 위해 동족 침입 핵산으로 안내하는 고유한 가이드 서열을 포함한다. CRISPR RNA(crRNA)는 교호(alternating) 보존된 반복체 및 스페이서를 포함하는 CRISPR 어레이에서 자연적으로 암호화(encoding)된다. 어레이(array)는 종종 긴 pre-crRNA로 전사되며, 그후 이 RNA는 반복체-스페이서 단위의 일부로 구성된 개별 crRNA로 처리된다. 상이한 유형의 CRISPR-Cas 시스템이 특유의 crRNA 성숙 메커니즘을 진화시켰다. 다수의 아형(II-A, II-B, II-C, V-B, V-C 등)이 고유한 crRNA 생합성 경로를 진화시켰으며, 여기서 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA, CRISPR-Cas 유전자좌 내에서 암호화됨)는 pre-crRNA의 각 반복 서열과 염기쌍을 이루어 이중-가닥 RNA 이중체(duplex)를 형성한다(Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol . 2020;18(2):67-83). crRNA-tracrRNA 이중체는 하우스키핑 엔도리보뉴클레아제 RNase III에 의해 절단되고 시스템에 특이적인 단일-이펙터 뉴클레아제에 의해 결합된다. 그후 뉴클레아제는 RNA 이중체 내의 crRNA를 사용하여 DNA를 안내하고, 일부 경우에, RNA 표적화를 안내한다. 현재까지, Cas9, Cas12b1/C2c1, Cas12b2, Cas12e/CasX, Cas12f1/Cas14a, Cas12g 및 Cas12k를 포함한 다중 tracrRNA-의존적 CRISPR 뉴클레아제가 보고되었다. Cas12k 뉴클레아제는 DNA 주형의 RNA-지시된 삽입을 위한 트랜스포존(transposon) 유전자 세트와 함께 작동하기 때문에 독특하다(RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 2019;365(6448):48-53). 이러한 각각의 경우에, tracrRNA:crRNA 이중체는, 단일-가이드 RNA(sgRNA)라고 하는 단일 RNA 키메라(chimera)로서 조작될 때, 또한 Cas9 및 기타 tracrRNA-의존적 CRISPR 뉴클레아제에 의한 서열-특이적 dsDNA 절단을 지시한다(참조; Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. Nat Commun. 2019;10(1):212).
프란시셀라 노비시다(Francisella novicida)의 CRISPR-Cas9 시스템은 비정규 작은 CRISPR-관련 RNA(scaRNA) 및 tracrRNA에 의존하는 내인성 DNA 표적과 Cas9의 PAM-의존적 상호작용을 나타낸다. 당연히, scaRNA는 Cas9를 부분 상보성을 사용하여 게놈 DNA 표적에 지시하여 전사 억제를 초래하는 것으로 보인다. scaRNA는 다른 유전자를 억제하도록 재프로그래밍될 수 있으며, 외인성 표적에 대해 조작되고 확장된 상보성을 사용하여 또한 DNA 절단을 지시할 수 있다(Catalytically Active Cas9 Mediates Transcriptional Interference to Facilitate Bacterial Virulence Mol Cell. 2019 Aug 8;75(3):498-510.e5). scaRNA가 crRNA와 유사한 CRISPR-Cas 시스템 내에서 암호화된다는 점을 감안할 때, CRISPR 뉴클레아제를 이의 의도된 표적으로 안내할 수 있는 이전에 알려진 유일한 RNA 공급원은 CRISPR-Cas 시스템 내에서만 유래된다.
본 발명자들의 최근 간행물(CRISPR RNA-Dependent Binding and Cleavage of Endogenous RNAs by the Campylobacter jejuni Cas9. Mol Cell. 2018;69(5):893-905.e7)에서, 이들은 캄필로박터 제주니의 Cas9 뉴클레아제(CjeCas9)와 공동-면역침전하는 RNA를 시퀀싱하였으며, 이 박테리아의 CRISPR 유전자좌 내에서 암호화된 crRNA의 가이드 부분에 대해 상보성을 나타내는 RNA의 하위세트를 밝혀냈다. 본 발명자들은 별도의 캄필로박터 제주니(C. jejuni ) 균주에서 유사한 공동-면역침전 실험을 수행하였다. 이에 따른 미공개 데이터세트에는 crRNA에 대한 상보성을 나타내지 않고 대신 tracrRNA의 항-반복(anti-repeat) 부분에 대한 상보성을 공유하는 RNA의 세트가 포함되었다(도 1). 이들 RNA의 조성 및 크기는 crRNA와 유사하였다. 이러한 통찰은 (Cas9를 이들의 표적으로 안내하는) 성숙 crRNA가 CRISPR 어레이에 의해 암호화된 것 외에 메신저 RNA 및 기타 RNA(예를 들어, 리보솜 RNA, 전이 RNA, 작은 RNA, 안티센스 RNA, 작은 핵성 RNA, 마이크로RNA, piwiRNA, 긴 비암호화 RNA, 스플라이싱된 인트론, 원형 RNA)로부터 유래될 수 있음을 시사하였다. 본 발명의 맥락에서, 이들 RNA를 비정규 crRNA(ncrRNA)로 명명 및/또는 지칭한다.
CRISPR 반복체와 tracrRNA 항-반복 사이의 염기 쌍은 tracrRNA-의존적 CRISPR 뉴클레아제에 의해 결합된 RNA 이중체를 형성한다. 이중체의 정확한 2차 구조는 다양하며, 일부 이중체는 완벽한 상보성을 나타내는 반면 다른 이중체는 특징적인 벌지(bulge)를 포함한다. 정확한 2차 구조에 관계없이, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes )로부터의 Cas9에 대한 sgRNA의 일부로 이 2차 구조를 유지하면 sgRNA의 이 영역의 서열을 변형할 수 있다(Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol Cell. 2014;56(2):333-339). 따라서 본 발명자들은 tracrRNA의 항-반복 부분의 서열이 다른 RNA에 상보적으로 변경되어 각 RNA의 이 부분이 성숙 crRNA가 될 수 있다는 가설을 세웠다(도 2).
tracrRNA의 항-반복 영역을 변경하는 개념은, 특히 임의의 RNA를 ncrRNA로 전환하기 위해, 여전히 탐구되어야 한다. 항-반복 영역의 다운스트림 영역은 sgRNA의 맥락에서 변형되었으며 sgRNA의 기능을 방해하지 않으면서 일부 변화를 수용하는 것으로 나타났다(Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol Cell. 2014;56(2):333-339). 또한, Scott, T 등(Improved Cas9 activity by specific modifications of the tracrRNA. Sci Rep. 2019;9(1):16104)은 항-반복 영역 외부의 영역을 변경하여 Cas9 RNP가 나타내는 전체 편집 활성을 개선시킬 수 있지만 메커니즘은 불분명하다는 것을 보여주었다. 그러나, 이 영역은 Cas9에 의한 인식에 관여하며 crRNA 또는 임의의 다른 RNA와 쌍을 이루는데 관여하지 않는다.
제WO 2019/126037호는 tracrRNA 서열의 적어도 하나의 우라실 뉴클레오티드가 우라실 이외의 뉴클레오티드로 대체된 유전적으로 변형된 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA) 서열을 갖는 핵산 서열 및/또는 가이드 RNA(gRNA) 서열의 하나 이상의 시토신 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 우라실 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 상기 gRNA 서열을 갖는 핵산 서열을 이용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소, 예를 들어 Cas9 또는 Cpfl 또는 클래스 II CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체, 예를 들어 불활성화된 Cas9(dCas9) 또는 돌연변이된 Cas9 닉카아제(D10A)를 추가로 포함하는 조성물이 개시된다.
미국 제2019/032053호는 합성 2-파트 앱타머-함유 가이드 RNA를 포함하는 조성물 및 CRISPR/Cas 활성화제 시스템과 함께 상기 합성 2-파트 앱타머-함유 가이드 RNA를 사용하는 방법에 관한 것이다. 진핵 세포에서 표적화된 전사 활성화, 표적화된 전사 억제, 표적화된 후성유전체 변형, 표적화된 게놈 변형 또는 표적화된 게놈 유전자좌 시각화를 위한 방법이 청구된다.
제WO 2019/183000호는 화학적으로 변형된 crRNA 및 tracrRNA, 5' 및/또는 3' 접합 모이어티(moiety)를 갖는 crRNA 및 tracrRNA, 및 crRNA의 반복 영역 또는 tracrRNA의 항-반복 영역에 변형이 있는 crRNA 및 tracrRNA를 개시한다. CRISPR 뉴클레아제에 의한 게놈 편집을 위한 crRNA 및 tracrRNA의 사용 방법 및 이를 수행하기 위한 키트가 또한 제공된다. crRNA 및 tracrRNA는 배양된 인간 세포에서 SpyCas9-기반 게놈 편집의 효능을 유지하면서 화학적으로 변형되었다.
Tautvydas Karvelis 등(문헌 참조; crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophiles. RNA BIOLOGY, vol. 10, no. 5, 27 March 2013, pages 841-851, DOI: 10.4161/rna24203)은 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) DGCC7710 CRISPR3-Cas 시스템의 Cas9-crRNA 복합체가 crRNA-지시된 표적 서열 인식 및 단백질-매개된 DNA 절단을 갖는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제로서 기능한다는 것을 개시한다. 추가 RNA 분자인 tracrRNA(트랜스-활성화 CRISPR RNA)가 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) DGCC7710 CRISPR3-Cas 시스템을 지닌 이종 대장균 균주로부터 단리된 Cas9 단백질과 공동-정제된다. tracrRNA는 시험관내 및 생체내 모두에서 Cas9-매개된 DNA 간섭에 필요하며, Cas9는 시험관내에서 전구체 crRNA(pre-crRNA) 전사체와 tracrRNA 사이의 이중체 형성을 특이적으로 촉진한다. 또한, 하우스키핑 RNase III는 성숙 crRNA 생합성을 위한 1차 pre-crRNA-tracrRNA 이중체 절단에 기여한다. 그러나 RNase III는 단일 스페이서를 포함하는 최소 CRISPR 어레이로부터 전사된 짧은 pre-crRNA의 처리에 필요하지 않다. 시험관내-조립된 삼원 Cas9-crRNA-tracrRNA 복합체는 DNA를 절단한다. 이 참고문헌은 정확한 게놈 수술을 위해 임의의 표적 DNA 서열을 특이적으로 절단하기 위한 Cas9의 crRNA-기반 재프로그래밍을 위한 분자 기반을 추가로 명시한다. 개시된 바와 같은 crRNA 성숙 및 이펙터 복합체 조립을 위한 프로세스는 게놈 편집 용도를 위한 Cas9 재프로그래밍 가능한 시스템의 추가 개발에 기여한다고 한다.
그럼에도 불구하고, 제WO 2019/126037호, 제US 2019/032053호, 제WO 2019/183000호, 및 Tautvydas Karvelis 등은 모두 DNA 표적화에 사용되는 표준 crRNA:tracrRNA 이중체의 일부로 tracrRNA를 변형시킨다. 상기 참고문헌들은 절단된 crRNA 및 tracrRNA를 반영하는 기존 이중체를 개선하려고 시도하는 반면, 본 발명은 변형된 비-자연 발생 tracrRNA를 사용하여 crRNA가 아닌 자연 발생 RNA에 혼성화한다.
임의의 RNA로부터 ncrRNA를 생성하는 능력은 RNA의 존재를 ncrRNA에 의해 특정 표적으로 안내되는 활성 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제에 연관시킨다. 따라서, tracrRNA를 재프로그래밍하면 서열-특이 표적화 활성을 통해 특정 RNA 전사체를 감지할 수 있는 가능성을 보유한다. 이러한 연관성은 Cas12a 및 Cas13을 기반으로 하는 핵산 검출에 사용되는 다른 두 가지 CRISPR 기술과는 다르다. 구체적으로, Chen 등(CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018;360(6387):436-439)은 RNA-가이드 DNA 결합이 ssDNA 분자를 완전히 분해하는 Cas12a에 의한 무분별한 단일-가닥 DNA(ssDNA) 절단 활성을 촉발시킨다는 것을 개시한다. Cas12a ssDNase 활성화와 등온 증폭(isothermal amplification)을 조합하여 "DNA 엔도뉴클레아제-표적화된 CRISPR 트랜스 리포터"(DETECTR)라는 방법을 만들었다. 별도로, Abudayyeh 등(C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016;353(6299):aaf5573)은 추정 유형 VI CRISPR-이펙터 LshC2c2(현재 Cas13a)의 RNA-가이드 RNase 활성을 입증하였다. Gootenberg 등(Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442)은 이러한 "부차적인 효과"가 CRISPR-기반 진단(CRISPR-Dx)을 확립하는데 사용될 수 있어, 아토몰 감도 및 단일-염기 미스매치(mismatch) 특이성을 갖는 신속한 DNA 또는 RNA 검출을 제공할 수 있음을 추가로 개시한다. SHERLOCK(Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)이라고 하는 이러한 Cas13a-기반 분자 검출 플랫폼이 특정 지카 바이러스 및 뎅기열 바이러스 균주를 검출하고, 병원성 박테리아, 유전자형 인간 DNA를 구별하고, 무세포 종양 DNA의 돌연변이를 식별하는데 사용되어 왔다. 두 기술 모두 검출된 핵산의 존재를 출력할 수 있지만, 둘 다 출력으로 비특이 뉴클레아제 활성에 의존한다. 대조적으로, 본 발명은 감지된 RNA에 의해 지시되는 서열-특이 뉴클레아제 활성에 의존한다.
본 발명의 목적은 특히 특정 RNA를 검출하기 위해 분자 진단 분야에서 CRISPR의 상기 발전을 적용하는 것이다. 또 다른 목적 및 이점은 첨부된 실시예를 참조하여 본 명세서를 더욱 연구하면 명백해질 것이다.
이의 제1 측면에서, 본 발명의 목적은 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 상기 방법은 a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); b) 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 대한 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 결합을 검출하는 단계를 포함하고; c) 여기서 상기 결합은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
이의 제2 측면에서, 본 발명의 목적은 세포 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 상기 방법은 a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); b) 상기 뉴클레아제 효소에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단을 검출하는 단계를 포함하고; c) 여기서 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 절단을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
이의 제3 측면에서, 본 발명의 목적은 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 상기 방법은 a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); 및 b) 상기 뉴클레아제에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 닉킹(nicking) 또는 절단하는 단계, c) 예를 들면, 비상동 말단 접합(non-homologous end joining; NHEJ) 수선(repair), 미세상동-매개 말단 접합(microhomology-mediated end joining; MMEJ), 상동-지향 수선(homologous-directed repair; HDR), 프라임 편집(prime editing), 염기 편집, 또는 RNA 편집을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하는 단계, 및 d) 예를 들면, 인델(indel) 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제의 검출 및/또는 상기 프라임 또는 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 적절하게 검출하는 단계를 포함하고; e) 여기서 적어도 하나의 편집된 표적 핵산을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법들은 조합될 수 있으며, 예를 들어 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA는 상기 적어도 하나의 핵산 DNA의 결합, 절단 및/또는 편집에 기반하여 검출될 수 있다.
이의 제4 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 측면 중 어느 것에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 검출된 바와 같은 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)에 기반하여 상기 의학적 상태(medical condition)를 검출하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 의학적 상태를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 여기서 상기 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)와 관련된다.
이의 제5 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 상기 감지된 RNA의 적어도 한 부분에 결합하도록 설계된 비-자연 발생 tracrRNA(여기서, 상기 감지된 RNA는 표적 핵산의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 추가로 포함한다), 및 b) 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 포함하는, 감지된 RNA에 대한 검출 시스템을 제공함으로써 해결된다.
이의 제6 측면에서, 본 발명의 목적은 천연 crRNA:tracrRNA 이중체를 모방하는 복합체를 형성함을 통해 미리 선택된 감지된 RNA 서열에 특이적으로 혼성화하도록 설계된 항-반복 영역 서열을 포함하는 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자를 제공함으로써 해결된다. 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자는 본 발명에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자, 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소, 및 적어도 하나의 감지된 RNA를 포함하는 복합체의 일부일 수 있으며, 적어도 하나의 감지된 RNA 서열을 기반으로 한 또는 기반으로 하여 설계된 서열을 포함하는 표적 DNA 핵산 분자에 추가로 결합될 수 있다.
이의 제7 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 측면 중 어느 것에 따른 방법을 수행하기 위한, 특히 감지된 RNA, 바이러스 감지된 RNA, 질병 마커(disease marker)로부터 전사된 감지된 RNA를 검출하기 위한, 또는 하나 이상의 감지된 RNA에 대한 발현 프로파일(expression profile)을 생성하기 위한 상기 측면에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 감지된 RNA 검출 시스템의 용도를 제공함으로써 해결된다.
이의 제1 측면에서, 본 발명의 목적은 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 상기 방법은 a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은 RNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); b) 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 대한 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 결합을 검출하는 단계를 포함하고; c) 여기서 상기 결합은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
본 발명의 이러한 제1 측면에서, 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 검출은 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 대한 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 결합의 검출에 의존한다. Cas 효소는 표적 핵산을 절단하는 능력과 무관하게 표적 핵산에 결합하고, 이러한 가요성은 상기 결합 활성에 기반하여 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하기 위해 사용된다.
상기 적어도 하나의 표적 핵산에 대한 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 결합은 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 검출 방법에 의해 검출될 수 있고, 뉴클레아제에 대한 항체 및 관심 DNA 서열에 대한 PCR 프라이머(primer)를 사용하는 염색질 면역침전(ChIP) 방법을 포함할 수 있다. 항체는 다른 게놈 DNA 단편 및 단백질-DNA 복합체로부터 단백질-DNA 복합체를 선택적으로 침전시키는데 사용된다. PCR 프라이머는 표적 핵산 서열의 특이적 증폭 및 검출을 가능하게 한다. 정량적 PCR(qPCR) 기술은 표적 핵산 서열의 양이 정량화될 수 있게 한다. ChIP 분석은 어레이-기반 형식(ChIP-on-chip) 또는 면역침전된 단백질에 의해 포획된 DNA의 직접 시퀀싱(ChIP-seq)에 적합하다.
또 다른 방법은 DNA 전기영동 이동성 변화 분석(EMSA), 또는 샘플로부터 단백질-DNA 복합체를 선택적으로 추출하는데 사용되는 풀다운 분석(pull-down assay)을 포함한다. 전형적으로, 풀다운 분석은 비오틴과 같은 고친화성 태그로 표지된 DNA 프로브를 사용하여 프로브를 회수하거나 고정할 수 있다. 비오틴화된 DNA 프로브는 EMSA에서 사용되는 것과 유사한 반응에서 세포 용해물로부터의 단백질과 복합체화된 다음 아가로스 또는 자기 비드를 사용하여 복합체를 정제하는데 사용될 수 있다. 그후 단백질을 DNA로부터 용출하고 웨스턴 블롯으로 검출하거나 질량 분석법으로 식별한다. 대안적으로, 단백질을 친화성 태그로 표지할 수 있거나, DNA-단백질 복합체를 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 단리할 수 있다(초이동 분석과 유사). 이 경우, 단백질에 의해 결합된 미지의 DNA 서열은 서던 블롯팅(Southern blotting), PCR 분석 또는 시퀀싱 분석에 의해 검출된다. DNA 풀다운 분석 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 하이브리드인 마이크로플레이트 캡처 분석(microplate capture assay)은 고정된 DNA 프로브를 포함하여 특정 단백질-DNA 상호작용을 캡처하고 표적-특이 항체로 단백질 정체 및 상대량을 확인하는데 사용될 수 있다. 또한, 뉴클레아제의 결합에 의해 차단되거나 유도될 수 있는 관심 프로모터에 대한 번역 활성의 실시간 생체내 판독(readout)을 제공하는 리포터 분석이 사용될 수 있다. 리포터 유전자는 표적 프로모터 DNA 서열과 리포터 유전자 DNA 서열의 융합체이다. 프로모터 DNA 서열은 연구원에 의해 맞춤화되며 리포터 유전자 DNA 서열은 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 검출 가능한 특성을 가진 단백질을 코딩(code)한다. 이러한 유전자는 관심 프로모터가 활성화될 때만 효소를 생성한다. 효소는 차례로 기질에 형광을 일으키거나 촉매 작용을 하여 빛, 색 변화, 또는 분광 장비로 검출될 수 있는 기타 반응을 생성한다. 리포터 유전자로부터의 신호는 동일한 프로모터로부터 유도되는 내인성 단백질의 전사 또는 번역을 위한 간접 결정인자로서 사용된다.
본 발명의 이러한 측면의 실시양태에서, 바람직하게는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소는 이의 절단 활성에서 적어도 실질적으로 불활성화된다. 예를 들면, RuvC 및 HNH 뉴클레아제 도메인은 모두 점 돌연변이(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes ) Cas9(SpCas9)의 D10A 및 H840A)에 의해 불활성화되어 표적 핵산을 절단할 수 없는 뉴클레아제 사멸 Cas9(dCas9) 분자를 야기할 수 있다. 그럼에도 불구하고, dCas9 분자는 sgRNA 표적화 서열에 기반하여 표적 DNA에 결합하는 능력을 보유한다. 단일-가닥 표적의 경우, HNH 도메인의 파괴는 절단을 방지하기에 충분하지만 결합에는 충분하지 않다(CRISPR RNA-Dependent Binding and Cleavage of Endogenous RNAs by the Campylobacter jejuni Cas9. Mol Cell. 2018;69(5):893-905.e7). 표적 서열이 특히 표적의 PAM-말단 영역에서 미스매치를 포함하는 경우, 뉴클레아제에 의한 절단도 회피된다(Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 2015;12(11):1051-1054). Cas9와 유사하게, Cas12 뉴클레아제에 대한 RuvC 도메인을 돌연변이시켜 뉴클레아제를 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질로 전환할 수 있으며(Identifying and Visualizing Functional PAM Diversity across CRISPR-Cas Systems. Mol Cell. 2016;62(1):137-147), 미스매치를 도입하면 절단을 방지하되 표적 결합은 보존할 수 있다(Multiplexed genome engineering by Cas12a and CRISPR arrays encoded on single transcripts. Nat Methods. 2019;16(9):887-893).
본 발명에 따른 방법은 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다. 본 발명의 맥락에서, 감지된 RNA는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 검출하고자 하는 임의의 관심 RNA이다. 통상적으로 및 바람직하게는, 감지된 RNA는 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 전이 RNA, 작은 RNA, 안티센스 RNA, 작은 핵성 RNA, 마이크로RNA, piwiRNA, 긴 비코딩(non-coding) RNA, 스플라이싱된 인트론 및 원형 RNA와 같은 단일-가닥 RNA 분자이다. RNA는 천연 기원이거나 인공적으로 생성될 수 있다. 단일 가닥 감지된 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 암 세포, 감염된 세포, 또는 병든 세포로부터 비롯될 수 있고/있거나 바이러스, 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아 또는 병원성 박테리아로부터 유래될 수 있다. 감지된 RNA는 본 발명의 방법에서 생성되고 사용되는 바와 같은 비-자연 발생 tracrRNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 제1 부분, 및 적어도 하나의 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 제2 부분을 포함한다.
감지된 RNA는 제1 부분과 제2 부분 중 2개 이상을 포함할 수 있고, 비-자연 발생 tracrRNA는 이에 따라 설계된다. 본 발명의 맥락에서, 표적 핵산은 임의의 적합한 표적 핵산일 수 있지만, 일부 Cas9 및 Cas12 뉴클레아제가 이들 핵산을 표적으로 할 수 있기 때문에 바람직하게는 표적 DNA, 또는 표적 RNA 또는 표적 ssDNA를 포함한다.
감지된 RNA는 감지된 RNA, 비-자연 발생 tracrRNA 및 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소 사이에 형성된 바와 같이 상기 제1 부분으로부터 연장되고 복합체의 외부로 연장되는 5' 및/또는 3' 말단을 추가로 포함할 수 있으며(도 2 참조), dsRNA-절단 효소에 의해 인식되는 부분 및/또는 다른 효소에 의해 절단되거나 소화되는 5'-말단을 포함할 수 있다(도 2 참조). 3'-말단은 이들이 분자(들)를 추가로 안정화시키는 복합체의 혼성화 부분에 확장을 제공할 수 있기 때문에 바람직하다.
감지된 RNA는 적어도 하나의 표적 핵산의 적어도 한 부분과 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 제2 부분을 포함한다. 본 발명에 따른 방법의 제1 측면의 맥락에서, 감지된 RNA, 비-자연 발생 tracrRNA 및 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소 사이의 복합체 형태의 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소(도 2 참조)의 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 대한 이러한 결합은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다. 위에 기술한 바와 같이, 복합체의 검출은 (예를 들어, 항체로) 직접적일 수 있거나 기술한 바와 같은 적합한 분석을 사용하여 간접적일 수 있다. 복합체의 검출은 또한 정량적 검출을 포함할 수 있으며, 즉 검출된 복합체의 양이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 감지된 RNA의 양을 결정하는데 사용된다.
감지된 RNA는 3'- 및/또는 5'-말단에 및/또는 RNA 분자/가닥 내부에 마커를 포함함으로써 표지될 수 있다. 각각의 방법은 숙련가에게 알려져 있다. 감지된 RNA는 또한 RNA와 DNA 및/또는 PNA의 일부의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 바와 같은 핵산 분자의 특정 부분은 다른 분자의 상보적 부분과 특이적으로 혼성화하도록 발견 및/또는 설계된다. 숙련가에게 알려진 바와 같이, 이를 위해, 혼성화 및 세척 조건이 중요하다. 서열이 100% 상보적이라면, 높은 엄격성 혼성화가 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따르면, 혼성화하고/하거나 특이적으로 혼성화하는 부분은 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게는 90% 이상 상보적이며, 보다 바람직하게는 95% 이상 상보적이며, 가장 바람직하게는 100% 상보적이다. 혼성화의 엄격성은 혼성화 온도 및 혼성화 완충액의 염 농도에 의해 결정되며, 고온 및 저염이 보다 엄격하다. 일반적으로 사용되는 세척 용액은 SSC(염수 시트르산나트륨, NaCitrate와 NaCl의 혼합물)이다. 혼성화는 용액에서 수행될 수 있거나 - 보다 일반적으로 - 적어도 하나의 성분이 고체상 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 종이 상에 있을 수 있다. 자주 사용되는 프로토콜은 무지방 분유로부터의 카제인 또는 소 혈청 알부민과 같은 차단 시약을 종종 변성, 단편화된 연어 정자 DNA(또는 고도로 복잡한 임의의 다른 이종 DNA) 및 SDS와 같은 세제와 함께 사용한다. 종종 매우 높은 농도의 SDS가 차단제로서 사용된다. 온도는 42 내지 65℃ 또는 그 이상일 수 있고, 완충액은 3×SSC, 25 mM HEPES, pH 7.0, 0.25% SDS 최종일 수 있다.
RNA-절단 효소는 감지된 RNA의 제1 부분과 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분 사이에 형성된 혼성화된 영역을 절단하거나, ncrRNA의 다른 단일-가닥 말단을 처리한다. 이 효소는 바람직하게는 대장균으로부터의 RNase III이지만 Drosha, Dicer, DCL1, Rntp1 또는 Pac1p와 같은 다른 dsRNA-절단 효소 뿐만 아니라 다른 박테리아 또는 고세균으로부터의 RNase III일 수 있다. RNA-절단 효소는 또한 RNase A와 같은 ssRNA를 절단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 다중화된 환경에서, 시험관내 또는 생체내에서, 전사 기록을 위한 방법에 관한 것이다(예를 들면, 도 13 및 19 내지 22 참조). 생체내 전사 기록에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법을 사용하여, 존재하는 바와 같은 (각각의) 감지된 RNA는 판독 가능한 신호 또는 변형으로 변환된다. 각각의 예에서, 감지된 RNA는 비천연 tracrRNA를 통해 ncrRNA로 전환되고, 그후 ncrRNA는 tracrRNA 의존적 CRISPR 뉴클레아제를 표적 "리포터" DNA로 지시한다. 이러한 "리포터" DNA는 편집을 거쳐, DNA에 유지("저장")되는 검출 가능한 마커, 변형 또는 "편집"을 야기한다. 예는 인델, HDR을 통해 도입된 마커, 염기 편집, 프라임 편집 또는 RNA 편집이다. 한 번의 판독으로서, 리포터 유전자의 발현이 조절될 수 있다. dCas9와 전사 활성화 도메인 VP16 사이의 융합이 도 13b에 나타내어져 있지만, 발현 조절의 많은 다른 모드가 가능하다(예를 들어, 조절 도메인을 모집하는 스캐폴드(scaffold) sgRNA를 사용하여, 부분적으로 돌연변이된 가이드 서열과 쌍을 이루는 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제 또는 촉매적으로-활성인 뉴클레아제를 사용하여 뉴클레아제에 다른 조절 도메인을 융합시킴). 본원에 개시된 바와 같은 다른 방법에 대한 설계의 견고성과 일치하게, 놀랍게도 전사 기록 방법이 높은 G/C 함량 및 비정규 서열과 관련하여 다소 견고한 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 도 20 내지 22, 및 또한 하기 실시예 참조).
전사 기록의 이전 예는 환경적 신호를 감지하거나 세포의 전사 프로파일을 비특이적으로 기록한다. 환경적 기록은 CRISPR 획득 단백질을 발현하는 유도성 프로모터 또는 편집을 유도하는 가이드 RNA에 의존한다. 대조적으로, 비천연 tracrRNA를 사용한 전사 기록은 세포에서 하나 또는 다수의 특정 전사체를 기록할 수 있다. 기록에는 유도성 프로모터가 필요하지 않으며, 비천연 tracrRNA가 어떤 전사체가 기록되는지를 지시한다. 다중 비천연 tracrRNA는 또한 다중 기록을 위해 상응하는 DNA 표적과 조합될 수 있다.
Perli SD(문헌 참조; Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells. Science. 2016 Sep 9;353(6304):aag0511. doi: 10.1126/science.aag0511. Epub 2016 Aug 18. PMID: 27540006)는 인간 세포에서 분자 자극을 DNA 돌연변이로 경도 기록(longitudinal recording)하기 위한 독립형 아날로그 메모리 장치를 개시한다. 이 장치는 stgRNA를 암호화하는 DNA 쪽으로 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 뉴클레아제 활성을 반복적으로 지시하는 자가-표적 가이드 RNA(stgRNA)로 구성되어, stgRNA 발현의 기능으로서 국부적이고 연속적인 DNA 돌연변이 유발을 가능하게 한다. 본 발명자들은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 외인성 유도인자 또는 염증에 의해 유발된 인간 세포에서의 프로그래밍 가능하고 다중화된 메모리 저장을 입증한다. 이러한 도구인 mSCRIBE(Mammalian Synthetic Cellular Recorder Integrating Biological Events)는 생체내 세포 생물학을 조사하기 위한 고유한 전략을 제공하고 표적 DNA 서열의 지속적인 진화를 가능하게 한다.
Farzadfard F 등(문헌 참조; Single-Nucleotide-Resolution Computing and Memory in Living Cells. Mol Cell. 2019 Aug 22;75(4):769-780.e4. doi: 10.1016/j.molcel.2019.07.011. PMID: 31442423; PMCID: PMC7001763)은 박테리아 및 진핵 세포에서 논리 및 메모리를 암호화하기 위한 강력하고 확장 가능한 플랫폼인 DOMINO를 개시한다. DNA 조작을 위한 효율적인 단일-뉴클레오티드-분해능 읽기-쓰기 헤드를 사용하여, DOMINO는 살아있는 세포의 DNA를 계산 및 저장을 위해 주소 지정이 가능하고 읽기 가능하며 쓰기 가능한 매체로 변환한다. DOMINO 연산자는 신호 역학 및 세포 이벤트의 장기 모니터링을 위해 아날로그 및 디지털 분자 기록을 가능하게 한다. 또한, 여러 연산자를 계층화하고 상호연결하여 순서-독립적, 순차적 및 시간적 논리를 암호화할 수 있어, 세포에서 분자 이벤트의 조합, 순서 및 타이밍을 기록하고 제어할 수 있다. 이들은 DOMINO가 수많은 생명공학 및 생물의학 용도를 위한 강력하고 정교한 계산-및-메모리 유전자 회로를 구축하기 위한 토대를 놓는 것이라고 생각한다.
Tang W, 및 Liu DR.(문헌 참조; Rewritable multi-event analog recording in bacterial and mammalian cells. Science. 2018 Apr 13;360(6385):eaap8992. doi: 10.1126/science.aap8992. Epub 2018 Feb 15. PMID: 29449507; PMCID: PMC5898985)는 Cas9 뉴클레아제 및 염기 편집기를 사용하여 게놈 및 염색체외 DNA 함량 모두의 안정적인 변화로서 자극의 진폭, 지속 시간 및 순서를 기록할 수 있음을 개시한다(참조; the Perspective by Ho and Bennett). 다중 자극의 기록 - 항생제, 영양소, 바이러스 및 빛에 대한 노출 뿐만 아니라 Wnt 신호전달 포함 - 은 살아있는 박테리아 및 인간 세포에서 달성되었다. 기록된 메모리는 다중 주기에 걸쳐 지워지고 재기록될 수 있다.
마지막으로, Schmidt, F 등(문헌 참조; Transcriptional recording by CRISPR spacer acquisition from RNA. Nature 562, 380-385 (2018). https://doi.org/10.1038/s41586-018-0569-1)은 CRISPR 스페이서 획득을 사용하여 세포내 RNA를 캡처하고 DNA로 변환하여 전사 정보의 DNA-기반 저장을 가능하게 한다. 대장균에서, 본 발명자들은 산화 스트레스와 같은 복잡한 자극 뿐만 아니라 RNA 바이러스 또는 임의 서열과 같은 정의된 자극이 세포 집단 내에 저장되는 정량화 가능한 전사 기록을 생성한다는 것을 보여준다. 이들은 전사 기록이 복잡한 세포 행동을 분류 및 설명하고 차등 세포 반응을 조정하는 정확한 유전자를 식별할 수 있게 한다는 것을 입증한다. 미래에는, CRISPR 스페이서 획득-매개된 RNA 기록에 이어 딥 시퀀싱(Record-seq)을 사용하여 복잡한 세포 행동 또는 병리학적 상태를 설명하는 전사 이력을 재구성할 수 있다.
세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 표적 DNA의, 특히 다중화된 환경에서, 시험관내 또는 생체내에서, 전사 기록을 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 상기 샘플, 세포 또는 조직을 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); 및 b) 상기 뉴클레아제에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 닉킹 또는 절단하는 단계, c) 예를 들면, 비상동 말단 접합(NHEJ) 수선, 미세상동-매개 말단 접합(MMEJ), 상동-지향 수선(HDR), 검출 가능한 마커, 검출 가능한 변형, 염기 편집, 프라임 편집 또는 RNA 편집을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하는 단계, 및 d) 임의로, 예를 들면, 인델 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제의 검출 및/또는 상기 프라임 또는 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 DNA의 상기 편집을 적절하게 검출하는 단계를 포함하고; e) 여기서 상기 적어도 하나의 표적 DNA의 상기 편집을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 전사를 기록한다. 바람직한 실시양태 및 구성요소는 본원에 기술된 바와 같은 다른 방법과 유사하다.
본 발명에 따른 전사 기록의 바람직한 사용은 마이크로바이옴 및/또는 미생물 감시자(즉, 비침습적 측정을 위한 리포터로서 역할을 하는 공생 박테리아, 예를 들면, 참조; Stewart JR, et al. The coastal environment and human health: microbial indicators, pathogens, sentinels and reservoirs. Environ Health. 2008 Nov 7;7 Suppl 2(Suppl 2):S3. doi: 10.1186/1476-069X-7-S2-S3. PMID: 19025674; PMCID: PMC2586716)의 분석, 및 생체내에서, 예를 들어 전체 유기체에서 또는 예를 들어 환경에서 채취한 샘플을 기반으로 하여 바이러스 또는 박테리아 확산(예를 들어, 폐수 샘플에서 검출된 바이러스 또는 내성 박테리아의 확산)의 추적과 관련된다.
캄필로박터 제주니(Cje)의 84-21 균주를 사용한 본 발명의 맥락에서의 연구 동안, 본 발명자들은 CjeCas9와 공동-면역침전되는 RNA를 평가하였다. 한 세트는 해당 균주의 crRNA2에 대한 상보성을 공유하는 반면, 다른 세트는 crRNA 성숙을 담당하는 트랜스-작용성 CRISPR RNA(tracrRNA)의 항-반복 부분에 대한 상보성을 공유하였다. 이 결합은 tracrRNA가 반복체로부터 crRNA를 처리하여 성숙한 crRNA를 형성하는 방법과 유사하였다. 이러한 통찰은 crRNA가 단지 CRISPR 어레이 및 CRISPR-Cas 시스템 내에서 유래될 수 있다고 생각되었지만 성숙한 crRNA(Cas9을 이들의 표적으로 안내함)는 mRNA 및 CRISPR 어레이에 의해 암호화된 것 이외의 다른 RNA로부터 유래될 수 있다는 첫 번째 표시를 제공하였다.
본 발명의 맥락에서 놀랍게도, tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소 시스템이 매우 다양하고 특이적 진단 도구를 제공하기 위해 특정 방식으로 설계될 수 있다는 것이 발견되었다. 이 도구의 필수 요소는 비-자연 발생 tracrRNA의 설계이다. tracrRNA의 특정 변형 및 이에 따른 "재프로그래밍"은 목적-특이적 ncrRNA의 생성을 가능하게 한다. 흥미롭게도, tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소 시스템은 tracrRNA의 재프로그래밍이 잠재적으로 Cas9 인식 및 활성을 방해할 것이라는 예상에도 불구하고 여전히 기능적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 맥락에서, tracrRNA 항-반복체에 상보적인 모티프로 확인된 RNA는 처리된 crRNA의 대략적인 크기(36 - 37 nts)를 가졌다. (fliF 유전자로부터 유래된) 하나의 구체적인 예에서, ncrRNA는 crRNA의 아키텍처와 일치하였다(~24nt 가이드 + ~12nt 처리된 반복체). 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA의 상기 부분이 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 11개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 12개 이상의 뉴클레오티드와 혼성화하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 바람직한 범위는 9 내지 15개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 10 내지 14개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 12개의 뉴클레오티드이다. 상기 언급된 바와 같이, 복합체에서의 혼성화 부분으로의 확장(tracrRNA의 5' 확장, ncrRNA로의 5'-확장)이 가능하고 바람직하며, 복합체를 보다 안정하게 형성할 수 있는 이점을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같은 비-자연 발생 tracrRNA는 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하여, 기본적으로 crRNA와 tracrRNA 사이에 형성된 원래의 반복체:항-반복 줄기를 모방한 줄기-유사 2차 구조를 형성한다. 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA의 상기 부분이 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 11개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 12개 이상의 뉴클레오티드와 혼성화하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.
상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분이 PAM을 포함하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다(도 14 참조). 예로서, Cas12 뉴클레아제의 경우 PAM은 생성된 ncrRNA의 가이드 부분의 상류에 있는 반복 부분 내에 존재하는 반면, Cas9의 경우 PAM은 ncrRNA의 가이드 부분의 하류에 있는 반복 부분에 존재한다. 적절한 PAM을 갖는 표적을 선택함으로써, 생성된 crRNA는 이의 자체 DNA 부위를 표적으로 할 수 있으며, 즉, ncrRNA가 ncrRNA를 야기하는 DNA를 표적으로 할 수 있게 한다. 이것은 유전자가 전사될 때만 편집을 가능하게 한다. 이러한 전략은 예를 들어 유전자의 발현 프로파일에 따라 특정 조직에서만 편집을 크게 제한하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 더 넓은 PAM 부위 패널을 인식하기 위해, 예를 들어, Cas9의 PAM 상호작용(PI) 도메인의 핵심 영역을 관련 Cas9 이종상동체 패널의 해당 영역으로 대체함으로써 뉴클레아제를 변형할 수 있다(예를 들면, 참조; Ma et al., Engineer chimeric Cas9 to expand PAM recognition based on evolutionary information. Nat Commun. 2019 Feb 4;10(1):560. doi: 10.1038/s41467-019-08395-8). 이것은 세포에서 가능한 게놈 표적을 확대한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 비-자연 발생 tracrRNA는 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하여, 기본적으로 원래의 반복체:항-반복 줄기를 모방하는 줄기-유사 2차 구조를 형성한다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 이러한 줄기-유사 2차 구조는 확장될 수 있다(즉, 3'는 mRNA로, 5'는 비-자연 발생 tracrRNA로 확장되어 dsRNA, 및 이에 따라 RNase III 인식 부위 또는 도메인을 생성한다. 이 구조는 특정 분석에서, 예를 들어, 검출 가능한 그룹을 RNase 활성에 의해 절단될 수 있는 줄기 확장부에 부착할 때 사용될 수 있다. 본 발명자들은 RNase III에 의해 인식되고 절단된 반복체-항-반복 줄기에서 미스매치를 평가하였다. ncrRNA 변이체는 tracrRNA로 발현되었다. tracrRNA를 보존하기 위해 ncrRNA에서 돌연변이가 이루어졌다. 전반적으로, 큰 돌연변이라도 용인될 수 있다. 이론에 결부시키고자 함이 없이, 이것은 RNase III가 Cas9 활성에 필수적일 수 있음을 시사한다.
또한, ncrRNA가 기존의 crRNA에서 얼마나 벗어날 수 있는지 본 발명자들에 의해 분석되었으며, 이는 기본적으로 천연 이중체에서 원래의 반복체:항-반복 줄기를 모방하는 줄기-유사 2차 구조와 관련하여 시스템의 "견고함"을 나타낸다(상기 참조). Cas9에 의해 결합된 염기 줄기에 특별한 초점이 맞춰졌다. 반복체를 돌연변이시켜 벌지(bulge)를 생성함으로써 tracrRNA를 보존하였다. 결과는 특히 벌지가 더 작거나, 줄기의 베이스에서 멀리 떨어져 있거나, 반복되는 쪽에 있을 때 벌지가 상당한 정도로 허용될 수 있음을 보여준다. 줄기에 일부 미스매치를 수용할 때 매우 유사한 결과가 발견되었다. 뒷받침되는 데이터에 대해서는 도 5 내지 9를 참조한다.
본 발명자들은 ncrRNA가 기존의 crRNA에서 얼마나 벗어날 수 있는지 추가로 분석하였으며, 이는 기본적으로 천연 이중체에서 원래의 반복체:항-반복 줄기를 모방하는 줄기-유사 2차 구조와 관련하여 시스템의 "견고함"을 나타낸다(상기 참조). 두 번째 특정 초점은 Cas12에 의해 결합된 염기 줄기에 두 번째 특정 초점이 맞춰졌다. 반복체를 돌연변이시켜 벌지를 생성함으로써 tracrRNA를 보존하였다. 결과는 특히 벌지가 더 작거나, 줄기의 베이스에서 멀리 떨어져 있거나, 반복되는 쪽에 있을 때 벌지가 상당한 정도로 허용될 수 있음을 보여준다. 줄기에 일부 미스매치를 수용할 때 매우 유사한 결과가 발견되었다. 뒷받침되는 데이터에 대해서는 도 23 내지 25를 참조한다.
따라서, Cas 9 및 Cas12의 두 가지 예에서 나타난 바와 같이, ncrRNA는 기존의 crRNA에서 벗어날 수 있으며, 이는 기본적으로 천연 이중체에서 원래의 반복체:항-반복 줄기를 모방하는 줄기-유사 2차 구조와 관련하여 시스템의 "견고함"을 나타낸다(상기 참조).
또한, 상이한 RNA를 crRNA로 전환하기 위해 tracrRNA를 재프로그래밍하는 효과를 시험하였다. TXTL에서 sgRNA 및 CjeCas9를 사용한 반복체:항-반복 이중체의 변화를 평가하였으며, 표적 절단에 거의 영향을 주지 않으면서 모든 변화가 수용될 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 4 참조). 특히, 반복체와 항-반복 간의 이중체는 CjeCas9에 의한 표적화 활성에 거의 영향을 미치지 않으면서 상이한 서열을 수용할 수 있다(도 4). 돌연변이는 표적 절단까지의 시간에 제한된 영향을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 또한 반복체와 항-반복 간의 이중체는 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 양쪽에 일부 벌지를 수용할 수 있으며(도 5), 반복체와 항-반복 간의 이중체는 또한 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 미스매치를 수용할 수 있다(도 6). 대부분의 이중체는 벌지의 존재에도 불구하고 표적화 활성을 유지하였다. RNase III 처리에 관여하는 반복체:항-반복 이중체의 영역은 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 미스매치 및 벌지를 또한 수용할 수 있다(도 7). 도 8은 crRNA의 5' 말단 또는 3' 말단으로의 확장이 CjeCas9에 의한 표적화 활성에 제한된 영향을 미친다는 것을 보여준다. 유사한 규칙이 Cas12 및 본원에 개시된 다른 효소에 적용된다(도 22 내지 25 참조).
또한 감지된 RNA를 활성 crRNA로 전환하는 비천연 tracrRNA는 CjeCas9(도 9), SpyCas9(도 10) 및 Sth1Cas9(도 11)에서 잘 기능하는 것으로 나타났다. 본 발명에 따르면, 비천연 tracrRNA는 감지된 RNA로부터 CjeCas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 설계될 수 있다(도 9). 설계 후, TXTL 결과는 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증한다. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계되었다. 전반적으로, 시험된 5개의 모든 비천연 tracrRNA는 강한 절단 활성을 초래하였다. 또 다른 측면에서, 비천연 tracrRNA는 감지된 RNA로부터 SpyCas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 설계될 수 있다(도 10). 다시, 시험된 5개의 모든 비천연 tracrRNA는 강한 절단 활성을 초래하였다. 따라서, CjeCas9와 다른 기타 Cas9(SpyCas9, Sth1Cas9)는 재프로그래밍된 tracrRNA와 함께 사용되어 감지된 RNA를 활성 crRNA로 전환할 수 있다. 다시, 유사한 규칙이 Cas12 및 본원에 개시된 다른 효소에 적용된다.
감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하여 Cas 단백질의 핵산 표적을 정의하여 crRNA-유사 ncrRNA를 생성한다. 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다.
비-자연 발생 tracrRNA는 표준 방법에 따라 생산되고, 예를 들어 합성에 의해 생산되고, 시험관내 전사에 의해 생성되고/되거나 플라스미드로 클로닝될 수 있다. tracrRNA는 자연 발생 서열로부터 유래될 수 있으며 그후 경우에 따라 분자에서 서열을 생성하기 위해 변형된다. tracrRNA는 표지 또는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 이노신 등과 같은 추가 변형을 추가로 포함할 수 있다.
이의 제2 측면에서, 본 발명의 목적은 세포 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 상기 방법은 a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III 효소와 같은 ssRNA 및/또는 dsRNA 절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); b) 상기 뉴클레아제 효소에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단을 검출하는 단계를 포함하고; c) 여기서 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 절단을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
사용된 바와 같은 구성요소에 대한 이러한 제2 측면의 기본 원칙은 상기와 같지만, 본 발명의 측면에서, 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서의 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 검출은 상기 뉴클레아제 효소에 의한 상기 샘플에서의 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단의 검출에 의존하고, 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 절단을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
표적 핵산을 기반으로 하는 결합 및/또는 절단 생성물의 검출은 직접적(예를 들어, 절단된 핵산의 크기 변화 검출)이거나 소광제를 갖거나 갖지 않는 적합한 형광단을 사용하여 간접적일 수 있다. 핵산을 절단하면 검출될 수 있는 형광단이 방출될 수 있고, 절단된 핵산을 나노포어 시퀀서를 통해 통과시키면 변화가 검출되고, 형광 표지된 뉴클레아제가 국소화될 수 있고/있거나 절단이 검출될 수 있는 전류에 영향을 미칠 수 있다. 절단된 생성물의 검출은 또한 정량적 검출을 포함할 수 있으며, 즉 검출된 바와 같은 단편(들)의 양이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 감지된 RNA의 양을 결정하는데 사용된다.
결합의 검출은 리포터 유전자의 발현 조절에 기초하여 간접적일 수 있다. 적어도 하나의 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제는 리포터 유전자의 프로모터 또는 코딩 영역에 결합함으로써 전사를 직접 억제할 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제는 발현을 상향조절하는 도메인(예를 들어 VP16, VPR) 또는 발현을 하향조절하는 도메인(예를 들어 KRAB)과 같은 유전자 발현의 국부적 조절을 담당하는 조절 도메인을 모집할 수 있다. 도메인은 적어도 하나의 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제에 작동가능하게 연결될 수 있다. 도메인은 적어도 하나의 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제 및/또는 tracrRNA에 융합된 결합 도메인과의 상호작용을 통해 모집될 수 있다.
이의 제3 측면에서, 본 발명의 목적은 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 해결되며, 상기 방법은 a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III 효소와 같은 ssRNA 및/또는 dsRNA 절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); 및 b) 상기 뉴클레아제에 의해 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 닉킹 또는 절단하는 단계, c) 예를 들면, 비상동 말단 접합(NHEJ) 수선, 미세상동-매개 말단 접합(MMEJ), 상동-지향 수선(HDR), 프라임 편집, 염기 편집, 또는 RNA 편집을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하는 단계, 및 d) 예를 들면, 인델 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제의 검출 및/또는 상기 프라임 또는 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 적절하게 검출하는 단계를 포함하고; e) 여기서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다.
사용된 바와 같은 구성요소에 대한 이러한 제3 측면의 기본 원칙은 상기와 같지만, 본 발명의 이러한 측면에서, 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 검출은 상기 뉴클레아제 효소에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단을 검출하고, 상기 절단된 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하고, 또한 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 적절하게 검출하는 것에 의존하며, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 검출하는 것은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출한다. 따라서, 이러한 측면은 감지된 RNA에 의해 제어되거나 유발("구동")되는 표적 핵산에 대한 변화를 검출하는 것에 의존한다.
상기 절단된 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하는 것은 바람직하게는 비상동 말단 접합(NHEJ) 수선, 미세상동-매개 말단 접합(MMEJ), 상동-지향 수선(HDR), 및/또는 염기 편집을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 또는 단일 세포 접합자는 일반적으로 오류가 발생하기 쉬운 비-상동 말단 접합(NHEJ) 수선 경로를 사용하여 Cas9 절단된 DNA를 수선하며, 이것은 이중-가닥 절단을 수선하기 위해 DNA 염기를 무작위로 삽입하거나 결실한다. NHEJ 수선으로부터의 가장 일반적인 인델은 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개 뉴클레오티드에 이른다. 세포 유형 및 상태에 따라 종사할 수 있는 숙련가에게 다수의 수선 경로가 알려져 있다.
상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 검출하는 것은, 예를 들면, 인델 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제의 검출, 및/또는 예를 들어, 시퀀싱, 제한 분해(restriction digest) 및 또는 표적 핵산의 길이 변화의 검출을 통한 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함할 수 있다. 상기와 같이, 표적 핵산에 기초한 절단 생성물의 검출은 직접적(예를 들어, 절단된 핵산의 크기 변화 검출)이거나 적합한 형광단을 사용하여 간접적일 수 있다. 핵산을 절단하면 검출될 수 있는 형광단이 방출될 수 있고, 절단된 핵산을 나노포어 시퀀서를 통해 통과시키면 변화가 검출되고, 형광 표지된 뉴클레아제가 국소화될 수 있고/있거나 절단이 검출될 수 있는 전류에 영향을 미친다. 절단된 생성물의 검출은 또한 정량적 검출을 포함할 수 있으며, 즉 검출된 바와 같은 단편(들)의 양이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 감지된 RNA의 양을 결정하는데 사용된다.
검출된 바와 같은 상기 인델의 길이가 약 1 내지 15개, 보다 바람직하게는 약 1 내지 9개 뉴클레오티드이고 임의로 상기 인델이 시퀀싱, 제한 분해 및/또는 표적 핵산의 길이 변화의 검출 및 qPCR을 통해 검출될 수 있는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 하나의 바람직한 측면에서, 이것은 소위 반복적인 자기-표적화에 의한 유전자 편집의 효율성의 개선을 가능하게 할 것이다. 대부분의 경우 인델의 존재는 서열의 재표적화를 가능하게 하여 재공격을 야기한다. 그후 이 접근법은 더 큰 크기의 인델 및/또는 상동 재조합의 더 높은 빈도를 야기할 수 있으며, 그 이유는 일부 인델이 상기 재공격을 방해하지 않기 때문이다. 실제로, 이러한 접근법은 유리하게는 계통 추적의 추적조사를 허용한다.
검출될 수 있는 염기 편집은 편집의 고유한 수단을 나타낸다. 일반적으로, 염기 편집기에는 두 가지 부류가 있다--시토신 염기 편집기(CBE) 및 아데닌 염기 편집기(ABE). 시토신 염기 편집기는 Cas9 닉카제 또는 촉매적으로 불활성인 "사멸된" Cas9(dCas9)를 APOBEC와 같은 시티딘 데아미나제에 융합함으로써 생성된다. 염기 편집기는 본 시스템에 의해 특정 유전자좌를 표적으로 하며, 이들은 PAM 부위 근처의 작은 편집 창 내에서 시티딘을 우리딘으로 전환할 수 있다. 우리딘은 후속적으로 염기 절제 수선을 통해 티미딘으로 전환되어 C에서 T로의 변화(또는 반대쪽 가닥에서 G에서 A로)를 생성한다. 아데노신 염기 편집기는 아데노신을 이노신으로 전환하도록 설계되었으며, 이는 세포에 의해 구아노신처럼 처리되어 A에서 G로의(또는 T에서 C로의) 변화를 생성한다. 아데닌 DNA 데아미나제는 자연계에 존재하지 않지만, tRNA 아데닌 데아미나제인 대장균 TadA의 유도 진화에 의해 생성되었다. 시토신 염기 편집기와 마찬가지로, 진화된 TadA 도메인은 Cas9 단백질에 융합되어 아데닌 염기 편집기를 생성한다.
두 가지 유형의 염기 편집기는 고 충실도(high fidelity) Cas9를 포함한 다중 Cas9 변이체와 함께 이용 가능하다(하기 참조). 융합체의 발현을 최적화하거나, 편집 창을 조정하기 위해 Cas 변이체와 데아미나제 사이의 링커 영역을 변형하거나, DNA 글리코실라제 억제제(UGI) 또는 박테리오파지 Mu-유도된 Gam 단백질(Mu-GAM)와 같은 생성물 순도를 증가시키는 융합체를 추가함으로써 추가 발전이 이루어졌다. 많은 염기 편집기가 PAM 서열에 근접한 매우 좁은 창에서 작동하도록 설계되었지만, 일부 유용한 염기 편집 시스템은 더 넓은 편집 창에서 광범위한 단일-뉴클레오티드 변이체(체세포 초돌연변이)를 생성하며, 따라서 유도 진화 용도에 매우 적합하다. 이러한 염기 편집 시스템의 예는 표적화된 AID-매개 돌연변이유발(TAM) 및 Cas9가 활성화-유도 시티딘 데아미나제(AID)에 융합된 CRISPR-X를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 생체내에서, 예를 들면 세포, 조직 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서, 또는 시험관내에서, 샘플에서 수행된다. 샘플은 고체 또는 액체 샘플일 수 있으며, 세포를 포함하는 샘플 및 무세포 시험관내 샘플로부터 선택될 수 있다. 세포는 바람직하게는 식물 세포 또는 동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포이다. 샘플은 바람직하게는 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 가래, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉막 삼출액, 장액, 고름, 또는 피부 또는 점막 표면의 면봉으로 채취한 표본으로부터 수득된 생물학적 샘플일 수 있다. 하나의 측면에서, 세포, 조직 및/또는 샘플은 조악한 샘플일 수 있고/있거나 여기서 하나 이상의 핵산 분자는 방법의 적용 전에 샘플로부터 정제 또는 증폭되지 않는다. 또 다른 측면에서, 세포, 조직 및/또는 샘플은 정제되거나 부분적으로 정제된(풍부화된) 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 핵산 분자는 방법을 적용하기 전에 샘플로부터 정제 또는 증폭된다. 또 다른 측면에서, 세포는 공기, 자연 수역(예를 들어, 강, 호수, 바다), 폐수 또는 토양과 같은 환경 샘플의 일부일 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있으며, 예를 들어 로봇에 의해 완전히 또는 부분적으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 수득된 바와 같은 결과의 수행 및/또는 분석을 위한 컴퓨터 및 각각의 데이터베이스의 사용을 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 여러 또는 심지어 다수의 표적 핵산이 하나 이상의 샘플, 조직 및/또는 세포에서, 바람직하게는 다수의 샘플, 조직 및/또는 세포에서 분석된다. 하나의 측면에서, 여러 또는 심지어 다수의 감지된 RNA가 하나 이상의 샘플, 조직 및/또는 세포에서, 바람직하게는 여러 또는 심지어 다수의 샘플, 조직 및/또는 세포에서 검출된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 비자연 발생 tracrRNA가 선택, 설계, 생성(생산, 상기 참조) 및 사용되며, 각각은 하나 이상의 샘플, 조직 및/또는 세포에서, 바람직하게는 여러 또는 심지어 다수의 샘플, 조직 및/또는 세포에서 상기 감지된 RNA의 다른 부분과 특이적으로 혼성화한다.
본 발명의 시스템은, 예를 들면, 다중 tracrRNA를 단일 플라스미드로 클로닝함으로써 2 내지 7개의 유전자좌 어디든지 표적화할 수 있다. 이러한 다중체 tracrRNA 벡터는 본 발명의 측면에서 사용하기 위해 전술한 CRISPR 뉴클레아제 중 어느 것과 적절하게 조합될 수 있다고 생각할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA는 단일 또는 초기에 이중 가닥이다. 본 발명의 맥락에서, 감지된 RNA는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 검출하고자 하는 임의의 관심 RNA이다. 통상적으로 및 바람직하게는, 감지된 RNA는 mRNA 또는 비코딩 RNA와 같은 단일-가닥 RNA 분자이다. RNA는 천연 기원이거나 인공적으로 생성될 수 있다. 단일 가닥 감지된 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 면역 세포, 암 세포, 감염된 세포, 또는 병든 세포로부터 비롯될 수 있고/있거나 바이러스, 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아 또는 병원성 박테리아로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA는 지카 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자, 단순 헤르페스 바이러스 I, 단순 헤르페스 바이러스 II, 유두종 바이러스, 광견병 바이러스, 시토메갈로바이러스, 인간 혈청 파보-유사 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 볼거리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 사마귀 바이러스, 청설 바이러스, 센다이 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스, 소아마비 바이러스, 유인원 바이러스 40, 마우스 유선 종양 바이러스, 뎅기열 바이러스, 풍진 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 및 황열병 바이러스로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 나이세리아 고노르호에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 뉴모코커스(Pneumococcus), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 라임병 스피로케테스(Lyme disease spirochetes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 및 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus)로부터 선택된 병원성 박테리아로부터 유래된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 감지된 RNA는 전사 및/또는 발현이 예를 들어 대사 요인 또는 신호, 호르몬(hormone), 병원체(pathogen), 독소(toxin), 약물, 노화 및/또는 생물적 또는 비생물적 스트레스와 같은 외부 요인에 반응하여 변형되는 유전자로부터 유래된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 감지된 RNA는 환경, 종(species), 균주, 질병, 세포 및/또는 조직 특이적이도록 선택된다. 이러한 측면에서, 본 발명의 방법은 선택된 바와 같은 감지된 RNA에 기초하여 세포 또는 유기체를 확인 및/또는 그룹화하는데 도움이 된다. 적어도 하나의 감지된 RNA는 바람직하게는 바이러스 감염, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스로부터 선택된 상태와 관련된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 감지된 RNA는 단계 a) 전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가될 수 있고/있거나 상기 방법은 DNA의 RNA로의 시험관내 전사, RNA의 DNA로의 역전사, 및 - 최적으로 - 상기 DNA의 RNA로의 후속 시험관내 전사로부터 선택된 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다. 이것은 적절하거나 원하는 신호 증폭을 제공하기 위해 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 세포, 조직 또는 샘플에서 감지된 RNA는 약 500 fM 내지 약 1 uM, 예를 들어 약 500 fM 내지 약 1 nM의 범위로 존재하고, 바람직하게는 약 1 pM 내지 약 1 nM 범위로 존재한다. 최적으로, 상기 방법은 세포, 조직 및/또는 샘플당 단일 분자를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 예를 들면, 문헌[Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants (Nat Rev Microbiol. 2020;18(2):67-83)]에 열거된 바와 같이 결합 기능을 위해 tracrRNA를 필요로 하는 한 모든 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소가 사용될 수 있으며, 이의 목록은 본원에 참고로 포함된다. 바람직하게는, 뉴클레아제는 유형 II Cas9 및 유형 V Cas12 뉴클레아제 효소 뿐만 아니라 최근에 확인된 CasX(현재 유형 V-E)로부터 선택된다(Liu et al. CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature, 2019 Feb; 566(7743): 218-223). 예는 II-A, -B 및 -C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유형 II Cas9 뉴클레아제 및 유형 V-B, -C, -D, -E, -F, -G, 및 -K로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유형 Cas12 뉴클레아제이다. 통상적으로, Cas 뉴클레아제를 도입하고 발현하기 위해 적절한 플라스미드 시스템이 사용된다. 2013년에 인간 병원성 박테리아 프란시셀라 툴라렌시스 ( Francisella tularensis )에서 처음으로 알려진 유형 V 시스템으로 확인된 유형 V-A는 시그니처 이펙터 단백질 Cas12a(이전에는 Cpf1로 지정됨)를 갖는다. Shmakov 등은 2015년에 유형 V-B 및 유형 V-C를 확인하였고, Harrington 등은 2018년에 유형 V-F를 확인하였고, Yan 등은 2019년에 유형 V-G, 유형 V-H, 및 유형 V-I를 확인하였다. 게놈-분석 메타게노믹스를 통해 지하수 및 퇴적물 샘플에서 배양되지 않은 박테리아를 쿼리함으로써, Burstein과 동료들은 2017년에 유형 V-D 및 유형 V-E를 확인하였다(Tong B, et al. The Versatile Type V CRISPR Effectors and Their Application Prospects. Front Cell Dev Biol. 2021 Feb 4;8:622103. doi: 10.3389/fcell.2020.622103. PMID: 33614630; PMCID: PMC7889808).
Deltcheva 등(문헌 참조; CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011; 471(7340):602-607. doi:10.1038/nature09886)은 인간 병원균 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes )의 차등 RNA 시퀀싱이 crRNA 전구체 전사체의 반복 영역에 대해 24개 뉴클레오티드 상보성을 갖는 트랜스-암호화된 작은 RNA인 tracrRNA를 알아냈다고 보고하였다. 이들은 tracrRNA가 널리 보존된 내인성 엔도리보뉴클레아제 RNase III 및 CRISPR-관련 Cas9(Csn1) 단백질의 활성에 의해 crRNA의 성숙을 지시한다는 것을 보여주며; 이러한 모든 구성요소는 프로파지-유래 DNA로부터 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)를 보호하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다. tracrRNA는 반복 영역과 쌍을 이루어, RNase III에 대한 기질을 제공한다. sgRNA를 사용하는 유형 V-B/C/E/F/G/K 뉴클레아제의 모든 예는 tracrRNA에 효과적으로 의존하고 있다. 그후 절단된 RNA 이중체는 Cas9에 의해 결합되고, crRNA 부분이 DNA 표적화를 지시한다. 또한, tracrRNA는 하위유형 V-B 시스템에서 확인되었지만 이 경우 절단 효소는 특성화되지 않고 남아있다(Liu L, Chen P, Wang M, Li X, Wang J, Yin M, Wang Y. 2017C2c1-sgRNA complex structure reveals RNA-guided DNA cleavage mechanism. Mol. Cell 65, 310-322).
본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소는 변형, 예를 들어 돌연변이, 및/또는 재조합 융합 단백질이다. 주어진 RNA 표적화 서열은 부분적 상동성이 존재하거나, 예를 들어 시험관내 진단의 일부로서, 서로 유사한 다중 표적 핵산이 존재할 수 있는 게놈 전체에 걸쳐 추가 부위를 가질 것이다. 이러한 부위를 오프-타겟(off-target)이라고 하며 ncrRNA를 설계할 때 고려되어야 한다. RNA 설계를 최적화하는 것에 더하여, CRISPR 특이성이 또한 Cas9에 대한 변형을 통해 증가될 수 있다. 높은 특이성이 중요하다면 이중 닉-유도(nick-induced) 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 이중 닉카제(nickase) 접근법을 사용하는 것이 사용될 수 있으며, 이는 특정 유전자 편집을 위해 HDR-매개된 유전자 편집과 조합될 수도 있다. 또 다른 접근법은 고 충실도 효소라고 하는 돌연변이된 Cas 뉴클레아제를 사용하는 것이다. 예를 들면, PACE(phage-assisted continuous evolution) 방법은 REC2, REC3 및 PAM 상호작용 도메인에서 발견되는 7개의 돌연변이를 갖고 확장된 PAM 인식 뿐만 아니라 증가된 특이성 및 낮은 오프-타겟 활성을 허용하는 xCas9 3.7을 생성하였다. 따라서, tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소는 PAM-인식을 변경하기 위해 PAM 상호작용 도메인에서 돌연변이될 수 있다. 또 다른 예로서, SpCas9 변이체의 풀링된 라이브러리로 형질전환된 대장균 세포를 스크리닝함으로써, 야생형 Cas9보다 오프-타겟 활성이 덜한 소위 Sniper-Cas와 같은 돌연변이된 변이체가 확인될 수 있다(Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nat Commun. 2018 Aug 6;9(1):3048, Lee, J., Jung, M. h., Jeong, E., Lee, J. K. Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution. J. Vis. Exp. (144), e59202, doi:10.3791/59202 (2019)).
예를 들면, Cas9는 전사 억제인자 또는 활성화제와 융합될 수 있으며, 이러한 dCas9 융합 단백질을 프로모터 영역에 표적화하면 다운스트림 표적 유전자의 강력한 전사 억제(CRISPR 간섭 또는 CRISPRi) 또는 활성화(CRISPRa)가 초래된다. 가장 단순한 dCas9-기반 활성화제 및 억제인자는 단일 전사 활성화제(예를 들어 VP64) 또는 억제인자(예를 들어 KRAB)에 직접 융합된 dCas9로 구성된다. 또한, 에피토프-태그된 dCas9 및 항체-활성화제 이펙터 단백질(예를 들어 SunTag® 시스템)의 공동 발현; 여러 상이한 활성화 도메인에 연속적으로 융합된 dCas9(예를 들어 dCas9-VPR; 또는 dCas9-VP64와 변형된 스캐폴드 sgRNA 및 추가 RNA-결합 헬퍼 활성화제(예를 들어, SAM 활성화제)의 공동 발현과 같은 포유동물 세포에서 표적 유전자의 보다 강력한 활성화를 위한 활성화 전략이 개발되었다. 중요하게는, Cas9 또는 Cas9 닉카제에 의해 유도된 게놈 변형과 달리, dCas9-매개된 유전자 활성화 또는 억제는 게놈 DNA를 영구적으로 변형하지 않기 때문에 가역적이다. dCas9는 또한 마우스 및 인간 세포에서 유전자 발현을 활성화하거나 억제하기 위한 게놈-와이드 스크린에 사용되었다. 합성 CRISPR-Cas 유전자 활성화제는 활성화 단백질을 모집하기 위해 gRNA 및 RNA 헤어핀을 포함하는 스캐폴드 RNA를 사용함으로써 박테리아를 위해 개발되었다. CRISPRi는 또한 Mobile-CRISPRi라는 모듈식 시스템을 사용하여 다양한 박테리아 종에 적용될 수 있다. 이 시스템에서, CRISPRi는 접합을 사용하여 박테리아에 도입되고 염색체에 안정적으로 통합된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 측면에서, 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함한다. 예로서, Cas12 뉴클레아제의 경우, PAM은 생성된 ncrRNA의 가이드 부분의 상류에 있는 반복 부분 내에 존재하는 반면, Cas9의 경우 PAM은 ncrRNA의 가이드 부분의 하류에 있는 반복 부분에 존재한다. 적절한 PAM을 갖는 표적을 선택함으로써, 생성된 crRNA는 이의 자체 부위를 표적으로 할 수 있다. 이것은 유전자가 전사된 경우에만 편집을 허용한다. 이러한 전략은 표적화하고자 하는 유전자의 발현 프로파일에 따라, 예를 들면 특정 조직에 대한 편집을 크게 제한한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 감지된 RNA 및 비-자연 발생 tracrRNA는 dsRNA를 생성하고, 따라서 RNase III 효소 인식 부위 또는 도메인과 같은 dsRNA 절단 효소를 생성한다. RNase A와 같은 ssRNA 절단 효소는 또한 추가 처리를 촉진하거나 ncrRNA로 전환되지 않은 RNA를 제거하기 위해 적용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 감지된 RNA에서 상기 dsRNA 절단 효소 기질은 10개 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 최대 약 50개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 바람직하게는 11개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 12개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 바람직한 범위는 9 내지 15개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 10 내지 14개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 12개의 뉴클레오티드이다.
또 다른 측면에서, 혼성화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 부분은 서로에 대해 적어도 80% 상보적이며, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상보적이다. 상기 논의된 바와 같이, 놀랍게도 ncrRNA가 기존의 crRNA에서 벗어날 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 기본적으로 원래의 반복체:항-반복 줄기를 모방하는 줄기-유사 2차 구조와 관련하여 시스템의 "견고함"을 나타내며, Cas9 및 Cas12에 의해 결합된 염기 줄기에 특별한 초점이 맞춰졌다(도 20-25 참조). 결과는 특히 벌지가 더 작거나, 줄기의 베이스에서 멀리 떨어져 있거나, 반복되는 쪽에 있을 때 벌지가 상당한 정도로 허용될 수 있음을 보여준다. 줄기에 일부 미스매치를 수용할 때 매우 유사한 결과가 발견되었다. 따라서, 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 tracrRNA의 상기 적어도 하나의 부분의 뉴클레오티드 서열은 상기 감지된 RNA에 대한 상기 제1 부분에 적어도 80% 상보적, 바람직하게는 90% 이상 상보적, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상보적이 되도록 하기 위해 생산 및/또는 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 측면에서, 상기 방법은, 적어도 부분적으로, 정량적 분석을 포함한다. 따라서, 변형된 바와 같은 적어도 하나의 표적 핵산, 예를 들어, 절단 및/또는 편집된 생성물 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 RNA, 뿐만 아니라 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 결합된 표적 핵산의 양을 검출함을 포함하는 단계가 바람직하다. 바람직하게는 대조군과 비교할 때 샘플, 조직 및/또는 세포당 양이 결정된다. 정량 분석은 숙련가에게 알려져 있으며, 흡광도(예를 들어, UV, 분광광도법) 및/또는 형광 분석, 및 실시간 PCR을 포함할 수 있다. 분석은 정량된 바와 같은 핵산(들)(변형된 적어도 하나의 표면 핵산 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 RNA)의 양(들) 및/또는 비율을 단일 값으로서(예를 들어, 결과로서 또는 사용된 분석의 "말기"에) 정량화할 수 있거나 핵산의 시간 경과에 따른 변화를 모니터링할 수 있으며, 즉 바람직하게는 특히 대조군과 비교할 때 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산(예를 들어, 절단 및/또는 편집된 생성물) 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 상기 변형의 양의 변화를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 측면에서, 다중 표지 및/또는 마커가 사용된다. 마커는 분석의 일부를 형성하는 핵산 분자 뿐만 아니라 단백질 성분(예를 들어 뉴클레아제 및/또는 융합체) 둘 다에 사용될 수 있다. 표지 및 마커는 분석의 구성요소(특히 핵산 및/또는 단백질)에 포함될 수 있을 뿐만 아니라 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 모이어티를 구성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포, 조직 또는 유기체, 예를 들어 포유동물, 바람직하게는 인간에서 의학적 상태를 검출하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)와 관련된다. 상기 방법은 상기와 같이 본 발명에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 검출된 바와 같은 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)에 기초하여 상기 의학적 상태를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명을 사용하여 검출될 수 있는 의학적 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA 분자와 관련된 것들이다. 상기 설명된 바와 같이, 감지된 RNA는 그 자체가 상태 또는 질병, 예를 들면 감염의 경우, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 코로나바이러스 감염, 시험된 바와 같은 세포, 조직 및/또는 샘플의 박테리아 및/또는 진균 감염의 기원을 구성할 수 있다. 또 다른 상태는 예를 들면 비정상적으로 전사(존재 또는 발견), 발현, 처리(예를 들어 스플라이싱) 및/또는 돌연변이된 RNA의 경우에 적어도 하나의 감지된 RNA 분자와 더 간접적으로 관련될 수 있다. 감지된 RNA 분자는 건강한 대조군(예를 들어 건강하거나 질병에 걸린 샘플의 그룹을 기반으로 하는 대조군)과 비교할 때 증가되거나 감소된 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA는 단일 가닥이거나 초기에 이중 가닥이다. 단일 가닥 감지된 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 면역 세포, 암 세포, 감염된 세포, 또는 병든 세포부터 비롯되고/관련될 수 있고/있거나 바이러스(상기 참조), 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아 또는 병원성 박테리아(상기 참조)로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 감지된 RNA는 전사 및/또는 발현이 예를 들어 대사 요인 또는 신호, 호르몬, 병원체, 독소, 약물, 노화 및/또는 생물적 또는 비생물적 스트레스와 같은 외부 요인에 반응하여 변형되는 유전자로부터 유래되고/관련된다. 결과적으로, 적어도 하나의 감지된 RNA는 바람직하게는 바이러스 감염, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스)로부터 선택된 상태와 관련된다. 통상적으로, 감지된 RNA의 존재 또는 증가되거나 감소된 양은 상기 질병 또는 상태의 존재를 나타낸다. 방법의 또 다른 측면은 상기 개체, 환자 또는 유기체, 특히 세포, 조직 및/또는 샘플이 수득된 개체, 환자 또는 유기체의 치료 동안 상기 감지된 RNA의 양 또는 존재의 모니터링에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 상기 하나 이상의 감지된 RNA가 유전자 서명을 구성하는 RNA의 세트(즉, 유기체, 세포 및/또는 조직에 특이적인 감지된 RNA의 세트)(의 일부)로서 검출되는 단계를 포함한다. 따라서 상기 방법은 하나 이상의 유전자 서명을 검출하며, 여기서 각각의 유전자 서명은 유기체, 세포 및/또는 조직, 예를 들어 식물, 동물 또는 미생물 종, 하나 이상의 식물, 동물 또는 미생물 표현형, 또는 둘 다를 식별한다. 결국, 본 발명의 방법은 유전자 서명을 구성하는 RNA의 세트, 예를 들어, 하나 이상의 감지된 RNA에 대한 발현 프로파일을 식별하는데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 서명은 유기체, 세포 및/또는 조직, 예를 들어 식물, 동물 또는 미생물 종, 하나 이상의 식물, 동물 또는 미생물 표현형, 또는 둘 다에 대해 특이적이다(전사 기록에 대해서는 또한 상기 참조).
본 발명의 방법을 위한 바람직한 시험관내 진단 형식의 예는 마이크로어레이(microarray), 특히 한 번에 많은 DNA를 모니터링하기 위해 이중-가닥 DNA를 사용하는 마이크로어레이, 및 측면 유동 분석이다. 측면 유동 분석은 숙련가에게 알려져 있으며, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)과 동일한 원리로 작동한다. 본질적으로, 이러한 검사는 시각적 양성 또는 음성 결과를 보이는 반응성 분자를 갖는 패드의 표면을 따라 액체 샘플을 실행한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 감지된 RNA는 단계 a) 전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가될 수 있고/있거나 여기서 상기 방법은 DNA의 RNA로의 시험관내 전사, RNA의 DNA로의 역전사, 및 - 최적으로 - 상기 DNA의 RNA로의 후속 시험관내 전사로부터 선택된 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다. 이것은 적절한 또는 원하는 신호 증폭을 제공하기 위해 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 세포, 조직 또는 샘플에서 감지된 RNA는 약 500 fM 내지 약 1 uM, 약 500 fM 내지 약 1 nM의 범위로 존재하고, 바람직하게는 약 1 pM 내지 약 1 nM 범위로 존재한다. 최적으로, 이 방법은 세포, 조직 및/또는 샘플당 단일 분자를 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포, 조직 또는 유기체, 예를 들어 포유동물, 바람직하게는 인간에서 질병 또는 의학적 상태를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)와 관련된다. 상기 방법은 상기 세포, 조직 또는 유기체에 적합한 치료, 특히 특정 의학적 치료를 제공하는 단계, 상기와 같이 본 발명에 따른 방법을 수행하는 단계, 및/또는 검출된 바와 같은 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)에 기초하여 상기 질병 또는 의학적 상태의 상기 치료를 변형시키는 단계를 포함한다. 본 발명을 사용하여 검출될 수 있는 의학적 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA 분자와 관련된 것들이다. 상기 설명된 바와 같이, 감지된 RNA는 그 자체가 상태 또는 질병, 예를 들면 감염의 경우, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 코로나바이러스 감염, 시험된 바와 같은 세포, 조직 및/또는 샘플의 박테리아 및/또는 진균 감염의 기원을 구성할 수 있다. 또 다른 상태는 예를 들면 비정상적으로 전사(존재 또는 발견), 발현, 처리(예를 들어 스플라이싱) 및/또는 돌연변이된 RNA의 경우에 적어도 하나의 감지된 RNA 분자와 더 간접적으로 관련될 수 있다. 감지된 RNA 분자는 건강한 대조군(예를 들어 건강하거나 질병에 걸린 샘플의 그룹을 기반으로 하는 대조군)과 비교할 때 증가되거나 감소된 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA는 단일 가닥이거나 초기에 이중 가닥이다. 단일 가닥 감지된 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 면역 세포, 암 세포, 감염된 세포, 또는 병든 세포부터 비롯되고/관련될 수 있고/있거나 바이러스(상기 참조), 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아 또는 병원성 박테리아(상기 참조)로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 감지된 RNA는 전사 및/또는 발현이 예를 들어 대사 요인 또는 신호, 호르몬, 병원체, 독소, 약물, 노화 및/또는 생물적 또는 비생물적 스트레스와 같은 외부 요인에 반응하여 변형되는 유전자로부터 유래되고/관련된다. 결과적으로, 적어도 하나의 감지된 RNA는 바람직하게는 바이러스 감염, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스)로부터 선택된 상태와 관련된다. 통상적으로, 감지된 RNA의 존재 또는 증가되거나 감소된 양은 상기 질병 또는 상태의 존재를 나타낸다. 방법의 또 다른 측면은 상기 개체, 환자 또는 유기체, 특히 세포, 조직 및/또는 샘플이 수득된 개체, 환자 또는 유기체의 치료 동안 상기 감지된 RNA의 양 또는 존재의 모니터링에 관한 것이다.
의학적 치료의 경우, 재프로그래밍된 tracrRNA는 치료 과정을 직접적으로 알려주는 환자 샘플에서의 관심있는 특정 RNA의 정량적 판독을 제공한다. 예를 들어, 재프로그래밍된 tracrRNA는 예를 들어 코로나바이러스 감염과 같은 환자를 감염시키는 특정 바이러스를 결정하기 위해 채혈 또는 가래에서 바이러스 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 확인된 바이러스는 치료 과정을 직접 알려준다. 예를 들어, 리노바이러스를 확인하면 수액과 휴식을 포함하는 보다 적절한 치료 계획이 초래되는 반면, 코로나바이러스를 확인하면 면밀한 모니터링과 격리가 필요하지만, 에볼라를 확인하면 즉각적인 의료 개입이 필요하다. 유사하게, 재프로그래밍된 tracrRNA는 암 진행 및 약물 감수성의 주요 마커를 확인하기 위해 암 생검에서 특정 RNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 이 정보는 차례로 의사에게 치료 과정을 진행하는 방법을 알려준다. 마지막으로, 재프로그래밍된 tracrRNA는 환자에게 투여할 항생제의 최적 섭생을 결정하기 위해 항생제 내성의 특정 마커를 확인하기 위해 감염 박테리아 또는 진균 병원체(예를 들어 대변 샘플에서 클로스트리디오이데스 디피실(Clostridioides difficile ), 가래 샘플에서 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa))를 포함하는 샘플에 사용될 수 있다.
세포, 조직 또는 유기체, 예를 들어 포유동물, 바람직하게는 인간에서 질병 또는 의학적 상태를 치료하기 위한 상기 기술된 방법의 실시양태, 여기서 상기 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA, 특히 바이러스 RNA 또는 DNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)와 관련되며, 본 발명에 따른 (바이러스 표적 핵산에 특이적인) 재프로그래밍된 tracrRNA는 환자를 감염시키는 예를 들어 코로나바이러스와 같은 특정 바이러스를 결정하기 위해 채혈 또는 가래에서 바이러스 서열을 검출하는데 사용된다. 그후 담당의는 항바이러스 화학요법제 및/또는 생물학적 제제로 검출된 바와 같은 바이러스 감염을 치료한다. 치료 과정에서, 재프로그래밍된 tracrRNA는 치료의 과정 및 효과/성공에 대해 직접 알려주는 환자 샘플에서의 관심있는 특정 RNA의 정량적 판독을 제공한다. 그후 담당의는 이에 따라 치료를 조정할 것이며, 즉, 필요한 경우 항바이러스 화학요법제 및/또는 생물학적 제제를 더 많이 제공할 것이다. 필요한 경우, 이 치료 일정을 반복할 수 있다.
또한, 리노바이러스와 같은 바이러스를 확인하면 수액과 휴식을 포함하는 보다 적절한 치료 계획이 초래되는 반면, 코로나바이러스를 확인하면 면밀한 모니터링과 격리가 필요하지만, 에볼라를 확인하면 즉각적인 의료 개입이 필요하다.
유사하게, 상기한 바와 유사하게, (예를 들어, 암 표적 핵산에 특이적인) 재프로그래밍된 tracrRNA는 암 진행 및 약물 감수성의 주요 마커를 확인하기 위해 암 생검에서 특정 RNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 이 정보는 차례로 의사에게 치료 과정을 진행하는 방법을 알려준다.
마지막으로, 다시 상기한 바와 유사하게, (예를 들어 박테리아 또는 진균 표적 핵산에 특이적인) 재프로그래밍된 tracrRNA는 환자에게 투여할 항생제의 최적 섭생을 결정하기 위해 항생제 내성의 특정 마커를 확인하기 위해 감염 박테리아 또는 진균 병원체(예를 들어 대변 샘플에서 클로스트리디오이데스 디피실 (Clostridioides difficile ), 가래 샘플에서 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa))를 포함하는 샘플에 사용될 수 있다.
이의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 목적은 천연 crRNA:tracrRNA 이중체를 모방하는 복합체를 형성함을 통해 미리 선택된 감지된 RNA 서열에 특이적으로 혼성화하도록 설계된 항-반복 영역 서열을 포함하는 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자를 제공함으로써 해결된다. 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자는 본 발명에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자, 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소, 및 적어도 하나의 감지된 RNA를 포함하는 복합체의 일부일 수 있으며, 적어도 하나의 감지된 RNA 서열을 기반으로 한 또는 기반으로 하여 설계된 서열을 포함하는 표적 DNA 핵산 분자에 추가로 결합될 수 있다.
따라서, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자는 본 발명에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자, 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소, 및 적어도 하나의 감지된 RNA를 포함하는 복합체의 일부일 수 있으며, 적어도 하나의 감지된 RNA 서열을 기반으로 한 또는 기반으로 하여 설계된 서열을 포함하는 표적 DNA 핵산 분자에 추가로 결합될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자는 천연 crRNA:tracrRNA 이중체를 모방하는 복합체를 형성함을 통해 미리 선택된 감지된 RNA 서열에 특이적으로 혼성화하도록 설계된 항-반복 영역 서열을 포함한다. 이는 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 및 미리 선택된 감지된 RNA 서열 분자가 문헌에 개시된 바와 같이 crRNA:tracrRNA 이중체의 컨센서스 구조와 구조적으로 유사한 이중체를 형성함을 의미할 것이다. 예를 들면, crRNA:tracrRNA 이중체는 Cas9의 경우 하부 줄기, 벌지 및 상부 줄기 모듈, Cas12b의 경우 하부 줄기 및 상부 줄기 모듈, Cas12e의 경우 줄기 및 삼중 나선을 형성할 수 있다. crRNA는 스페이서 모듈을 포함하고, tracrRNA는 넥서스 및 말단 헤어핀(terminal hairpin)을 포함한다(예를 들면, 참조; Briner AE, et al. Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-339. doi: 10.1016/j.molcel.2014.09.019. Epub 2014 Oct 16. PMID: 25373540, or Crawley, A.B., Henriksen, E.D., Stout, E. et al. Characterizing the activity of abundant, diverse and active CRISPR-Cas systems in lactobacilli. Sci Rep 8, 11544 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-018-29746-3).
이의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 상기 감지된 RNA의 적어도 한 부분에 결합하도록 설계된 비-자연 발생 tracrRNA(여기서, 상기 감지된 RNA는 표적 핵산의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 추가로 포함한다), 및 b) 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 포함하는, 감지된 RNA에 대한 검출 시스템을 제공함으로써 해결된다. 상기 여러 감지된 RNA에 대한 몇 개의 비-자연 발생 tracrRNA의 세트를 포함하는, 동시에 여러 감지된 RNA의 병렬 검출을 위한 검출 시스템이 바람직하다. 또 다른 검출 시스템은 하나의 감지된 RNA의 여러 위치에서 혼성화하는 여러 비-자연 발생 tracrRNA를 포함한다.
본 발명의 이러한 측면은 검출 시스템으로서, 예를 들면 진단 키트의 일부로서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 구성요소, 예를 들어 상기와 같은 본 발명에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 검출 시스템은 하나 이상의 용기에 제공되며, 적절한 효소, 완충제 및 부형제 뿐만 아니라 사용 설명서를 포함한다. 구성요소는 - 적어도 부분적으로 - 기재 상에 고정될 수 있으며, 여기서 상기 기재는 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 노출될 수 있다. 검출 시스템은 가요성 재료 기재, 예를 들면 칩과 같은 상기 기재 상의 다수의 개별 위치에 적용될 수 있다. 가요성 재료 기재는 종이 기재, 직물 기재, 또는 가요성 중합체-기반 기재일 수 있다.
본 발명의 방법을 위한 바람직한 시험관내 진단 형식의 예는 마이크로어레이, 특히 한 번에 많은 DNA를 모니터링하기 위해 이중-가닥 DNA를 사용하는 마이크로어레이, 및 측면 유동 분석이다. 측면 유동 분석은 숙련가에게 알려져 있으며, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)과 동일한 원리로 작동한다. 본질적으로, 이러한 검사는 시각적 양성 또는 음성 결과를 보이는 반응성 분자를 갖는 패드의 표면을 따라 액체 샘플을 실행한다.
이의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 측면들 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하기 위한, 특히 감지된 RNA, 바이러스 감지된 RNA, 질병 마커로부터 전사된 감지된 RNA를 검출하기 위한, 및/또는 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 감지된 RNA에 대한 발현 프로파일을 생성하기 위한 상기와 같은 측면에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 감지된 RNA 검출 시스템의 용도를 제공함으로써 해결된다.
본원에 기술된 예는 치료 과정을 알아내기 위해 의학적 상태를 진단하거나, 급성 패혈증에서와 같이 건강 결과(health outcome) 또는 질병과 관련된 SNP를 확인하거나, 병원체의 정체, 독성 인자, 내성 마커, SNP, 바이러스 검출, 즉, 정체 및/또는 바이러스 변이체(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 SARS CoV-2 참조), 암 샘플, 예를 들어 생검에서 암 진단을 결정하거나, 돌연변이 및/또는 SNP를 결정하거나, 음용수에서 미생물 오염물질을 확인하거나, 발효 또는 세포 배양물에서 바이러스 또는 미생물 오염물질을 확인하거나, 식물 또는 곤충 변이체를 확인하거나, 마이크로바이옴 및/또는 미생물 감시자(즉, 비침습적 측정의 보고자 역할을 하는 공생 박테리아), 특히 정체, 상대적 존재비, 내성 마커, 대사 유전자, 문/속/종/균주-특이적 유전자 등의 분석 및 생체내에서, 예를 들어 전체 유기체에서 또는 예를 들어 환경에서 채취한 샘플을 기반으로 하여 바이러스 또는 박테리아 확산(예를 들어, 폐수 샘플에서 검출된 바이러스 또는 내성 박테리아의 확산)의 추적과 같은 혼합 군집(예를 들어 장, 토양, 물)에서의 주요 미생물 구성원을 확인하는 것과 같은 광범위한 용도에 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 주어진 값 +/- 10%를 의미할 것이다.
박테리아 병원체 캄필로박터 제주니(C. jejuni)에서 천연 CRISPR-Cas9 시스템의 특성화로부터 시작하여, 본 발명자들은 세포 전사체가 tracrRNA와의 혼성화를 통해 비정규 crRNA로 전환될 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견은 crRNA, tracrRNA 항-반복체와 유사하게 쌍을 이루는 작은 CRISPR-Cas 연관 RNA(scaRNA), 및 tracrRNA의 업스트림 전사를 통해 형성된 "천연" sgRNA를 포함하여 자연에서 발견되는 RNA 가이드의 목록에 ncrRNA를 추가한다. 중요하게도, 이러한 이전 예는 모두 CRISPR-Cas 유전자좌 내에서 암호화된다.
본 발명자들은 비천연 tracrRNA가 관심 RNA의 존재를 Cas9에 의한 서열-특이적 DNA 표적화에 연관시킬 수 있음을 추가로 입증하였다. 그렇지 않으면 관심 RNA는 Cas9 또는 CRISPR-Cas 시스템과 관련이 없다. 그렇게 함으로써, 비천연 tracrRNA는 다중화된 전사 기록 또는 전사-의존적 편집과 같은 Cas9를 사용한 생체 내 적용을 가능하게 한다. 가장 즉각적인 적용은 본원에 개시된 바와 같이 LEOPARD를 통한 시험관내 다중 RNA 검출을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, LEOPARD는 Cas12a 또는 Cas13을 기반으로 하는 기존 CRISPR 진단 플랫폼에 추가하면서 단일 반응으로 확장 가능한 다중화 및 Cas9를 포함하는 최초의 진단 플랫폼을 제공한다.
겔 전기영동에 대한 본 발명자들의 의존은 다중 검출의 원리 증명 입증을 제공하였다. 보다 진전된 구현도 가능하지만, 마이크로어레이 또는 차세대 시퀀싱 칩을 기반으로 하는 기존 기술로도 DNA 서열을 특정 공간 위치와 연결시켜, 동시에 모니터링되는 수백만 개의 표적으로 잠재적으로 확장시킬 수 있다. 접근법 중 어느 것이든 주어진 클러스터에서 제한된 수의 DNA 분자로 인해 분석 감도를 향상시킬 것이며, 예시적인 겔-기반 분석에서 사용되는 40nM 미만에서 감지된 RNA이 잘 검출된다. 별개의 스펙트럼 및 절단 가능한 소광제를 갖는 형광단에 연결된 DNA 표적이 또한 서열-특이적 및 확장 가능한 판독으로 사용될 수 있다.
기존 CRISPR 진단과 유사한 등온(isothermal) 사전-증폭을 포함시키는 것이 또한 감도를 향상시키는 수단을 제공할 것이다. 추가의 발달로, LEOPARD는 바이러스 검출 뿐만 아니라 본원에 또한 논의된 바와 같은 암 돌연변이에 대한 스크리닝, 병원체 및 항생제-내성 마커 식별 또는 약물 감수성에 대한 유전자 발현 프로파일 결정과 같이 다중 판독이 필요한 기타 용도에서도 강력한 진단 도구가 될 것이다.
본원에서, 비천연 tracrRNA는 tracrRNA에도 의존하는 Cas9 및 Cas12 뉴클레아제로 예시적으로 확립되었다(또한 도 9 내지 11, 및 22 내지 25 참조). 이들 및 다른 뉴클레아제로 tracrRNA 재프로그래밍을 확장하는 것은 숙련가에게 알려져 있으며 본원에 기술된 바와 같이 뉴클레아제의 이용 가능한 레퍼토리를 확장하고 신호 증폭 또는 프로그래밍 가능한 전위와 같은 이들의 고유한 속성을 통합한다.
표준 crRNA:tracrRNA 이중체를 체계적으로 교란시키면서, 본 발명자들은 많은 편향 - 특히 반복체의 5' 말단 외부 - 이 Cas9 및 Cas12에 의해 허용되고 여전히 설계된 DNA 표적의 표적화를 유도한다는 것을 발견하였다. 그러나, 이러한 무분별에도 불구하고, 표적화는 여전히 업스트림 가이드 서열 및 측면 PAM에 대한 요건에 의해 결정된다. 따라서, 항-반복 혼성화 및 가이드-의존성 DNA 표적화는 모두 오프-타겟팅의 가능성을 제한한다. 이에 따라, 본 발명자들은 다중 바이러스 RNA를 평가하거나 LEOPARD로 효모 총 RNA를 도입할 때 검출 가능한 오프-타겟팅을 관찰하지 못했다(도 18b, d). 잠재적인 오프-타겟팅 및 온-타겟 활성을 설명하는 비천연 tracrRNA에 대한 설계 규칙은, 기존 sgRNA 설계 알고리즘과 유사하게, CRISPR 기술을 위한 서열-특이적 가이드로의 임의의 RNA의 전환을 진전시키는데 도움이 된다.
본원에 명시된 바와 같이, 본 발명은 특히 하기 항목에 관한 것이다.
항목 1. 천연 crRNA:tracrRNA 이중체를 모방하는 복합체를 형성함을 통해 미리 선택된 감지된 RNA 서열에 특이적으로 혼성화하도록 설계된 항-반복 영역 서열을 포함하는 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자.
항목 2. 항목 1에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자, 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소, 및 적어도 하나의 감지된 RNA를 포함하는 복합체.
항목 3. 적어도 하나의 감지된 RNA 서열을 기반으로 한 또는 기반으로 하여 설계된 서열을 포함하는 표적 DNA 핵산 분자에 추가로 결합되는, 항목 2에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자.
항목 4. 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법으로서, a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산, 특히 DNA, RNA, 또는 ssDNA와 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); b) 상기 적어도 하나의 핵산 DNA에 대한 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 결합을 검출하는 단계를 포함하고; c) 여기서 결합이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법.
항목 5. 상기 뉴클레아제가 이의 절단 및/또는 닉킹 활성이 불활성화되는, 항목 4에 따른 방법.
항목 6. 세포 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법으로서, a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); b) 상기 뉴클레아제 효소에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단을 검출하는 단계를 포함하고; c) 여기서 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 절단을 검출하는 것이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법.
항목 7. 상기 결합된 및/또는 절단된 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 것이 염료, 형광단 또는 전기 전도도와 같은 적합한 표지의 신호의 변화를 검출하고/하거나 상기 절단된 적어도 하나의 표적 핵산 단편 자체를 검출하는 것을 포함하는, 항목 4 내지 6 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 8. 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법으로서, a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계(여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은 dsRNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있다); 및 b) 상기 뉴클레아제에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 닉킹(nicking) 또는 절단하는 단계, c) 예를 들면, 비상동 말단 접합(NHEJ) 수선, 미세상동-매개 말단 접합(MMEJ), 상동-지향 수선(HDR), 염기 편집, 또는 프라임 편집을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하는 단계, 및 d) 예를 들면, 인델(indel) 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이 검출, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제, 및/또는 상기 프라임 또는 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 적절하게 검출하는 단계를 포함하고; e) 여기서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 검출하는 것이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법.
항목 9. 상기 방법이 생체내 또는 시험관내에서 수행되는, 항목 4 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 10. 상기 샘플이 세포를 포함하는 샘플, 및 무세포 시험관내 샘플로부터 선택되고, 여기서 상기 세포가 바람직하게는 식물 세포 또는 동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포인, 항목 4 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 11. 여러 개 또는 다수의 감지된 RNA가 하나 이상의 샘플, 조직 및/또는 세포에서 검출되는, 항목 4 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 12. 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 단일 가닥인, 항목 4 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 13. 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 환경, 종, 균주, 질병, 세포 및/또는 조직 특이적이거나 바이러스 감염, 예를 들어 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스로부터 선택된 상태와 관련되는, 항목 4 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 14. 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 단계 a) 전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가되고/되거나 단계 a) 전에 DNA를 감지된 RNA로 전사하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 4 내지 13 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 15. 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소가 유형 II Cas9 및 유형 V Cas12 뉴클레아제 효소, 예를 들어 II-A, -B 및 -C로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유형 II Cas9 뉴클레아제, 및 유형 V-B, -C, -D, -E, -F, -G, 및 -K로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유형 Cas12 뉴클레아제로부터 선택되는, 항목 4 내지 14 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 16. 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소가 재조합 융합 단백질인, 항목 4 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 17. 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA의 상기 부분이 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 11개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 12개 이상의 뉴클레오티드와 혼성화하는, 항목 4 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 18. 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분이 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하는, 항목 4 내지 17 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 19. 상기 비-자연 발생 tracrRNA가 dsRNA 절단 효소 기질을 제공하는 상기 감지된 RNA와 혼성화하는 적어도 하나의 부분을 추가로 포함하는, 항목 4 내지 18 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 20. 상기 감지된 RNA에서 dsRNA-절단 효소의 상기 기질이 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 11개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 12개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 항목 19에 따른 방법.
항목 21. 혼성화하는 상기 부분이 적어도 80%에 대해 상보적이고, 바람직하게는 90% 이상에 대해 상보적이며, 보다 바람직하게는 95% 이상에 대해 상보적이며, 가장 바람직하게는 100% 상보적인, 항목 4 내지 20 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 22. 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 tracrRNA의 상기 적어도 하나의 부분의 뉴클레오티드 서열이 상기 감지된 RNA에 대한 상기 제1 부분에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상보적이 되도록 하기 위해 생산 및/또는 변형되는, 항목 4 내지 21 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 23. 각각이 상기 감지된 RNA의 상이한 부분과 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 비-자연 발생 tracrRNA가 생성되고 사용되는, 항목 4 내지 22 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 24. 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 mRNA의 양, 바람직하게는 샘플, 조직 및/또는 세포당 양을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 4 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 25. 대조군과 비교할 때 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 mRNA의 양의 변화를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 24에 따른 방법.
항목 26. 검출된 바와 같은 상기 인델의 길이가 1 내지 14개, 보다 바람직하게는 5 내지 9개 뉴클레오티드이고, 여기서 임의로 상기 인델이 시퀀싱 및/또는 qPCR을 통해 검출될 수 있는, 항목 8 내지 25 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 27. 다중 표지 및/또는 마커가 사용되는, 항목 4 내지 26 중 어느 하나에 따른 방법.
항목 28. 항목 4 내지 27 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 검출된 바와 같은 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)에 기반하여 상기 의학적 상태를 검출하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 의학적 상태(여기서 상기 상태는 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)와 관련된다)를 검출하는 방법.
항목 29. 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 환경, 종, 균주, 질병, 세포 및/또는 조직 특이적이거나 바이러스 감염, 예를 들어 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스로부터 선택된 상태와 관련되는, 항목 25에 따른 방법.
항목 27. 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 단계 a) 전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가되고/되거나 단계 a) 전에 DNA를 감지된 RNA로 전사하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 25 또는 26에 따른 방법.
항목 28. a) 상기 감지된 RNA의 적어도 한 부분에 결합하도록 설계된 비-자연 발생 tracrRNA(여기서, 상기 감지된 RNA는 표적 핵산의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 추가로 포함한다), 및 b) 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 포함하는 감지된 RNA 검출 시스템.
항목 29. c) 상기 표적 핵산의 절단을 검출하기 위한 표지를 포함하는 적어도 하나의 표적 핵산 분자를 추가로 포함하는, 항목 28에 따른 감지된 RNA 검출 시스템.
항목 30. d) RNase III 효소와 같은 적어도 하나의 dsRNA 절단 효소를 추가로 포함하는, 항목 28 또는 29에 따른 감지된 RNA 검출 시스템.
항목 31. 상기 성분 a) 내지 d) 중 적어도 하나가 핵산 벡터 시스템 상에 암호화되는, 항목 28 내지 30 중 어느 하나에 따른 감지된 RNA 검출 시스템.
항목 32. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하기 위한, 특히 감지된 RNA, 바이러스 감지된 RNA, 질병 마커로부터 전사된 감지된 RNA를 검출하기 위한, 또는 하나 이상의 감지된 RNA에 대한 발현 프로파일을 생성하기 위한, 항목 28 내지 31 중 어느 하나에 따른 감지된 RNA 검출 시스템의 용도.
본 발명은 이제 첨부된 도면을 참조하여 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 인용된 바와 같은 모든 참조문헌은 전문이 참고로 포함된다. 본 개시내용은 설명의 일부로서 서열 번호 1 내지 128을 포함하는 서열 목록을 포함하며, 이것 또한 전문이 참고로 포함된다.
도면에서, 본 발명에 따른 비-자연 발생 tracrRNA는 때때로 "rptr"로 지칭된다.
도 1은 비정규 crRNA의 발견을 보여준다. A) 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni ) CG8421에서 Cas9와 공동-면역침전하는 RNA의 식별에 대한 묘사. B) tracrRNA의 항-반복 부분에 상보적인 모티프를 공유한 공동-면역침전의 일부로서 풍부화된 47개의 RNA의 세트. 이어지는 RNA는 crRNA와 유사하지만 CRISPR-Cas 시스템 외부에서 암호화된 RNA로부터 유래되었다. C) 비정규 crRNA(ncrRNA)의 생성에 대한 규명된 메커니즘. 이 메커니즘은 모든 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제에 적용되어야 한다. 제시된 tracrRNA는 서열 번호 97이다.
도 2는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA 및 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 통한, 감지된 RNA의 ncrRNA로의 전환의 개략적인 개요를 보여준다. Cas9가 대표적인 뉴클레아제로서 역할을 하지만, 다른 CRISPR 뉴클레아제도 crRNA 생합성 및 기능을 위해 tracrRNA에 의존한다.
도 3은 본 발명의 맥락에서 사용되고 하기 실시예에 기술된 바와 같은 무세포 전사-번역 시스템(TXTL)을 포함하는 시험관내 DNA 절단 분석의 개략적인 개요를 보여준다. 분석의 일부로서, 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드 또는 선형 DNA(예를 들어 CjeCas9), 천연 또는 비천연 tracrRNA, crRNA 또는 감지 RNA, 및 crRNA 또는 ncrRNA에 의해 표적화된 TXTL 발현에 최적화된 GFP 리포터(deGFP)를 반응에 조합한다. RecBCD에 의한 선형 DNA의 분해를 방지하기 위해 GamS를 첨가한다. 그후 GFP 형광을 시간 경과에 따라 측정한다. 형광 감소 또는 손실은 crRNA:tracrRNA:CRISPR 뉴클레아제 복합체가 리포터 DNA 내의 표적에 결합하고 절단하여 GFP 생산을 중단할 때 발생한다.
도 4는 반복체와 항-반복 사이의 이중체가 CjeCas9에 의한 표적화 활성에 거의 영향을 미치지 않으면서 상이한 서열을 수용할 수 있음을 보여준다. A) CjeCas9에 의해 사용하는 sgRNA의 반복체:항-반복 이중체에 대한 상이한 돌연변이. 이차 구조를 유지하면서 이중체의 서열을 변경하기 위해 돌연변이가 이루어졌다. 반복체 및 항-반복체는 sgRNA의 형태로 융합되어 결과적인 표적화 활성에 대한 crRNA 또는 tracrRNA에 의한 미스폴딩의 가능한 영향을 분리하였다. B) TXTL 분석으로부터 결과. 돌연변이는 표적 절단까지의 시간에 제한된 영향을 초래하였다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군. 관련 서열 번호 18-21, sgRNA는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군(서열 번호 16), T: 야생형 표적화 sgRNA(서열 번호 17), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 5는 반복체와 항-반복 사이의 이중체가 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 양쪽에 일부 벌지를 수용할 수 있음을 보여준다. A) 융합된 반복체:항-반복체의 돌연변이된 영역은 검은색 상자로 표시된다. 반복체 및 항-반복체는 sgRNA의 형태로 융합되어 결과적인 표적화 활성에 대한 crRNA 또는 tracrRNA에 의한 미스폴딩의 가능한 영향을 분리하였다. sgRNA의 전사는 노란색으로 표시된 rho-비의존적 종결인자로 종결된다. B) 이중체의 항-반복 부분에 1-nt 또는 2-nt 벌지를 도입한 후의 TXTL 분석으로부터의 결과. C) 이중체의 반복 부분에 1-nt 또는 2-nt 벌지를 도입한 후의 TXTL 분석으로부터의 결과. NT: 비-표적화 sgRNA 대조군. 박스로 표시된 이중체는 벌지의 존재에도 불구하고 표적화 활성을 유지하였다. 관련 서열 번호 23~33, sgRNA는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군(서열 번호 16), T: 야생형 표적화 sgRNA(서열 번호 17), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 6은 반복체와 항-반복 사이의 이중체가 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 미스매치를 수용할 수 있음을 보여준다. A) 융합된 반복체:항-반복 이중체의 돌연변이 영역은 검은색 상자로 표시된다. 반복체 및 항-반복체는 sgRNA의 형태로 융합되어 결과적인 표적화 활성에 대한 crRNA 또는 tracrRNA에 의한 미스폴딩의 가능한 영향을 분리하였다. sgRNA의 전사는 노란색으로 표시된 rho-비의존적 종결인자로 종결된다. B) 이중체에 1-nt 또는 2-nt 미스매치 또는 G:U 워블 쌍을 도입한 후의 TXTL 분석으로부터의 결과. NT: 비-표적화 sgRNA 대조군. 박스로 표시된 이중체는 벌지의 존재에도 불구하고 표적화 활성을 유지하였다. 관련 서열 번호 34~42, sgRNA는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군(서열 번호 16), T: 야생형 표적화 sgRNA(서열 번호 17), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 7은 RNase III 처리에 관여하는 반복체:항-반복 이중체의 영역이 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 미스매치 및 벌지를 수용할 수 있음을 보여준다. A) 반복체:항-반복 이중체 내의 돌연변이 영역은 회색 상자로 표시된다. 변형된 crRNA 및 tracrRNA는 별도로 발현되었다. B) 불일치에 대한 TXTL 결과. C) 벌지에 대한 TXTL 결과. NT: 비-표적화 sgRNA 대조군. 관련 서열 번호 48~54. tracrRNA(서열 번호 45)는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. CrRNA 변이체는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 crRNA 대조군(서열 번호 46), T: 3' 300개 돌출부를 갖는 야생형 표적화 crRNA(서열 번호 47), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 8은 crRNA의 5' 말단 또는 3' 말단으로의 확장이 CjeCas9에 의한 표적화 활성에 제한된 영향을 갖는다는 것을 보여준다. A) 5' 확장에 대한 TXTL 결과. B) 3' 확장에 대한 TXTL 결과. 관련 서열 번호 56~60. tracrRNA(서열 번호 45)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. CrRNA 변이체는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. NT: 비표적화 crRNA 대조군(서열 번호 46), WT: fliF-표적화 crRNA(서열 번호 55), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 9는 비천연 tracrRNA가 감지된 RNA로부터 CjeCas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 설계될 수 있음을 보여준다. A) CjeCas9에 대한 비천연 tracrRNA 및 수반되는 DNA 표적에 대한 일반적인 설계 접근방식. 왼쪽: 천연 tracrRNA에 혼성화된 crRNA의 서열 및 2차 구조. crRNA의 가이드 서열은 N'로 표시된다. 오른쪽: 감지된 RNA와 쌍을 이루는 비천연 tracrRNA의 서열 및 2차 구조. 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분은 감지된 RNA의 한 부분과 혼성화하는 반면 감지된 RNA의 상류 부분은 생성된 ncrRNA의 가이드 서열이 된다. DNA 표적은 이러한 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 암호화하도록 설계된다. B) 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증하는 TXTL 결과. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계된다. 시험된 RNA는 캄필로박터 제주니(C. jejuni ) 균주 84-21을 사용하여 본 발명자들에 의해 수행된 CjeCas9 공동-면역침전 실험으로부터의 피크 113과 관련된 mRNA이다. 이 mRNA는 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980로부터 유래된다. T: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 존재. NT: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 부재. 전반적으로, 시험된 비천연 tracrRNA는 일반적으로 강한 절단 활성을 야기하였다. 관련 서열 번호 62~71. Peak113-보유 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 10은 비천연 tracrRNA가 감지된 RNA로부터 SpyCas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 설계될 수 있음을 보여준다. A) SpyCas9에 대한 비천연 tracrRNA 및 수반되는 DNA 표적에 대한 일반적인 설계 접근방식. 왼쪽: 천연 tracrRNA에 혼성화된 crRNA의 서열 및 2차 구조. crRNA의 가이드 서열은 N'로 표시된다. 오른쪽: 감지된 RNA와 쌍을 이루는 비천연 tracrRNA의 서열 및 2차 구조. 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분은 감지된 RNA의 한 부분과 혼성화하는 반면 상류 부분은 생성된 ncrRNA의 가이드 서열이 된다. DNA 표적은 이러한 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 암호화하도록 설계된다. B) 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증하는 TXTL 결과. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계된다. 시험된 RNA는 공동-면역침전 실험으로부터의 피크 113과 관련된 mRNA이다. 이 mRNA는 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980로부터 유래된다. T: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 존재. NT: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 부재. 전반적으로, 시험된 모든 5개 비천연 tracrRNA는 강한 절단 활성을 야기하였다. 관련 서열 번호 72~81. Peak113-보유 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 11은 감지된 RNA로부터 Sth1Cas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 비천연 tracrRNA가 설계될 수 있음을 보여준다. A) Sth1Cas9에 대한 비천연 tracrRNA 및 수반되는 DNA 표적에 대한 일반적인 설계 접근방식. 왼쪽: 천연 tracrRNA에 혼성화된 crRNA의 서열 및 2차 구조. crRNA의 가이드 서열은 N'로 표시된다. 오른쪽: 감지된 RNA와 쌍을 이루는 비천연 tracrRNA의 서열 및 2차 구조. 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분은 감지된 RNA의 한 부분과 혼성화하는 반면 상류 부분은 생성된 ncrRNA의 가이드 서열이 된다. DNA 표적은 이러한 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 암호화하도록 설계된다. B) 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증하는 TXTL 결과. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계된다. 시험된 RNA는 공동-면역침전 실험으로부터의 피크 113과 관련된 mRNA이다. 이 mRNA는 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980로부터 유래된다. T: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 존재. NT: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 부재. 전반적으로, 시험된 모든 5개 비천연 tracrRNA는 강한 절단 활성을 야기하였다. 관련 서열 번호 82~91. Peak113-보유 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 12는 샘플에서 감지된 RNA의 존재를 보고하는 시험관내 진단 "리포터" 기능의 예를 보여준다. 제공된 2개의 예에서, 감지된 RNA는 비천연 tracrRNA를 통해 ncrRNA로 전환되고 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제와 복합체화된다. ncrRNA에 의해 지정된 DNA 표적의 인식은 검출 가능한 신호를 생성한다. A) DNA 인식 및 후속 절단은 형광 신호를 산출한다. 표적 핵산은 한쪽 말단은 형광단(F) 및 다른 쪽 말단은 소광제(Q)에 공유적으로 연결된다. 두 분자는 소광제가 형광단을 차폐하기에 충분할 정도로 가깝다. 그러나, 표적 절단은 두 DNA 조각이 분리되도록 하여 형광 신호를 생성한다. B) DNA 인식 및 후속 닉킹은 형광 신호를 산출한다. 표적 핵산은 표적 및 비표적 가닥의 동일한 말단에서 각각 형광단 및 소광제에 공유적으로 연결된다. 비표적 가닥만 닉킹하도록 돌연변이된 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제(예를 들어 Cas9n)에 의한 표적화는 소광제에 연결된 비표적 가닥의 방출을 초래한다. 일단 가닥이 분산되면, 형광 신호가 생성된다. C) DNA 결합은 형광 신호를 국소화한다. 촉매적으로-사멸된 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제(예를 들어 dCas9)는 기능적으로 형광 신호에 연결된다.
도 13은 감지된 RNA가 판독 가능한 신호로 변환되는 생체내 전사 기록의 예를 보여준다. 각각의 예에서, 감지된 RNA는 비천연 tracrRNA를 통해 ncrRNA로 전환되고, ncrRNA는 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제를 표적 "리포터" DNA로 지시한다. A) "리포터" DNA는 편집을 거쳐, DNA에 저장되는 검출 가능한 편집을 생성한다. 인델이 표시되어 있지만, (예를 들어 HDR, 염기 편집, 프라임 편집 또는 RNA 편집을 통해) 다른 많은 유형의 편집이 가능하다. B) 리포터 유전자의 발현이 조절된다. dCas9와 전사 활성화 도메인 VP16 사이의 융합이 나타내어져 있지만, 다른 많은 모드의 발현 조절이 가능하다(예를 들어 조절 도메인을 모집하는 스캐폴드 sgRNA를 사용하여, 부분적으로 돌연변이된 가이드 서열과 쌍을 이루는 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제 또는 촉매적으로-활성인 뉴클레아제를 사용하여, 다른 조절 도메인을 뉴클레아제에 융합).
도 14는 비천연 tracrRNA를 사용하여 전사-의존적 표적화를 유도할 수 있는 방법을 보여준다. 비천연 tracrRNA는 PAM을 암호화하는 감지된 RNA 내의 영역에 혼성화하도록 설계된다. 이어지는 ncrRNA는 감지된 RNA를 암호화하는 유전자좌의 표적화를 유도한다. 그 결과, 표적화는 유전자좌가 전사될 때만 발생한다. 표적화가 더 작은 인델(예를 들어 1-nt 결실)을 야기하는 경우, 전사된 감지된 RNA는 돌연변이를 암호화하고 여전히 표적화를 유도한다. 실질적인 효과는 더 큰 인델 또는 대체 수선 경로(예를 들어 HDR)에 대한 더 많은 기회이다.
도 15는 전사-의존적 표적화가 PAM을 보유하는 감지된 RNA에 혼성화하는 비천연 tracrRNA로 달성될 수 있음을 보여준다. A) 전사-의존적 표적화를 검출하기 위한 TXTL 설정. 설정의 일부로서, 감지된 RNA는 상이한 프로모터하에서 GFP 리포터(서열 번호 96)를 또한 암호화하는 플라스미드로부터 발현된다. 플라스미드 DNA의 절단은 TXTL 혼합물에 존재하는 RecBCD에 의한 급속한 분해를 통해 GFP 발현의 손실을 초래한다. 감지된 RNA 및 PAM이 결여된 상보적인 비천연 tracrRNA는 음성 대조군으로서 역할을 한다. B) CjeCas9에 의해 사용되는 비천연 tracrRNA가 혼성화하도록 설계된 피크 113 mRNA 내의 위치. mRNA 및 비천연 tracrRNA는 모두 CjeCas9에 의해 인식되는 PAM을 암호화하도록 돌연변이되었다. C) 감지된 RNA가 CjeCas9에 의한 자체 DNA 서열의 절단을 유도하는 것과 일치하게, PAM의 존재하에서의 감소된 형광 수준을 보여주는 TXTL 결과. Peak113-보유 mRNA 및 PAM을 갖는 이의 변이체(서열 번호 61, 93, 95)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNAs 및 PAM을 갖는 이들의 변이체(서열 번호 64, 92, 68, 94)는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 16은 RNA 검출이 비천연 tracrRNA로 생체내에서 달성될 수 있음을 보여준다. A) 감지된 RNA의 존재를 해당 표적 서열을 암호화하는 플라스미드의 절단에 연결하기 위한 대장균에서의 실험 설정. 분석은 감지된 RNA의 일부(피크 113으로부터 유래)를 활성 ncrRNA로 전환하도록 설계된 비천연 tracrRNA 및 CjeCas9를 사용하여 수행하였다. B) 플라스미드 제거(plasmid clearance) 결과. 감지된 RNA, 재프로그래밍된 tracrRNA 및 CjeCas9를 발현하는 플라스미드를 보유하는 대장균 세포를 표적을 갖거나(표적화) 갖지 않는(비표적화) 플라스미드로 형질전환한 다음 모든 플라스미드를 보유하는 콜로니를 선택하기 위해 플레이팅하였다. 감지된 RNA 및 표적 서열의 존재는 비-표적화 대조군에 비해 형질전환된 콜로니의 수를 크게 감소시켰다. 감지된 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA(서열 번호 66)는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. 표적 DNA(서열 번호 67).
도 17은 재프로그래밍된 tracrRNA가 상이한 Cas9 이종상동체를 안내하기 위해 RNA 전사체를 끌어들임을 보여준다. A) CjeCas9에 의해 사용되는 재프로그래밍된 tracrRNA(비천연 tracrRNA)의 설계. RpT-RNA는 관심 RNA를 ncrRNA로 전환하여 Cas9를 PAM-측면 DNA 표적으로 지시한다. W = A 또는 T. PAM: 노란색 원. B) TXTL에서 2차 구조를 보존하는 sgRNA의 RNA 이중체에 대한 돌연변이의 관용. 이중체는 tracrRNA와 쌍을 이루는 세포 RNA의 처음 12개 nt를 반영한다. C) TXTL에서 tracrRNA를 비천연 tracrRNA로 전환함으로써 덜 기능적이거나 비기능적인 ncrRNA에 의한 DNA 표적화를 향상시킨다. D) 3개의 상이한 Cas9 뉴클레아제와 상용성인 비천연 tracrRNA를 사용한 TXTL에서의 서열-특이적 DNA 표적화. B - D의 값은 TXTL에서 4개 복제물로부터의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. *: p < 0.01. **: p < 0.001, n.s.: 유의하지 않음. 표시된 바와 같은 서열은 GUUUUAGUCCCU (서열 번호 98), AGGGACUAAAAU (서열 번호 99), GCGCCGAGUUAG (서열 번호 100), 및 CUAACUCGGCGC (서열 번호 101)이다.
도 18은 재프로그래밍된 tracrRNA가 시험관내에서 단일-염기 분해능으로 다중화 가능한 RNA 검출을 가능하게 한다는 것을 보여준다. A) 다중 진단 플랫폼 LEOPARD의 개요. B) 시험관내 Cas9에 의한 표적 DNA의 고도로 특이적인 ncrRNA-매개된 절단. C) DNA 표적의 다중 모니터링. Cy5 형광 염료는 각 DNA 표적의 한쪽 말단에 추가되고, 각 표적 측면에 있는 서열의 길이는 모든 생성물이 겔에서 분해될 때 크기에 따라 시각화될 수 있도록 다양하다. D) PAGE를 변성시킴으로써 호흡기 바이러스와 관련된 9개의 상이한 RNA 단편의 병렬 검출. D와 E의 채워진 점은 오른쪽에 열거된 구성요소의 존재를 나타낸다. (E) SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 내 D614G 점 돌연변이(point mutation)의 특이적 검출. B, D 및 E에서의 각각의 검출된 T7-전사된 RNA는 양쪽 말단에 50-nt 확장을 갖는 의도된 ncrRNA 서열을 포함하였다.
도 19는 본 발명에 따른 전사 기록 방법을 보여준다. 이러한 실시양태에서, Sth1nCas9 염기 편집기는 전사 이벤트를 기록할 수 있다. 감지된 RNA로 비천연 tracrRNA를 발현시키면 대장균의 플라스미드에서 표적 DNA의 염기 편집이 야기된다. 편집은 설계된 crRNA:tracrRNA만큼 효율적이었다. A) 시험된 작제물. 확인 표시는 표준 이상의 작제물의 사용을 나타낸다. NT: 비-표적; mRNA(mut): 가이드의 추정 "시드" 영역에 점 돌연변이가 있는 ncrRNA를 암호화하는 mRNA; tracrRNA(scr): 항-반복 서열이 스크램블된 tracrRNA. 표적 플라스미드의 파란색 직사각형, 표적 서열; 노란색 원, Cas9 PAM. B) 시험된 작제물에 기반한 대장균에서의 편집 효율. 표시된 바와 같은 서열은 taagttcaatgtttttacattgagaaa (서열 번호 102)이다.
도 20은 편집 영역에서 C가 결여된 RNA가 기록된, 본 발명에 따른 전사 기록 방법을 보여준다. 이를 위해, 표적은 원래 C를 포함하지 않았지만, 편집을 평가하기 위해 다른 위치에 하나를 삽입하였다. 이 경우, 가이드와 표적 사이에 미스매치를 생성할 수 있기는 하지만 C가 상이한 위치에 삽입되었을 때 편집이 관찰되었다. 편집은 도 19와 유사하게 평가되었다. 표시된 바와 같은 서열은 agaauuuaugugaauuuuauug (서열 번호 103), 및 agaatttatgtgaattttattgtgagaaa (서열 번호 104)이다.
도 21은 비천연 tracrRNA 및 높은 GC-함량 mRNA를 사용한 효율적인 전사 기록을 보여준다. deGFP mRNA 내에서 GC 함량이 더 높은 영역에 혼성화하도록 비천연 tracrRNA를 설계한 다음, 플라스미드의 표적 서열을 사용하여 염기 편집을 평가하였다. 이러한 결과는 감지된 mRNA의 비천연 tracrRNA-혼성화 영역 내의 낮은-GC 함량이 전사 기록을 위한 요건이 아님을 보여준다. 편집은 도 19와 유사하게 평가되었다. tracrRNA(scr): 항-반복 서열이 스크램블된 tracrRNA. 표시된 바와 같은 서열은 cgtccaggagcgcaccatcttgagaaa (서열 번호 105), ctaccagcagaacacccccatgagaaa (서열 번호 106), ucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccg (서열 번호 107), 및 ucggcgacggccccgugcugcugcccgacaaccacu (서열 번호 108)이다.
도 22는 대장균에서 내인성 유전자의 전사 기록을 보여준다. 여기서, 배지에 D-크실로스가 첨가되었을 때 유도되는 xylA의 발현을 감지하도록 비천연 tracrRNA를 설계하였다. 이 경우에, Sth1nCas9 염기 편집기를 사용한 전사 기록은 D-크실로스가 첨가되었을 때 증가하였다. 이러한 실험은 도 19와 유사하게 수행되었다. 표시된 바와 같은 서열은 ttatcgaaccgaaaccgcaatgagaaa (서열 번호 109), 및 ggcggtcgtgaaggttacgatgagaaa (서열 번호 110)이다.
도 23은 표적화 활성을 여전히 유지하면서 CasX/Cas12e에 대한 crRNA:tracrRNA 이중체가 변형(재프로그래밍)될 수 있음을 보여준다. 이를 위해, 체계적인 돌연변이 분석을 수행하였다. sgRNA로서 암호화된 비-자연 발생 tracrRNA가 여전히 CasX/12e에 대한 서열-특이적 DNA 절단을 유도하는 것으로 확인되었다. 표시된 바와 같은 서열은 서열 번호 111 내지 서열 번호 119)이다.
도 24는 표적화 활성을 여전히 유지하면서 crRNA:tracrRNA 이중체가 변형(재프로그래밍)될 수 있음을 보여준다. 이를 위해, BhCas12b tracrRNA/crRNA의 체계적인 돌연변이 분석을 수행하였다. 비-자연 발생 tracrRNA가 여전히 BhCas12b에 대한 서열-특이적 DNA 절단을 유도하는 것으로 확인되었다. 표시된 바와 같은 서열은 서열 번호 120 내지 서열 번호 128)이다.
도 25는 감지된 RNA가 존재할 때 DNA 절단을 지시하는 재프로그래밍된/변형된 비-자연 발생 tracrRNA의 입증을 보여준다. 비-자연 발생 tracrRNA는 여전히 Cas12b 및 Cas12e에 대한 서열-특이적 DNA 절단을 유도한다.
도면에서, 본 발명에 따른 비-자연 발생 tracrRNA는 때때로 "rptr"로 지칭된다.
도 1은 비정규 crRNA의 발견을 보여준다. A) 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni ) CG8421에서 Cas9와 공동-면역침전하는 RNA의 식별에 대한 묘사. B) tracrRNA의 항-반복 부분에 상보적인 모티프를 공유한 공동-면역침전의 일부로서 풍부화된 47개의 RNA의 세트. 이어지는 RNA는 crRNA와 유사하지만 CRISPR-Cas 시스템 외부에서 암호화된 RNA로부터 유래되었다. C) 비정규 crRNA(ncrRNA)의 생성에 대한 규명된 메커니즘. 이 메커니즘은 모든 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제에 적용되어야 한다. 제시된 tracrRNA는 서열 번호 97이다.
도 2는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA 및 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 통한, 감지된 RNA의 ncrRNA로의 전환의 개략적인 개요를 보여준다. Cas9가 대표적인 뉴클레아제로서 역할을 하지만, 다른 CRISPR 뉴클레아제도 crRNA 생합성 및 기능을 위해 tracrRNA에 의존한다.
도 3은 본 발명의 맥락에서 사용되고 하기 실시예에 기술된 바와 같은 무세포 전사-번역 시스템(TXTL)을 포함하는 시험관내 DNA 절단 분석의 개략적인 개요를 보여준다. 분석의 일부로서, 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드 또는 선형 DNA(예를 들어 CjeCas9), 천연 또는 비천연 tracrRNA, crRNA 또는 감지 RNA, 및 crRNA 또는 ncrRNA에 의해 표적화된 TXTL 발현에 최적화된 GFP 리포터(deGFP)를 반응에 조합한다. RecBCD에 의한 선형 DNA의 분해를 방지하기 위해 GamS를 첨가한다. 그후 GFP 형광을 시간 경과에 따라 측정한다. 형광 감소 또는 손실은 crRNA:tracrRNA:CRISPR 뉴클레아제 복합체가 리포터 DNA 내의 표적에 결합하고 절단하여 GFP 생산을 중단할 때 발생한다.
도 4는 반복체와 항-반복 사이의 이중체가 CjeCas9에 의한 표적화 활성에 거의 영향을 미치지 않으면서 상이한 서열을 수용할 수 있음을 보여준다. A) CjeCas9에 의해 사용하는 sgRNA의 반복체:항-반복 이중체에 대한 상이한 돌연변이. 이차 구조를 유지하면서 이중체의 서열을 변경하기 위해 돌연변이가 이루어졌다. 반복체 및 항-반복체는 sgRNA의 형태로 융합되어 결과적인 표적화 활성에 대한 crRNA 또는 tracrRNA에 의한 미스폴딩의 가능한 영향을 분리하였다. B) TXTL 분석으로부터 결과. 돌연변이는 표적 절단까지의 시간에 제한된 영향을 초래하였다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군. 관련 서열 번호 18-21, sgRNA는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군(서열 번호 16), T: 야생형 표적화 sgRNA(서열 번호 17), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 5는 반복체와 항-반복 사이의 이중체가 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 양쪽에 일부 벌지를 수용할 수 있음을 보여준다. A) 융합된 반복체:항-반복체의 돌연변이된 영역은 검은색 상자로 표시된다. 반복체 및 항-반복체는 sgRNA의 형태로 융합되어 결과적인 표적화 활성에 대한 crRNA 또는 tracrRNA에 의한 미스폴딩의 가능한 영향을 분리하였다. sgRNA의 전사는 노란색으로 표시된 rho-비의존적 종결인자로 종결된다. B) 이중체의 항-반복 부분에 1-nt 또는 2-nt 벌지를 도입한 후의 TXTL 분석으로부터의 결과. C) 이중체의 반복 부분에 1-nt 또는 2-nt 벌지를 도입한 후의 TXTL 분석으로부터의 결과. NT: 비-표적화 sgRNA 대조군. 박스로 표시된 이중체는 벌지의 존재에도 불구하고 표적화 활성을 유지하였다. 관련 서열 번호 23~33, sgRNA는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군(서열 번호 16), T: 야생형 표적화 sgRNA(서열 번호 17), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 6은 반복체와 항-반복 사이의 이중체가 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 미스매치를 수용할 수 있음을 보여준다. A) 융합된 반복체:항-반복 이중체의 돌연변이 영역은 검은색 상자로 표시된다. 반복체 및 항-반복체는 sgRNA의 형태로 융합되어 결과적인 표적화 활성에 대한 crRNA 또는 tracrRNA에 의한 미스폴딩의 가능한 영향을 분리하였다. sgRNA의 전사는 노란색으로 표시된 rho-비의존적 종결인자로 종결된다. B) 이중체에 1-nt 또는 2-nt 미스매치 또는 G:U 워블 쌍을 도입한 후의 TXTL 분석으로부터의 결과. NT: 비-표적화 sgRNA 대조군. 박스로 표시된 이중체는 벌지의 존재에도 불구하고 표적화 활성을 유지하였다. 관련 서열 번호 34~42, sgRNA는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 sgRNA 대조군(서열 번호 16), T: 야생형 표적화 sgRNA(서열 번호 17), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 7은 RNase III 처리에 관여하는 반복체:항-반복 이중체의 영역이 CjeCas9에 의한 DNA 표적화의 일부로서 미스매치 및 벌지를 수용할 수 있음을 보여준다. A) 반복체:항-반복 이중체 내의 돌연변이 영역은 회색 상자로 표시된다. 변형된 crRNA 및 tracrRNA는 별도로 발현되었다. B) 불일치에 대한 TXTL 결과. C) 벌지에 대한 TXTL 결과. NT: 비-표적화 sgRNA 대조군. 관련 서열 번호 48~54. tracrRNA(서열 번호 45)는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. CrRNA 변이체는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. NT: 비표적화 crRNA 대조군(서열 번호 46), T: 3' 300개 돌출부를 갖는 야생형 표적화 crRNA(서열 번호 47), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 8은 crRNA의 5' 말단 또는 3' 말단으로의 확장이 CjeCas9에 의한 표적화 활성에 제한된 영향을 갖는다는 것을 보여준다. A) 5' 확장에 대한 TXTL 결과. B) 3' 확장에 대한 TXTL 결과. 관련 서열 번호 56~60. tracrRNA(서열 번호 45)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. CrRNA 변이체는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. NT: 비표적화 crRNA 대조군(서열 번호 46), WT: fliF-표적화 crRNA(서열 번호 55), 표적 DNA(서열 번호 15).
도 9는 비천연 tracrRNA가 감지된 RNA로부터 CjeCas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 설계될 수 있음을 보여준다. A) CjeCas9에 대한 비천연 tracrRNA 및 수반되는 DNA 표적에 대한 일반적인 설계 접근방식. 왼쪽: 천연 tracrRNA에 혼성화된 crRNA의 서열 및 2차 구조. crRNA의 가이드 서열은 N'로 표시된다. 오른쪽: 감지된 RNA와 쌍을 이루는 비천연 tracrRNA의 서열 및 2차 구조. 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분은 감지된 RNA의 한 부분과 혼성화하는 반면 감지된 RNA의 상류 부분은 생성된 ncrRNA의 가이드 서열이 된다. DNA 표적은 이러한 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 암호화하도록 설계된다. B) 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증하는 TXTL 결과. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계된다. 시험된 RNA는 캄필로박터 제주니(C. jejuni ) 균주 84-21을 사용하여 본 발명자들에 의해 수행된 CjeCas9 공동-면역침전 실험으로부터의 피크 113과 관련된 mRNA이다. 이 mRNA는 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980로부터 유래된다. T: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 존재. NT: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 부재. 전반적으로, 시험된 비천연 tracrRNA는 일반적으로 강한 절단 활성을 야기하였다. 관련 서열 번호 62~71. Peak113-보유 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 10은 비천연 tracrRNA가 감지된 RNA로부터 SpyCas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 설계될 수 있음을 보여준다. A) SpyCas9에 대한 비천연 tracrRNA 및 수반되는 DNA 표적에 대한 일반적인 설계 접근방식. 왼쪽: 천연 tracrRNA에 혼성화된 crRNA의 서열 및 2차 구조. crRNA의 가이드 서열은 N'로 표시된다. 오른쪽: 감지된 RNA와 쌍을 이루는 비천연 tracrRNA의 서열 및 2차 구조. 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분은 감지된 RNA의 한 부분과 혼성화하는 반면 상류 부분은 생성된 ncrRNA의 가이드 서열이 된다. DNA 표적은 이러한 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 암호화하도록 설계된다. B) 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증하는 TXTL 결과. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계된다. 시험된 RNA는 공동-면역침전 실험으로부터의 피크 113과 관련된 mRNA이다. 이 mRNA는 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980로부터 유래된다. T: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 존재. NT: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 부재. 전반적으로, 시험된 모든 5개 비천연 tracrRNA는 강한 절단 활성을 야기하였다. 관련 서열 번호 72~81. Peak113-보유 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 11은 감지된 RNA로부터 Sth1Cas9에 의해 사용되는 활성 ncrRNA의 형성을 지시하도록 비천연 tracrRNA가 설계될 수 있음을 보여준다. A) Sth1Cas9에 대한 비천연 tracrRNA 및 수반되는 DNA 표적에 대한 일반적인 설계 접근방식. 왼쪽: 천연 tracrRNA에 혼성화된 crRNA의 서열 및 2차 구조. crRNA의 가이드 서열은 N'로 표시된다. 오른쪽: 감지된 RNA와 쌍을 이루는 비천연 tracrRNA의 서열 및 2차 구조. 비천연 tracrRNA의 항-반복 부분은 감지된 RNA의 한 부분과 혼성화하는 반면 상류 부분은 생성된 ncrRNA의 가이드 서열이 된다. DNA 표적은 이러한 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 암호화하도록 설계된다. B) 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA에 의해 지시된 DNA 표적화를 입증하는 TXTL 결과. 각각의 비천연 tracrRNA는 시험된 RNA의 특정 영역에 혼성화하도록 설계된다. 시험된 RNA는 공동-면역침전 실험으로부터의 피크 113과 관련된 mRNA이다. 이 mRNA는 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980로부터 유래된다. T: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 존재. NT: GFP 리포터 작제물에서의 표적 서열의 부재. 전반적으로, 시험된 모든 5개 비천연 tracrRNA는 강한 절단 활성을 야기하였다. 관련 서열 번호 82~91. Peak113-보유 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 12는 샘플에서 감지된 RNA의 존재를 보고하는 시험관내 진단 "리포터" 기능의 예를 보여준다. 제공된 2개의 예에서, 감지된 RNA는 비천연 tracrRNA를 통해 ncrRNA로 전환되고 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제와 복합체화된다. ncrRNA에 의해 지정된 DNA 표적의 인식은 검출 가능한 신호를 생성한다. A) DNA 인식 및 후속 절단은 형광 신호를 산출한다. 표적 핵산은 한쪽 말단은 형광단(F) 및 다른 쪽 말단은 소광제(Q)에 공유적으로 연결된다. 두 분자는 소광제가 형광단을 차폐하기에 충분할 정도로 가깝다. 그러나, 표적 절단은 두 DNA 조각이 분리되도록 하여 형광 신호를 생성한다. B) DNA 인식 및 후속 닉킹은 형광 신호를 산출한다. 표적 핵산은 표적 및 비표적 가닥의 동일한 말단에서 각각 형광단 및 소광제에 공유적으로 연결된다. 비표적 가닥만 닉킹하도록 돌연변이된 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제(예를 들어 Cas9n)에 의한 표적화는 소광제에 연결된 비표적 가닥의 방출을 초래한다. 일단 가닥이 분산되면, 형광 신호가 생성된다. C) DNA 결합은 형광 신호를 국소화한다. 촉매적으로-사멸된 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제(예를 들어 dCas9)는 기능적으로 형광 신호에 연결된다.
도 13은 감지된 RNA가 판독 가능한 신호로 변환되는 생체내 전사 기록의 예를 보여준다. 각각의 예에서, 감지된 RNA는 비천연 tracrRNA를 통해 ncrRNA로 전환되고, ncrRNA는 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제를 표적 "리포터" DNA로 지시한다. A) "리포터" DNA는 편집을 거쳐, DNA에 저장되는 검출 가능한 편집을 생성한다. 인델이 표시되어 있지만, (예를 들어 HDR, 염기 편집, 프라임 편집 또는 RNA 편집을 통해) 다른 많은 유형의 편집이 가능하다. B) 리포터 유전자의 발현이 조절된다. dCas9와 전사 활성화 도메인 VP16 사이의 융합이 나타내어져 있지만, 다른 많은 모드의 발현 조절이 가능하다(예를 들어 조절 도메인을 모집하는 스캐폴드 sgRNA를 사용하여, 부분적으로 돌연변이된 가이드 서열과 쌍을 이루는 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제 또는 촉매적으로-활성인 뉴클레아제를 사용하여, 다른 조절 도메인을 뉴클레아제에 융합).
도 14는 비천연 tracrRNA를 사용하여 전사-의존적 표적화를 유도할 수 있는 방법을 보여준다. 비천연 tracrRNA는 PAM을 암호화하는 감지된 RNA 내의 영역에 혼성화하도록 설계된다. 이어지는 ncrRNA는 감지된 RNA를 암호화하는 유전자좌의 표적화를 유도한다. 그 결과, 표적화는 유전자좌가 전사될 때만 발생한다. 표적화가 더 작은 인델(예를 들어 1-nt 결실)을 야기하는 경우, 전사된 감지된 RNA는 돌연변이를 암호화하고 여전히 표적화를 유도한다. 실질적인 효과는 더 큰 인델 또는 대체 수선 경로(예를 들어 HDR)에 대한 더 많은 기회이다.
도 15는 전사-의존적 표적화가 PAM을 보유하는 감지된 RNA에 혼성화하는 비천연 tracrRNA로 달성될 수 있음을 보여준다. A) 전사-의존적 표적화를 검출하기 위한 TXTL 설정. 설정의 일부로서, 감지된 RNA는 상이한 프로모터하에서 GFP 리포터(서열 번호 96)를 또한 암호화하는 플라스미드로부터 발현된다. 플라스미드 DNA의 절단은 TXTL 혼합물에 존재하는 RecBCD에 의한 급속한 분해를 통해 GFP 발현의 손실을 초래한다. 감지된 RNA 및 PAM이 결여된 상보적인 비천연 tracrRNA는 음성 대조군으로서 역할을 한다. B) CjeCas9에 의해 사용되는 비천연 tracrRNA가 혼성화하도록 설계된 피크 113 mRNA 내의 위치. mRNA 및 비천연 tracrRNA는 모두 CjeCas9에 의해 인식되는 PAM을 암호화하도록 돌연변이되었다. C) 감지된 RNA가 CjeCas9에 의한 자체 DNA 서열의 절단을 유도하는 것과 일치하게, PAM의 존재하에서의 감소된 형광 수준을 보여주는 TXTL 결과. Peak113-보유 mRNA 및 PAM을 갖는 이의 변이체(서열 번호 61, 93, 95)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNAs 및 PAM을 갖는 이들의 변이체(서열 번호 64, 92, 68, 94)는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다.
도 16은 RNA 검출이 비천연 tracrRNA로 생체내에서 달성될 수 있음을 보여준다. A) 감지된 RNA의 존재를 해당 표적 서열을 암호화하는 플라스미드의 절단에 연결하기 위한 대장균에서의 실험 설정. 분석은 감지된 RNA의 일부(피크 113으로부터 유래)를 활성 ncrRNA로 전환하도록 설계된 비천연 tracrRNA 및 CjeCas9를 사용하여 수행하였다. B) 플라스미드 제거(plasmid clearance) 결과. 감지된 RNA, 재프로그래밍된 tracrRNA 및 CjeCas9를 발현하는 플라스미드를 보유하는 대장균 세포를 표적을 갖거나(표적화) 갖지 않는(비표적화) 플라스미드로 형질전환한 다음 모든 플라스미드를 보유하는 콜로니를 선택하기 위해 플레이팅하였다. 감지된 RNA 및 표적 서열의 존재는 비-표적화 대조군에 비해 형질전환된 콜로니의 수를 크게 감소시켰다. 감지된 mRNA(서열 번호 61)는 J23119 프로모터(서열 번호 13)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T7 종결인자(서열 번호 44)로 종결되었다. 재프로그래밍된 tracrRNA(서열 번호 66)는 OR2-OR1 프로모터(서열 번호 43)로부터 전사되었고 rho-비의존적 T500 종결인자(서열 번호 14)로 종결되었다. 표적 DNA(서열 번호 67).
도 17은 재프로그래밍된 tracrRNA가 상이한 Cas9 이종상동체를 안내하기 위해 RNA 전사체를 끌어들임을 보여준다. A) CjeCas9에 의해 사용되는 재프로그래밍된 tracrRNA(비천연 tracrRNA)의 설계. RpT-RNA는 관심 RNA를 ncrRNA로 전환하여 Cas9를 PAM-측면 DNA 표적으로 지시한다. W = A 또는 T. PAM: 노란색 원. B) TXTL에서 2차 구조를 보존하는 sgRNA의 RNA 이중체에 대한 돌연변이의 관용. 이중체는 tracrRNA와 쌍을 이루는 세포 RNA의 처음 12개 nt를 반영한다. C) TXTL에서 tracrRNA를 비천연 tracrRNA로 전환함으로써 덜 기능적이거나 비기능적인 ncrRNA에 의한 DNA 표적화를 향상시킨다. D) 3개의 상이한 Cas9 뉴클레아제와 상용성인 비천연 tracrRNA를 사용한 TXTL에서의 서열-특이적 DNA 표적화. B - D의 값은 TXTL에서 4개 복제물로부터의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. *: p < 0.01. **: p < 0.001, n.s.: 유의하지 않음. 표시된 바와 같은 서열은 GUUUUAGUCCCU (서열 번호 98), AGGGACUAAAAU (서열 번호 99), GCGCCGAGUUAG (서열 번호 100), 및 CUAACUCGGCGC (서열 번호 101)이다.
도 18은 재프로그래밍된 tracrRNA가 시험관내에서 단일-염기 분해능으로 다중화 가능한 RNA 검출을 가능하게 한다는 것을 보여준다. A) 다중 진단 플랫폼 LEOPARD의 개요. B) 시험관내 Cas9에 의한 표적 DNA의 고도로 특이적인 ncrRNA-매개된 절단. C) DNA 표적의 다중 모니터링. Cy5 형광 염료는 각 DNA 표적의 한쪽 말단에 추가되고, 각 표적 측면에 있는 서열의 길이는 모든 생성물이 겔에서 분해될 때 크기에 따라 시각화될 수 있도록 다양하다. D) PAGE를 변성시킴으로써 호흡기 바이러스와 관련된 9개의 상이한 RNA 단편의 병렬 검출. D와 E의 채워진 점은 오른쪽에 열거된 구성요소의 존재를 나타낸다. (E) SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 내 D614G 점 돌연변이(point mutation)의 특이적 검출. B, D 및 E에서의 각각의 검출된 T7-전사된 RNA는 양쪽 말단에 50-nt 확장을 갖는 의도된 ncrRNA 서열을 포함하였다.
도 19는 본 발명에 따른 전사 기록 방법을 보여준다. 이러한 실시양태에서, Sth1nCas9 염기 편집기는 전사 이벤트를 기록할 수 있다. 감지된 RNA로 비천연 tracrRNA를 발현시키면 대장균의 플라스미드에서 표적 DNA의 염기 편집이 야기된다. 편집은 설계된 crRNA:tracrRNA만큼 효율적이었다. A) 시험된 작제물. 확인 표시는 표준 이상의 작제물의 사용을 나타낸다. NT: 비-표적; mRNA(mut): 가이드의 추정 "시드" 영역에 점 돌연변이가 있는 ncrRNA를 암호화하는 mRNA; tracrRNA(scr): 항-반복 서열이 스크램블된 tracrRNA. 표적 플라스미드의 파란색 직사각형, 표적 서열; 노란색 원, Cas9 PAM. B) 시험된 작제물에 기반한 대장균에서의 편집 효율. 표시된 바와 같은 서열은 taagttcaatgtttttacattgagaaa (서열 번호 102)이다.
도 20은 편집 영역에서 C가 결여된 RNA가 기록된, 본 발명에 따른 전사 기록 방법을 보여준다. 이를 위해, 표적은 원래 C를 포함하지 않았지만, 편집을 평가하기 위해 다른 위치에 하나를 삽입하였다. 이 경우, 가이드와 표적 사이에 미스매치를 생성할 수 있기는 하지만 C가 상이한 위치에 삽입되었을 때 편집이 관찰되었다. 편집은 도 19와 유사하게 평가되었다. 표시된 바와 같은 서열은 agaauuuaugugaauuuuauug (서열 번호 103), 및 agaatttatgtgaattttattgtgagaaa (서열 번호 104)이다.
도 21은 비천연 tracrRNA 및 높은 GC-함량 mRNA를 사용한 효율적인 전사 기록을 보여준다. deGFP mRNA 내에서 GC 함량이 더 높은 영역에 혼성화하도록 비천연 tracrRNA를 설계한 다음, 플라스미드의 표적 서열을 사용하여 염기 편집을 평가하였다. 이러한 결과는 감지된 mRNA의 비천연 tracrRNA-혼성화 영역 내의 낮은-GC 함량이 전사 기록을 위한 요건이 아님을 보여준다. 편집은 도 19와 유사하게 평가되었다. tracrRNA(scr): 항-반복 서열이 스크램블된 tracrRNA. 표시된 바와 같은 서열은 cgtccaggagcgcaccatcttgagaaa (서열 번호 105), ctaccagcagaacacccccatgagaaa (서열 번호 106), ucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccg (서열 번호 107), 및 ucggcgacggccccgugcugcugcccgacaaccacu (서열 번호 108)이다.
도 22는 대장균에서 내인성 유전자의 전사 기록을 보여준다. 여기서, 배지에 D-크실로스가 첨가되었을 때 유도되는 xylA의 발현을 감지하도록 비천연 tracrRNA를 설계하였다. 이 경우에, Sth1nCas9 염기 편집기를 사용한 전사 기록은 D-크실로스가 첨가되었을 때 증가하였다. 이러한 실험은 도 19와 유사하게 수행되었다. 표시된 바와 같은 서열은 ttatcgaaccgaaaccgcaatgagaaa (서열 번호 109), 및 ggcggtcgtgaaggttacgatgagaaa (서열 번호 110)이다.
도 23은 표적화 활성을 여전히 유지하면서 CasX/Cas12e에 대한 crRNA:tracrRNA 이중체가 변형(재프로그래밍)될 수 있음을 보여준다. 이를 위해, 체계적인 돌연변이 분석을 수행하였다. sgRNA로서 암호화된 비-자연 발생 tracrRNA가 여전히 CasX/12e에 대한 서열-특이적 DNA 절단을 유도하는 것으로 확인되었다. 표시된 바와 같은 서열은 서열 번호 111 내지 서열 번호 119)이다.
도 24는 표적화 활성을 여전히 유지하면서 crRNA:tracrRNA 이중체가 변형(재프로그래밍)될 수 있음을 보여준다. 이를 위해, BhCas12b tracrRNA/crRNA의 체계적인 돌연변이 분석을 수행하였다. 비-자연 발생 tracrRNA가 여전히 BhCas12b에 대한 서열-특이적 DNA 절단을 유도하는 것으로 확인되었다. 표시된 바와 같은 서열은 서열 번호 120 내지 서열 번호 128)이다.
도 25는 감지된 RNA가 존재할 때 DNA 절단을 지시하는 재프로그래밍된/변형된 비-자연 발생 tracrRNA의 입증을 보여준다. 비-자연 발생 tracrRNA는 여전히 Cas12b 및 Cas12e에 대한 서열-특이적 DNA 절단을 유도한다.
실시예
C. 제주니
돌연변이 균주의 작제 및 성장
C. 제주니 돌연변이 균주(결실, 염색체 3xFLAG-태그됨)는 이중-교차 상동 재조합을 사용하여 작제하였다(High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates. PLoS Genet. 2013;9(5):e1003495). 간단히 말해서, 500bp 상동 말단을 갖는 PCR 산물 또는 원하는 돌연변이를 갖는 게놈 DNA를 앞서 기술된 바와 같이 전기천공법 또는 자연 형질전환을 사용하여 각각 C. 제주니에 도입하였다(High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates. PLoS Genet. 2013;9(5):e1003495). C . 제주니 균주를 미량호기성(10% CO2, 5% O2) 조건하에 37℃에서, 둘 다 10μg/ml 반코마이신이 보충된 Muller-Hinton 한천 플레이트 상에서 또는 Brucella 브로쓰(BB)에서 진탕하면서 일상적으로 성장시켰다.
C. 제주니
Cas9-3xFLAG의 RIP-seq
C. 제주니에서 Cas9-3xFLAG의 직접적인 RNA 결합 파트너를 확인하기 위해 RNA-seq(RIP-seq)와 결합된 공동-면역침전(Co-IP)을 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(CRISPR RNA-Dependent Binding and Cleavage of Endogenous RNAs by the Campylobacter jejuni Cas9. Mol Cell. 2018;69(5):893-905.e7).
간단히 말해서, 염색체 태그된 Cas9-3xFLAG의 Co-IP를 37℃에서 중간-대수 증식기(OD600 = 0.6)까지 성장한 C. 제주니 CG8421 cas9-3 x FLAG 및 WT (비태그됨, 대조군) 균주의 용해물로부터 항-FLAG 항체 및 단백질 A-세파로스 비드를 사용하여 수행하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 펠렛을 1 mL 완충액 A (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT)에 재현탁시키고, 이어서 원심분리하였다(3 min, 11,000 x g, 4℃). 펠렛을 액체 질소에서 급속-동결하고 -80℃에서 저장하였다. 동결된 펠렛을 얼음 위에서 해동하고 0.8mL 완충액 A에 재현탁시켰다. 그후 동일한 용적의 유리 비드를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포를 미리 냉각된 블록(4℃)에서 Retsch MM40 볼 밀(30 s-1, 10 min)을 사용하여 용해시키고 15,200 x g, 4℃에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 추가로 0.4mL의 완충액 A를 비드를 갖는 남은 미용해된 세포에 첨가하였다. 남은 세포의 용해는 30 s-1에서 5분 동안 두 차례의 용해에 의해 달성되었다. 원심분리를 반복하고 이러한 두 번째 상청액을 첫 번째 상청액과 합하였다. 합한 상청액을 청정화를 위해 다시 15,200 x g, 4℃에서 30분 동안 원심분리하고 생성된 상청액(용해물 분획)을 새로운 튜브로 옮겼다. 용해물을 로커(rocker) 상에서 4℃에서 30분 동안 35μl 항-FLAG 항체(Monoclonal ANTI-FLAG M2, Sigma, #F 1804, RRID: AB_262044)와 함께 배양하였다. 다음으로, 완충액 A로 미리 세척한 75μl의 단백질 A-세파로스(Sigma, #P6649)를 첨가하고 혼합물을 4℃에서 추가로 30분 동안 로킹하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛화된 비드를 0.5mL 완충액 A로 5회 세척하였다. 마지막으로, 500μl 완충액 A를 비드 및 RNA에 첨가하고 단백질을 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜을 사용하여 분리하였다. 각 CoIP로부터, ~1000ng의 RNA를 수성 상으로부터 회수하였다. 100μl의 1 × 단백질 부하 완충액을 비드(CoIP 샘플)와 함께 침전된 최종 단백질 샘플에 첨가하였다. 성공적인 CoIP의 검증을 위해, coIP의 상이한 단계 동안 수득된 단백질 샘플(배양물, 용해물, 상청액, 세척액 및 CoIP)을 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다.
cDNA 라이브러리 제조 및 딥 시퀀싱
잔류 gDNA를 상기 수득된 coIP RNA에 대한 DNase I 처리를 사용하여 제거하였다. Illumina 시퀀싱을 위한 cDNA 라이브러리는 앞서 기술된 바와 같이 가닥-특이적 방식으로 독일의 vertis Biotechnologie AG(http://www.vertis-biotech.com)에 의해 작제되었다(High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates. PLoS Genet. 2013;9(5):e1003495). 간단히 말해서, RNA 샘플을 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A)-꼬리를 달았다. 그후, 담배 산 피로포스파타제(tobacco acid pyrophosphatase; TAP)를 사용하여 5'-트리포스페이트를 제거한 다음 생성된 5'-모노포스페이트에 RNA 어댑터를 연결하였다. M-MLV 역전사효소를 사용하여 올리고(dT)-어댑터 프라이머로 첫 번째-가닥 cDNA를 합성하였다. PCR-기반 증폭 단계에서, 고충실도 DNA 중합효소를 사용하여, cDNA 농도를 10-20ng/μl로 증가시켰다. 모든 라이브러리에 대해, Agencourt AMPure XP 키트(Beckman Coulter Genomics)를 사용하여 DNA를 정제한 다음 후속적으로 모세관 전기영동으로 분석하였다.
다중 시퀀싱을 위한 라이브러리별 바코드는 3'-시퀀싱 어댑터의 일부로서 포함되었다. cDNA 삽입물에는 TruSeq_센스_프라이머(서열 번호 1) 및 TruSeq_안티센스_NNNNNN_센스_프라이머(서열 번호 2)가 측면에 있었다. 샘플을 단일-판독 모드에서 ~100 주기로 Illumina HiSeq 기기에서 실행하였다.
RIP-seq 시퀀싱 데이터의 분석
높은 서열 품질을 보장하기 위해, FASTQ의 Illumina 리드를 FASTX 툴킷 버전 0.0.13으로부터의 fastq_quality_trimer 프로그램에 의해 컷오프 phred 점수 20으로 트리밍하였다. 트리밍 후, 다음 분석 단계에 대해 파이프라인 READemption 버전 0.4.3을 적용하였다: 폴리(A)-꼬리 서열을 리드의 3' 말단에서 잘라내고, 크기 필터링을 적용하여 12nt보다 짧은 리드 서열을 제거하고, 나머지 리드 컬렉션을 자가-큐레이트된 C. 제주니 CG8421 게놈에 정확도 컷오프가 95%인 segemehl 버전 0.2.0을 사용하여 매핑하였다.
READemption을 사용하여 뉴클레오티드당 매핑된 리드의 수를 나타내는 커버리지 플롯을 생성하였다. 다중 위치에 매핑된 리드는 커버리지 값에 일부 기여하였다. 10nt의 최소 중첩을 갖는 각 리드를 리드가 매핑된 위치의 수를 기반으로 하는 값으로 계수하였다. 리드가 하나 이상의 주석과 겹친 경우, 값을 영역 수로 나누고 각 영역에 대해 별도로 계수하였다(예를 들어 3개 위치에 매핑된 리드의 경우 1/3).
통합 게놈 브라우저(IGB)에서의 시각화를 위해, 커버리지 파일을 각 라이브러리로부터 매핑될 수 있는 리드의 수로 정규화하였다. 그후 원래 데이터 범위를 복원하기 위해, 각 그래프에 두 라이브러리에 걸친 매핑된 리드의 최소 수를 곱하였다.
피크 검출 및 결합 모티브 분석
Cas9-3xFLAG coIP 데이터세트로부터 Cas9-결합된 RNA 영역 또는 피크를 자동으로 정의하기 위해, 원래 C. 제주니에서 CsrA의 결합 영역을 검출하기 위해 개발된 슬라이딩 창 접근방식을 기반으로 하는 사내 도구 "sliding_window_peak_calling_script"를 적용하였다(The CsrA-FliW network controls polar localization of the dual-function flagellin mRNA in Campylobacter jejuni. Nat Commun. 2016;7:11667). 스크립트는 https://doi.org/10.5281/zenodo.49292하에서 Zenodo에 기탁되었다. 이 스크립트는 Python 3으로 작성되었으며 실행하려면 Python 3 패키지 numpy 및 scipy를 설치해야 한다.
간단히 말해서, "sliding_window_peak_calling_script" 소프트웨어는 Cas9-3xFLAG 및 제어 coIP 라이브러리의 rRNA 정규화된 위글 파일을 입력으로 사용하여 대조군에 비해 Cas9-3xFLAG-태그된 라이브러리의 지속적인 풍부를 보여주는 부위를 결정한다. 풍부화된 영역의 식별은 네 가지 매개변수에 기반한다: 풍부화를 위한 최소 필수 배수-변화(FC), 태그된 라이브러리의 최소 필수 발현(MRE)을 반영하는 위글 그래프의 90th 백분위수를 곱한 계수, 이전 두 값이 슬라이딩 창 접근방식으로 계산된 nt 단위의 창 크기(WS), 및 창이 게놈 축을 따라 이동하는 스텝을 정의하는 뉴클레오티드 스텝 크기(SS). 풍부화 요건을 충족하는 모든 연속 창은 단일 피크 영역으로 조립된다. 피크 검출은 각 레플리콘의 정방향 및 역방향 가닥에 대해 별도로 수행된다. Cas9-3xFLAG coIP 데이터세트의 경우, 다음 매개변수가 사용되었다: FC = 5, MRE = 3, WS = 25 및 SS = 5. 그후 MEME를 피크 서열을 기반으로 하는 컨센서스 모티프의 예측에 사용하였다. 그후 두 개의 유의하게 풍부화된 모티프를 crRNA 및 tracrRNA 서열과 비교하여 이들의 예상 결합 모드를 추론하였다.
노던 블롯 분석
노던 블롯 분석을 위해, 100μg의 DNaseI 처리된 총 RNA 샘플을 각 레인에 부하하였다. 7M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드(PAA) 겔에서 분리 후, RNA를 일렉트로블로팅에 의해 Hybond-XL 막(GE-Healthcare)으로 옮겼다. 블롯팅 후, RNA는 막에 UV 가교-결합되고 γ32P-ATP 말단-표지된 DNA 올리고뉴클레오티드와 혼성화되었다.
플라스미드 작제
이 작업에 사용된 모든 프라이머, gBlocks는 Integrated DNA Technologies(IDT, Coralville, US)로부터 주문하였다. NEBuilder® HiFi DNA 조립 클로닝 키트를 Gibson 조립에 의한 플라스미드 작제에 사용하였다. 관련 서열 번호(서열 번호 1 내지 96)는 전문이 참고로 포함되어 있는 첨부된 서열 목록에서 찾을 수 있다. Q5 부위-지정 돌연변이유발 키트를 작은 삽입 및 뉴클레오티드 치환을 위해 사용하였다. 달리 명시되지 않는 한, 사용된 모든 뉴클레아제는 Cm 선택 마커 및 p15A 복제 기점(ORI)이 있는 플라스미드에서 발현되었다. 모든 sgRNA 또는 tracrRNA-crRNA 또는 tracrRNA-ncrRNA 플라스미드는 Amp 선택 마커 및 ColE1 ORI가 있는 플라스미드에서 발현되었고, 모든 표적화된 플라스미드는 Kan 선택 마커 및 pSC101 ORI가 있는 플라스미드에서 발현되었다.
Cas9 및 Cas12 플라스미드 작제의 경우, SpyCas9 및 대장균 코돈-최적화 CjeCas9 유전자를 플라스미드 pCB843 및 pCB588로부터 PCR 증폭한 다음, 각각 PCR-선형화된 벡터 pCBS583으로 Gibson-조립하였다.
상이한 길이의 5'-돌출부를 갖는 sgRNA를 암호화하는 플라스미드를 작제하기 위해, fliF- 또는 1093-표적화 sgRNA 및 상이한 5'-돌출부를 갖는 이들의 변이체를 암호화하는 gBlock을 각각 PCR-선형화된 벡터 pCSM180으로 Gibson-조립하였다. 이중-RNA-가이드(tracrRNA/crRNA) 시스템에서 5'-돌출부를 갖는 crRNA의 경우, 벡터 및 crRNA 카세트가 있는 상동성 아암(arm)을 도입하기 위해 tracrRNA 발현 카세트를 gBlock CJfr0018의 주형 및 CJpr0304/CJpr0305의 프라이머 쌍(서열 번호 3-4)을 사용한 PCR-증폭에 의해 수득하였다. fliF-표적화 crRNA 및 이의 5' 돌출부 변이체 발현 카세트를 CJfr0022, CJfr0070 및 CJfr0071의 주형 및 CJpr0110/CJpr0291의 프라이머 쌍(서열 번호 5-9)을 사용한 PCR-증폭에 의해 수득하여 벡터 및 tracrRNA 카세트가 있는 상동성 아암을 도입하였다. TracrRNA 발현 카세트 및 5'-오버행을 갖는 crRNA 발현 카세트를 각각 PCR-선형화된 벡터 pCSM180으로 Gibson-조립하였다.
이중-RNA 시스템에서 3'-오버행을 갖는 crRNA를 암호화하는 플라스미드를 작제하기 위해 유사한 방법을 수행하였으며, 유일한 차이점은 CJfr0080, CJfr0081 및 CJfr0176(서열 번호 10-12)의 주형을 사용한 PCR 증폭에 의해 fliF-표적화 crRNA 및 이의 3'-돌출부 변이체 발현 카세트를 수득한다는 것이었다.
CjeCas9, SpyCas9 및 Sth1Cas9에 대한 재프로그래밍된 ncrRNA 플라스미드를 작제하기 위해, 피크 113(스패닝 유전자 CJ8421_04970 & 04975 & 04980)을 보유하는 mRNA를 표적으로 하는 변형된 tracrRNA의 주형으로 사용하였다. 이 피크는 CjeCas9 공동-면역침전의 일부로서 상당히 풍부한 것으로 확인된 RNA 중 하나였다. 변형된 tracrRNA를 암호화하는 gBlocks 및 피크 113-보유 mRNA를 플라스미드 pCJ174로부터 PCR-증폭시키고 PCR-선형화된 벡터 pCSM180으로 Gibson-조립하였다.
CjeCas9에 대한 자가-표적화 ncrRNA를 작제하기 위해, 피크 113-보유 mRNA 및 리포터 유전자 GFP를 하나의 플라스미드에 정렬하고, 변형된 tracrRNA를 다른 플라스미드에 정렬하였다. PAM 서열을 Q5 부위-지정 돌연변이유발(mutagenesis)을 사용하여 tracrRNA-ncrRNA의 반복-항-반복 줄기의 베이스에 도입하였다.
모든 표적화된 플라스미드 작제를 위해, 표적 서열을 pCSM168을 주형으로 하은 Q5 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 프로모터 OR2-OR1의 상부에 또는 프로모터 OR2-OR1과 GFP CDS 사이에 삽입하였다.
TXTL을 사용한
시험관내
DNA 절단 분석
TXTL 시스템을 사용하여 ncrRNA, 및 어떻게 tracrRNA를 재프로그래밍/변형할 수 있는지를 특성화하였다. 이 시스템은 각 구성요소를 암호화하는 선형 또는 플라스미드 DNA를 대장균에 도입함으로써 작동한다. 그후 대장균 용해물은 대장균 신호를 기반으로 구성요소(예를 들어 프로모터, RBS)를 전사하고 번역한다. crRNA(또는 ncrRNA)의 PAM-측면 표적을 포함하는 GFP 리포터를 사용함으로써, crRNA/ncrRNA의 생물발생 및 활성을 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 분석은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Rapid and Scalable Characterization of CRISPR Technologies Using an E. coli Cell-Free Transcription-Translation System. Mol Cell. 2018;69(1):146-157.e3). 분석에 사용된 모든 DNA 단편 또는 플라스미드에는 뉴클레아제(DNase, RNase) 및 TXTL 기구의 억제제가 없어야 한다. Cas9, sgRNA/이중-RNA 및 deGFP-암호화 리포터 플라스미드를 각각 1.5nM, 0.5nM 및 1nM의 최종 농도로 myTXTL Sigma 70 Master Mix(Arbor Biosciences)에 첨가하였다. 선형 단편을 발현할 때, 최종 농도 5uM의 GamS(Arbor Biosciences)를 보충하고, 프로모터와 deGFP 코딩 서열 사이에 표적 서열이 삽입된 fliF-표적화된 플라스미드(pCJ002)를 사용하였다. T7 프로모터-유도된 유전자를 발현할 때 0.5 nM의 최종 농도의 T7 RNA 폴리머라제-암호화 플라스미드를 보충하였다. 485nm의 여기 필터 및 528nm의 방출 필터가 있는 96-웰 V-바닥 플레이트(Corning Costar 3357)를 사용하여 BioTek Synergy Neo2 플레이트 판독기에서 형광을 측정하였다. 시간 경과 측정은 판독 사이에 3분 간격으로 29℃에서 16시간 동안 실행하였다.
tracrRNA 재프로그래밍
피크 113-보유 mRNA를 tracrRNA를 표적으로 재프로그래밍하기 위한 주형으로 사용하였다. 대장균 Rnase III에 의해 우선적으로 인식되는 AT-풍부한 서열을 포함하는 영역을 재프로그래밍된 tracrRNA의 표적으로 선택하였다(In vivo cleavage rules and target repertoire of RNase III in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 2018;46(19):10380-10394). 이 영역은 AT-풍부 모티프를 포함하며, CjeCas9의 경우 길이가 25bp이고 SpyCas9 및 Sth1Cas9의 경우 길이가 38bp였다. CjeCas9의 경우, 천연 tracrRNA의 항-반복 부분이 각각 선택된 표적에 상보적인 서열로 대체되었다. SpyCas9 및 Sth1Cas9의 경우, tracrRNA의 항-반복 부분에서 6번째와 7번째 사이, 또는 9번째와 10번째 뉴클레오티드 사이(이중체에서 아래에서 위로 계수함)에 추가로 4개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 도입하여 벌지를 생성하였으며, 이것은 SpyCas9 및 Sth1Cas9 활성을 유지하는데 필요하다(Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol Cell. 2014;56(2):333-339). 상응하게, 이들 염기쌍 영역의 상류에 있는 20-bp 내지 24-bp 서열을 스페이서로서 처리하였다.
대장균
에서 플라스미드 제거 분석
플라스미드 제거 분석은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(CRISPR RNA-Dependent Binding and Cleavage of Endogenous RNAs by the Campylobacter jejuni Cas9. Mol Cell. 2018;69(5):893-905.e7). 40nM sgRNA, ncrRNA 플라스미드를 Cas9 및 표적화 또는 비표적화 플라스미드를 포함하는 대장균 균주에 전기천공하였다. SOC 배지에서 1시간 회수한 후, 이들 형질전환체의 10배 연속 희석액 3ul를 37℃에서 밤새 배양하기 위해 Cm+Amp+Kan 항생제가 있는 LB 플레이트에 스팟팅(spotted)하였다. 계수 가능한 스팟으로부터의 콜로니(colony)를 사용하여 비표적화 CFU를 표적화 CFU로 나누어 형질전환 효율의 배수-감소를 계산하였다.
T7 RNA 중합효소에 의한
시험관내
RNA 전사
RNA를 제품 매뉴얼에 따라 HiScribe™ T7 High Yield RNA 합성 키트(New England Biolabs)를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 시험관내-전사하였다. 전사된 RNA를 제품 매뉴얼에 따라 in-column DNase I 처리에 의해 제거된 잔류 DNA와 함께 RNA Clean & Concentrator-25(Zymo Research)를 사용하여 정제하였다.
LEOPARD를 사용한 시험관내 RNA 전사 및 검출
감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA를 T7 프로모터로 시작하는 합성 gBlocks에 암호화하고 HiScribe T7 시험관내 전사 키트(New England Biolabs, cat. #E2040S)를 사용하여 전사하였다. 전사된 RNA를 In-Column DNase I 처리에 의해 제거된 잔류 DNA와 함께 RNA Clean & Concentrator-25(Zymo Research)를 사용하여 정제하였다. 다른 역방향 프라이머와 쌍을 이루는 Cy5-표지된 정방향 프라이머를 사용하여 표적 플라스미드로부터 관련 DNA 표적을 PCR-증폭시켰다.
감지된 RNA 및 관련 비천연 tracrRNA를 95℃에서 2분 동안 가열하고 열순환기를 사용하여 45분에 걸쳐 25℃로 점차적으로 냉각함으로써 1X NEB3.1 완충액(New England Biolabs, cat. #B7203S)에서 1:1 몰 비로 어닐링하였다. 그후, SpyCas9(New England Biolabs, cat. #M0386M)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 25분 동안 배양하여 RNP 조립을 촉진하였다. 그후 DNA 표적을 첨가하고, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 DNA 절단을 촉진하였다.
ncrRNA에 대한 RNase의 첨가의 영향을 탐구하기 위해, 33.3U/ml의 최종 농도의 ShortCut® RNase III(New England Biolabs, cat. #M0245L) 및/또는 166.7μg/ml의 최종 농도의 RNase A(Thermo Fisher Scientific, cat. #EN0531)를 DNA 절단 단계 전 또는 도중에 첨가하였다. 그후 프로테이나제 K(New England Biolabs, cat. #P8107S)를 25.8 U/ml의 최종 농도로 첨가하고, 반응물을 실온에서 15분 동안 배양하여 Cas9를 소화시켰다. 표지되지 않은 DNA를 사용한 반응의 경우, DNA 표적의 최종 농도는 10nM인 반면, 감지된 RNA, 비천연 tracrRNA 및 SpyCas9의 최종 농도는 모두 200nM이었다. 표지되지 않은 DNA 생성물을 2% 아가로스 겔에서 분리하고 Intas GelStick Imager로 시각화하였다. Cy5-표지된 DNA와의 반응의 경우, DNA 표적의 최종 농도는 2nM인 반면, 각각의 감지된 RNA 및 비천연 tracrRNA의 최종 농도는 40nM이었다. SpyCas9의 최종 농도는 개별 RNA 검출의 경우 40nM이었고 다중 RNA 검출의 경우 360nM이었다. 다중 RNA 검출의 경우, 9개의 비천연 tracrRNA 및 DNA 표적 모두가 바이러스 RNA를 개별적으로 또는 3개 또는 5개 세트로 검출하기 위한 단일 반응 튜브에 존재하였다.
개별 또는 다중 RNA 검출을 위해 생성된 생성물을 추적 염료 없이 Novex® TBE HiDensity 완충액와 함께 부하하고, 4-20% Novex™ TBE 겔(Invitrogen, cat. #EC6225BOX)에서 분리하였다.
LEOPARD를 사용하여 단일-염기 분해능으로, SARS-
CoV
-2 및 이의 우세한
D614G
변이체를 구별하고 한 번의 검사로 상이한 호흡기 바이러스로부터 RNA를 동시 검출함
LEOPARD를 사용한 시험관내 RNA 전사 및 검출은 상기 나타낸 바와 같이 수행하였다. 다중 RNA 검출을 위해, 모든 비천연 tracrRNA 및 DNA 표적은 바이러스 RNA를 개별적으로 또는 3개 또는 5개 세트로 검출하기 위한 단일 반응 튜브에 존재하였다. 개별 또는 다중 RNA 검출을 위해 생성된 생성물을 추적 염료 없이 Novex® TBE HiDensity 완충액와 함께 부하하고, 4-20% Novex™ TBE 겔(Invitrogen, cat. #EC6225BOX)에서 분리하였다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 D614G 돌연변이의 특이적 검출 및 효모 총 RNA 실험을 위한 개별 제품을 2% 아가로스 겔에 부하하였다. Cy5 표지가 있는 겔에 대한 이미지는 Amersham Typhoon™ Biomolecular Imager(GE Healthcare)에서 캡처하였다. 도 18e는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 내에서 D614G 점 돌연변이의 특이적 검출을 보여준다. 검출된 각각의 T7-전사된 RNA는 양쪽 말단에 50-nt 확장을 갖는 의도된 ncrRNA 서열을 포함하였다.
SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에서의 D614G 돌연변이는 이 돌연변이가 단일 nt 변화(A23403G)로부터 초래되고 증가된 감염성 및 이의 전반적인 확산과 관련이 있기 때문에 기능-예시의 증거로서 역할을 한다. 표적의 시드 영역 내에 이러한 nt 변화를 배치함으로써, 본 발명자들은 WT 또는 D614G 표적과 결합된 하나의 비천연 tracrRNA를 사용하여 WT 또는 D614G RNA를 검출할 수 있었다(도 18e). 본 발명자들은 각 표적을 개별적으로 시험할 때 매칭되는 DNA 표적이 우선적으로 절단된다는 것을 발견하였다. 그러나, 단일 반응에서 두 표적을 결합하면 일치하는 표적에 대해서만 식별 가능한 절단이 생성되었으며, 이는 아마도 Cas9에 의한 완전한 표적의 우선적인 결합 및 절단을 통해 이루어졌다. 따라서, LEOPARD는 단일-염기 분해능으로 단일 반응에서 다중 RNA 검출을 제공할 수 있다.
상이한 tracrRNA에 대한 항-반복 영역 식별
비천연 tracrRNA 설계의 일부로서, tracrRNA의 항-반복 방지의 서열을 감지된 RNA의 영역에 상보적이도록 변경한다. 이러한 영역을 확인하는 것은 비교적 간단하며 NUPACK 또는 mfold와 같은 일반적인 RNA 폴딩 알고리즘을 사용하는 것과 같이 CRISPR 어레이에서 반복체 중 하나와 tracrRNA의 염기-쌍형성 가능성을 평가함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 이 영역은 정제된 반복체 및 정제된 tracrRNA를 혼성화한 다음 일반적인 프로빙 접근법(예를 들어 DMS, SHAPE 사용)을 통해 RNA 구조를 평가함으로써 실험적으로 결정될 수 있다. 항-반복 영역은 반복 영역과 부분적으로 또는 완전히 염기 쌍을 이루는 영역이 될 것이며 tracrRNA 서열의 5' 말단 주위에서 시작해야 한다. 예에 대해서는 도 9 - 11을 참조한다.
시험관내
RNA 검출을 위한 비천연 tracrRNA의 사용
Sigma-Aldrich에서 판매하는 GenEasy RNA 추출 키트 또는 Qiagen에서 판매하는 RNeasy RNA 추출 키트와 같은 일반적인 RNA 정제 방법을 사용하여 샘플로부터 RNA 컬렉션(collection)을 추출한다. 샘플은 인간 또는 동물(예를 들어 혈액, 가래, 생검), 식물(예를 들어 잘린 뿌리, 잘린 잎), 토양, 물 또는 공기로부터 유래할 수 있다.
각 샘플 내에서 검출하고자 하는 RNA의 세트를 사용자의 특정 요구에 따라 선택한다. 수반되는 비천연 tracrRNA의 세트는 tracrRNA의 항-반복 부분의 서열을 RNA의 일부에 상보적이도록 변경함으로써 설계된다. 도 9 - 11은 CjeCas9, SpyCas9 또는 Sth1Cas9를 사용할 때 변경되는 tracrRNA의 영역을 보여주지만, 유사한 접근방식이 다른 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제로 확장될 수 있다. 대장균 RNase III를 사용하는 경우, A/T-풍부 서열이 일반적으로 바람직하지만, RNase III의 다른 변이체 또는 기타 dsRNA-절단 효소(예를 들어 Rntp1, Pac1p, DCL1, Dicer, Drosha)도 이들의 서열 선호도에 기반하여 사용될 수 있다. 상보성 영역은 또한 RNA:RNA 혼성화 및 효소적 절단을 더 잘 촉진하기 위해 확장되거나 감소될 수 있다. 다중 비천연 tracrRNA는 또한 감지된 RNA의 다른 영역을 인식하도록 설계되어 단일 전사체로부터 다중 ncrRNA를 생성할 수 있다. 비천연 RNA와 쌍을 이루는 감지된 RNA의 영역의 상류 부분은 DNA 표적화를 위한 가이드 서열이 된다. 이 영역의 길이는 뉴클레아제에 기반하여 다양하다(예를 들어 도 9 - 11에 나타낸 바와 같이 CjeCas9, SpyCas9 및 Sth1Cas9에 걸쳐 20 - 24 nts). 이러한 RNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 또는 표준 상용 공급업체(예를 들어 IDT)를 통한 맞춤 합성에 의해 생성된다.
그 후 각 ncrRNA에 대해 dsDNA 표적을 설계한다. 표적은 CRISPR 뉴클레아제에 의해 인식되는 적절한 PAM이 측면에 있는 ncrRNA의 가이드 서열을 포함한다(예를 들어 CjeCas9의 경우 NNNNACAC, SpyCas9의 경우 NGG, Sth1Cas9의 경우 NNAGAA). 특히 CjeCas9, SpyCas9 및 Sth1Cas9에 대한 시각적 묘사에 대해서는 도 9 - 11을 참조한다. dsDNA 표적은 맞춤-합성된 DNA 올리고뉴클레오티드(예를 들어 IDT로부터)를 어닐링함으로써 또는 맞춤-합성된 dsDNA(예를 들어 IDT로부터의 gBlocks)로부터 생성된다. 합성 과정의 일부로서, 다른 모이어티를 추가하거나 DNA를 표면에 공유 연결하기 위한 클릭 화학(click chemistry)을 위한 형광단 및 소광제 또는 태그와 같은, 시험관 내 RNA 검출의 일부로 DNA 표적을 사용하기 위해 다른 화학적 모이어티가 추가될 수 있다.
반응은 또한 정제된 tracrRNA-의존성 뉴클레아제(예를 들어 SpyCas9) 및 임의로 dsRNA-절단 효소(예를 들어 RNase III)를 포함한다. 뉴클레아제는 검출 단계가 표적 핵산 결합 또는 절단을 포함하는지 여부에 따라 촉매적으로-사멸되거나 촉매적으로-활성일 수 있다.
대표적인 검출 분석의 일부로서, 샘플로부터 정제된 RNA를 RNA 혼성화를 촉진하는 결합 완충액(예를 들어 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 및 0.05% Tween-20, pH 7.8)에서 비천연 tracrRNA의 세트와 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 배양하여 RNA 간에 이중체를 형성한다. 그후 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 및 dsRNA-절단 효소를 첨가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 20분 동안 배양한다. 이 단계 동안, dsRNA-절단 효소는 감지된 RNA와 비천연 tracrRNA 사이에 형성된 것과 같은 RNA 이중체를 절단하고, tracrRNA-의존성 뉴클레아제와 절단된 RNA 이중체 사이에 리보핵단백질 복합체가 형성된다. 그후 생성된 혼합물을 DNA 표적에 노출시켜, 리보핵단백질 복합체가 각각의 DNA 표적을 표적화하도록 한다. DNA 표적은 가용성 분자로서 추가될 수 있거나 고체 표면(예를 들어 실리콘 칩의 자기 비드)에 부착될 수 있다. 그후 세척 단계를 (예를 들어 결합 완충액을 사용하여) 추가하여 RNA, dsRNA-절단 효소, 결합되지 않은 리보핵단백질 복합체, 및 DNA 표적의 절단된 및 비부착된 부분을 제거할 수 있다.
마지막으로, DNA 표적을 이들이 리보핵단백질 복합체에 의해 인식된 정도를 측정하기 위해 평가한다(다른 대표적인 예에 대해서는 도 12 참조). 여기에는 다른 형식이 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 표적은 한쪽 말단에 융합된 형광단 및 다른 쪽 말단에 융합된 또는 다른 표면의 부근에 (예를 들어, DNA 표적을 실리콘 칩에 부착할 때) 소광제를 포함할 수 있다. 표적의 절단은 소광제에 융합된 DNA 조각을 방출하여 형광 신호를 생성한다. DNA의 크기 변화는 형광 신호의 변화에 대한 필요 없이도 크기별로 DNA를 분리함으로써(예를 들어 모세관 전기영동, 겔 전기영동을 통해) 측정될 수 있다. 별도의 예로서, 형광단 및 소광제는 같은 면의 두 가닥에 부착될 수 있다. 돌연변이된 버전의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제(예를 들어 Cas9n)에 의한 비표적 가닥의 닉킹은 소광제에 융합된 가닥을 방출하여 소광제가 확산되고 형광 신호를 생성하도록 할 수 있다. 최종 예로서, 형광단 또는 염료(예를 들어 FITC, Texas Red)는 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 또는 tracrRNA에 융합될 수 있으며, 여기서 뉴클레아제는 (예를 들어 엔도뉴클레아제 도메인에 대한 돌연변이 또는 표적 내의 PAM-말단 미스매치 암호화를 통해) 이의 DNA 표적을 절단하지 않는다. 표적을 특정 위치(예를 들어 실리콘 칩)에 국소화함으로써, 해당 위치의 형광/비색 강도는 해당 표적에 대한 결합된 리보핵단백질 복합체를 반영한다. 이러한 국소화는 카메라 또는 포토다이오드 어레이와 같은 다양한 접근방식을 사용하여 공간적으로 검출할 수 있다.
이러한 모든 예에서, 측정된 출력은 특정 DNA 표적에 연결되어, 감지된 RNA의 존재를 간접적으로 판독하는 역할을 한다. 판독은 형광 강도에 기반하여 샘플에서 감지된 각 RNA의 농도를 명시하기 위해 정량적으로 제시될 수 있다. 예를 들어, 동일한 DNA 표적 서열을 암호화하는 분자의 클러스터가 존재하는 경우, 형광 강도는 적절한 ncrRNA를 암호화하는 리보핵단백질 복합체에 의해 인식되는 DNA 분자의 수 - 및 따라서 ncrRNA를 생성하는 감지된 RNA 분자의 수에 따라 크기조정된다.
dsDNA 표적을 사용하는 것 외에도, ssDNA 및 RNA 표적이 또한 진단 플랫폼의 일부로서 사용될 수 있다. 다중 Cas9 및 Cas12 뉴클레아제(예를 들어 CjeCas9, NmeCas9, SauCas9)는 ssDNA 및 RNA를 인식하는 것으로 나타났으며, 여기서 인식은 가이드 RNA의 가이드 영역에 대한 염기 쌍을 포함하지만 PAM은 포함하지 않는다. 표적의 한쪽 말단에 형광단을 부착하고 다른 말단에 소광제를 부착하여 표적 절단이 소광제를 방출하거나 형광단-접합 뉴클레아제가 표적 결합시 형광을 국소화할 수 있는 것과 같은 검출을 위한 유사한 설정이 사용될 수 있다.
일부 Cas9 뉴클레아제(예를 들어 SpyCas9)는 이중-가닥 PAM 서열이 표적 바로 옆에 존재하지 않는 한 ssDNA 또는 RNA를 인식할 수 없다. 이것은 PAM 및 측면 서열에 대한 고정 서열이 있는 ssDNA 표적을 사용함으로써 표적 설계에 통합될 수 있다. 그후 또 다른 ssDNA 올리고가 고정된 서열에 혼성화되어 단일-가닥 표적이 있는 이중-가닥 PAM 및 측면 서열을 제공할 수 있다.
본원에 기술된 예는 치료 과정을 알아내기 위해 의학적 상태를 진단하거나, 건강 결과 또는 질병과 관련된 SNP를 확인하거나, 음용수에서 미생물 오염물질을 확인하거나, 발효 또는 세포 배양물에서 바이러스 또는 미생물 오염물질을 확인하거나, 식물 또는 곤충 변이체를 확인하거나, 혼합 군집(예를 들어 장, 토양, 물)에서의 주요 미생물 구성원을 확인하는 것과 같은 광범위한 용도에 사용될 수 있다.
생체내
RNA 기록을 위한 비천연 tracrRNA의 사용
이러한 적용을 위해, 비천연 tracrRNA를 편집된 DNA 형태의 세포에서의 하나 또는 다수의 감지된 RNA의 존재 또는 측정 가능한 리포터 유전자의 변경된 발현을 기록하는데 사용한다.
tracrRNA-의존성 뉴클레아제 및 비천연 tracrRNA를 전달 및 세포 발현을 위한 선형 DNA, 플라스미드 또는 바이러스 작제물에 암호화한다. tracrRNA는 개별 발현 작제물로서 개별적으로 또는 RNA 절단 서열(예를 들어 tRNA, 리보자임)이 개재된 단일 작제물로 발현될 수 있다.
생성된 ncrRNA의 표적을 나타내는 DNA를 동일한 벡터 또는 별도의 벡터에 암호화할 수 있으며, 여기서 이의 조성은 검출된 RNA를 기록하기 위해 뉴클레아제를 사용하는 방법에 따라 좌우될 것이다. 대표적인 예에 대해서는 도 13 및 19 내지 22를 참조한다. 하나의 경우에서, DNA 편집(예를 들어, 인델 형성, 염기 편집)이 판독으로서 역할을 하며, 각 비천연 tracrRNA에 대한 DNA 표적만 암호화되어야 한다. 상동성-직접 수선 또는 상동성 재조합의 경우, 상동성 아암이 측면에 있는 의도된 편집을 포함하고 올리고뉴클레오티드, 선형 dsDNA 또는 원형 DNA의 형태의 재조합 주형이 세포에 존재할 수도 있다. 대안적으로, 뉴클레아제는 형광 RNA 앱타머(예를 들어 RNA 시금치), 형광 단백질(예를 들어 GFP) 또는 시각적 출력을 생성하는 효소(예를 들어 X-gal과 결합된 LacZ)와 같은 리포터 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 그후 뉴클레아제는 리포터의 발현을 조절한다(예를 들어 프로모터 또는 코딩 영역을 표적으로 하여 전사를 차단하고, 박테리아의 SoxS 또는 진핵 세포의 VP16과 같은 융합되거나 모집된 활성화 도메인을 통해 RNA 중합효소를 모집함).
작제물은 ncrRNA 생합성을 위해 dsRNA-절단 효소(예를 들어 대장균 RNase III)를 발현할 수 있다. 그러나, 사실상 모든 세포는 대신 사용될 수 있는 dsRNA 절단-효소를 발현한다. dsRNA-절단 효소는 또한 전혀 필요하지 않을 수 있다.
검출 및 기록을 수행하기 위해, DNA 작제물을 표준 수단(예를 들어 전기천공, 화학적 형질전환, 접합, 형질감염, 바이러스 전달)을 통해 세포에 도입하며, DNA는 일시적으로만 존재할 수 있거나(예를 들어 일시적 형질감염을 통해) 안정적으로 유지될 수 있다(예를 들어 선택하에 또는 염색체 DNA에 통합됨). 그후 구성요소는 감지된 RNA의 존재를 능동적으로 검출하기 위해 작제물로부터 발현된다. RNA가 존재하는 경우, 이것은 ncrRNA로 전환되고 tracrRNA-의존성 뉴클레아제를 표적 DNA 리포터로 지시한다. 발현에 의존하는 리포터의 경우, 표준 기술을 사용하여 리포터 활성(예를 들어 유세포 분석 또는 형광 미세역가 플레이트 판독기에 의한 형광)을 측정할 수 있다. DNA 편집에 의존하는 리포터의 경우, DNA 서열을 직접 또는 간접적으로 출력하는 표준 접근방식(예를 들어 Sanger 시퀀싱, 차세대 시퀀싱)을 통해 표적을 프로빙할 수 있다.
하나의 예로서, 비천연 tracrRNA를 SpyCas9로부터 유래된 염기 편집기(예를 들어 BE3)와 조합하여 대장균에서 다중약물 내성 유전자(예를 들어 NMD-1을 암호화) 또는 스트레스-반응 유전자(예를 들어 철-고갈 유도된 sRNA RyhB를 암호화)의 발현을 감지하였다. 비천연 tracrRNA는 도 10에 나타낸 바와 같이 감지된 RNA의 일부에 혼성화하도록 설계되었다. ncrRNA의 수반되는 가이드 서열이 표적 DNA를 설계하는데 사용되었으며 BE3에 의한 편집을 거칠 수 있는 내부 C를 포함하도록 선택되었다. 그후 이 표적 DNA를 BE3 및 비천연 tracrRNA에 대한 발현 작제물과 함께 플라스미드(예를 들어 pBAD18)에 암호화하였다. 그후 플라스미드를 대장균 균주로 형질전환하고 NMD-1을 암호화하는 별도의 플라스미드와 함께 또는 없이 또는 철 킬레이터의 존재하에 배양하였다. 그후 플라스미드를 단리하고 Sanger 시퀀싱 분석을 위해 표적 DNA를 증폭시켰다. 표적 부위는 감지된 RNA가 플라스미드를 암호화하는 NMD-1을 제거하거나 성장 배지에 추가 철을 첨가함으로써 더 이상 발현되지 않더라도 감지된 RNA가 발현된 균주에서 C에서 T로의 예상되는 전환을 암호화하였다. 또한 2개의 비천연 tracrRNA와 표적 부위 사이에 혼선이 없었고, 비천연 tracrRNA 및 표적에 의해 암호화하고 세포를 NMD-1 플라스미드와 철 킬레이터 모두에 노출시킴으로써 검출을 다중화하였다. 이러한 예는 염기 편집이 기능적인 것으로 나타난 효모, 동물 세포, 인간 세포 또는 식물 세포와 같은 진핵 세포 뿐만 아니라 다른 박테리아로 쉽게 확장될 수 있다.
위의 예와 병행하여, 비천연 tracrRNA는 전사-의존적 기록을 위해 Cas12k를 기반으로 하는 CRISPR 트랜스포존과 결합될 수 있다. Cas12k, 트랜스포존 구성요소(TnsB, TnsC, TnsQ), 트랜스포존 반복체가 측면에 있는 삽입 주형(예를 들어 리포터 유전자 또는 항생제 내성 마커를 암호화함) 및 비천연 tracrRNA는 상응하는 표적 부위를 암호화하는 플라스미드 DNA와 함께 발현 플라스미드 내에서 암호화될 수 있다. 이러한 설정을 사용하여, 감지된 RNA의 존재는 표적 서열에 근접한 주형 삽입을 유도할 것이다. 그후, PCR 또는 시퀀싱을 통해 삽입을 검출할 수 있다.
전사-의존적 표적화를 위한 비천연 tracrRNA의 사용
비천연 tracrRNA의 또 다른 적용은 유전자가 활발히 전사될 때만 세포에서 DNA 표적을 편집하는 것을 포함한다. 이러한 적용의 일부로서, 비천연 tracrRNA는 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM 서열을 암호화하는 감지된 RNA의 영역에 혼성화하도록 설계된다. PAM은 유형 II 또는 V CRISPR 뉴클레아제 각각에 대해 감지된 RNA의 혼성화 부분의 5' 말단 또는 3' 말단에 특이적으로 위치할 것이다. 이 위치에서 PAM을 암호화함으로써, 생성된 ncrRNA는 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제를 감지된 RNA를 암호화하는 DNA 유전자좌로 지시할 수 있다. 감지된 RNA는 이 과정에서 필수 구성요소이기 때문에, 감지된 RNA가 존재할 때, 따라서 DNA 유전자좌가 전사될 때에만 DNA 유전자좌가 표적화를 겪을 것이다. 도 14는 이 개념을 예시하는 반면 도 15는 TXTL을 사용한 원리-증명 입증을 제공한다.
세포에서 전사-의존적 표적화를 달성하기 위해, tracrRNA-의존성 뉴클레아제 및 비천연 tracrRNA는 전달 및 세포 발현을 위한 플라스미드 또는 바이러스 작제물에서 암호화된다. tracrRNA는 개별 발현 작제물로서 개별적으로 또는 RNA 절단 서열(예를 들어 tRNA, 리보자임)이 개재된 단일 작제물로 발현될 수 있다. 뉴클레아제는 DNA 수선 주형의 존재하에서 인델 형성 또는 상동 재조합을 유도할 수 있거나, 뉴클레아제는 염기 편집기로서 또는 프라임 편집기로서 기능하도록 변형되는 경우 다른 편집을 생성할 수 있다. 대안적으로, 촉매적으로-사멸된 뉴클레아제는 전사를 차단하거나 KRAB를 동원하여 전사 억제를 유도하는 것과 같이 감지된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
작제물은 ncrRNA 생합성을 위해 dsRNA-절단 효소(예를 들어 대장균 RNase III)를 발현할 수 있다. 그러나, 사실상 모든 세포는 대신 사용될 수 있는 dsRNA-절단 효소를 발현한다.
예를 들면, 전사-의존적 편집은 모기의 유전자 드라이브 맥락에서 표적 유전자좌가 활발히 전사되는 경우에만 구현될 수 있다. 비천연 tracrRNA는 관련 표적 유전자좌(예를 들어 doublesex 유전자)로부터 ncrRNA를 생성하도록 설계되며, 감지된 RNA의 혼성화 영역은 PAM(예를 들어 SpyCas9를 사용할 때 이 영역의 5' 말단에 있는 NGG)을 암호화한다. tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제, 비천연 tracrRNA, 및 임의의 유전자 카고는 모기에 대한 표준 유전자-조작 기술을 통해 표적 유전자좌에 삽입되는 발현 작제물에 암호화된다. 그 결과로 생성된 모기가 짝짓기를 하여 자손을 낳을 때, 유전자 드라이브는 유전자좌가 활발하게 전사되는 세포에서만 전달될 것으로 예상된다. 최종 효과는 유전자 드라이브가 전달되고 유전자좌의 발현 프로파일에 따라 추가의 제어층을 도입하는 조직 유형으로 제한된다.
다중 비천연 tracrRNA는 이중성 유전자(doublesex gene)에 대해 설계될 수 있고 유전자-드라이브 유전자좌에 암호화되어 전달 빈도를 개선하고 표적 부위에서 파괴적 인델의 형성으로 인한 드라이브 실패 빈도를 감소시킬 수 있다.
tracrRNA는
관심 RNA에 의해
Cas9
활성을 지시하도록
재프로그래밍될
수
있다
세포 RNA의 ncrRNA로의 전환은 crRNA의 자연적 생물발생과 유사한 tracrRNA 항-반복에 대한 광범위한 상보성을 보유하는 서열을 기반으로 하였다. tracrRNA 항-반복 서열이 Cas9 인식을 위한 적절한 구조를 유지하면서 다른 RNA와 혼성화하도록 변경될 수 있는 경우, 생성된 비천연 tracrRNA는 임의의 발현된 세포 RNA의 ncrRNA로의 전환을 유도할 수 있으며, 이것이 Cas9를 일치하는 DNA 표적으로 안내할 수 있다(도 17a).
당연히, CjeCas9는 crRNA 반복체와 tracrRNA 항-반복 사이에 형성된 완전한 RNA 이중체를 인식한다. crRNA 반복체의 돌연변이 분석에 기반하여, 본 발명자들은 crRNA 반복:tracrRNA 항-반복 이중체가 여러 돌연변이를 수용할 수 있음을 이미 관찰하였다. 따라서, 본 발명자들은 2차 구조를 유지하면서 fliF sgRNA에서 이중체의 양쪽을 돌연변이시킨 후 TXTL에서 GFP 침묵을 평가하였다(s26-s31, 도 17b). GFP 침묵은 전체 이중체의 서열을 교체하는 경우에도 유지되었다(s31, 도 17b). 다음으로, 본 발명자들은 tracrRNA 항-반복체를 재프로그래밍하여 TXTL에서 그다지 크지 않은 GFP 침묵을 나타내는 3개의 추정 ncrRNA(fliF, CJ8421_04280, CJ8421_04970로부터 유래됨)로 완전한 25bp 이중체를 형성하였다. 세 가지 경우 모두에서, GFP 억제는 WT tracrRNA보다 비천연 tracrRNA에서 유의하게 향상되었지만(p = 1×10-6 - 0.0011), 억제가 정규 crRNA:tracrRNA 쌍만큼 강하지는 않았다(도 17c). 마지막으로, 본 발명자들은 tracrRNA 항-반복체를 재프로그래밍하여 mRNA의 완전히 새로운 영역과 염기쌍을 형성하였다(도 17d). CJ8421_04970 CDS를 암호화하는 mRNA로 시작하여, 본 발명자들은 mRNA의 다른 위치(n1-n5)에 혼성화하는 5개의 다른 CjeCas9 비천연 tracrRNA를 설계하였다(도 17d). 이러한 비천연 tracrRNA 중 4개는 비표적화 crRNA 대조군과 비교하여 유의하게 감소된 GFP 수준을 산출하였다(p = 6×10-7 - 0.002). 중요하게는, 예측된 시드 영역을 돌연변이시키거나, tracrRNA 항 반복체를 스크램블하거나, CjeCas9를 FnCas12a로 대체하면 GFP 발현이 회복되었다(도 17d). 따라서 비천연 tracrRNA를 사용하여 관심 RNA로 CjeCas9에 의한 DNA 표적화를 지시할 수 있다.
CjeCas9 비천연 tracrRNA의 기능을 감안할 때, 본 발명자들은 다른 Cas9 상동체에 대한 tracrRNA가 유사하게 재프로그래밍될 수 있는지 여부를 질문하였다. 본 발명자들은 잘 특성화된 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes ) Cas9(SpyCas9) 및 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus ) CRISPR1 Cas9(Sth1Cas9)를 예로서 선택하였다. 두 경우 모두에서, 본 발명자들은 crRNA:tracrRNA 이중체의 알려진 2차 구조 및 AT-풍부 서열을 갖는 이중 가닥 RNA를 절단하기 위한 RNase III의 선호에 기초하여 비천연 tracrRNA에 대한 설계 규칙을 고안하였다. 10개의 시험된 비천연 tracrRNA 모두 비표적화 crRNA 대조군과 비교하여 GFP 수준을 유의하게 감소시켰다(p = 1Х10-7 - 1Х10-4). 이전과 같이, ncrRNA 가이드에서 시드 서열을 파괴하거나, tracrRNA 항-반복체를 스크램블하거나, Cas9 중 어느 하나를 FnCas12a로 교체함으로써 GFP 발현이 회복되었다. 많은 경우에, GFP 침묵의 정도는 표적화 crRNA 대조군의 정도에 접근하였다(도 17d). 본 발명자들은 또한 3개의 Cas9 이종상동체 모두에 대해 대장균에서 비-천연 tracrRNA로 표적화된 플라스미드 제거를 평가하여, 각각이 적어도 하나의 시험된 비-천연 tracrRNA에 대해 효율적인 플라스미드 제거를 이끌어낼 수 있음을 발견하였다(도 S8bB). 전반적으로, 상이한 Cas9 이종상동체에 대한 tracrRNA는 비천연 tracrRNA로 전환되어 선택된 세포 RNA의 존재를 기반으로 하는 DNA 표적화를 유도할 수 있다.
재프로그래밍된
tracrRNA는
Cas9에
의한 서열-특이적 다중 RNA 검출을 가능하게 한다
DNA 표적화를 관심 RNA에 연결함으로써, 비천연 tracrRNA는 RNA 검출을 위한 고유한 기회와 CRISPR 진단을 위한 다른 패러다임을 제공한다. 현재 CRISPR 진단은 샘플에서 이중-가닥 DNA 또는 RNA 표적을 검색하는 Cas12a 또는 Cas13에 의존하며, 여기서 표적 인식이 형광 리포터의 비특이적 단일-가닥 DNA 또는 RNA 절단을 유도한다. 비특이적 판독은 하나의 검사를 하나의 표적 서열로 효과적으로 제한한다. 대조적으로, 비천연 tracrRNA는 감지된 RNA를 ncrRNA로 전환하고, ncrRNA는 Cas9가 일치하는 DNA에 결합하거나 절단하도록 지시한다. DNA 서열의 Cas9 결합 또는 절단은 관련 RNA가 샘플에 존재하는지 여부를 나타낸다. 각 DNA 표적의 서열이 고유하기 때문에, 많은 수의 표적 서열을 하나의 검사로 동시에 모니터링할 수 있다. 본 발명자들은 생성된 진단 플랫폼을 LEOPARD(Leveraging Engineering tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection)로 지정한다(도 18a).
LEOPARD 평가를 시작하기 위해, 본 발명자들은 T7-전사된 RNA, 상업적으로 이용 가능한 Cas9 단백질, 및 선형 DNA 표적을 사용하여 간소화된 시험관내 반응을 수행하였다. 본 발명자들은 CJ8421_04970 내의 합성 ncrRNA 유전자좌 중 하나에 상응하는 RNA로 시작하여(도 17d), 겔 전기영동을 사용하여 절단 및 비절단 DNA 표적을 크기별로 분해하였다. 이들은 비천연 tracrRNA를 T7-전사된 ncrRNA에 혼성화하기 위한 어닐링 단계를 도입하면 ncrRNA 서열이 양쪽 말단에서 확장된 경우에도 DNA 표적 절단이 생성된다는 것을 발견하였다. 이들은 또한, 어닐링 단계로, RNase III 또는 RNase A를 추가하는 것이 필요가 없으며 심지어 명백한 DNA 절단을 부분적으로 방해한다는 것을 알아내었다. 효율적인 절단은 효모 총 RNA의 100배 과량에서도 발생할 수 있지만, ncrRNA가 존재할 때만 가능하다(도 4b). 따라서 LEOPARD는 DNA 표적의 절단에 기반하여 특정 관심 RNA의 존재를 보고한다.
LEOPARD의 완전한 다중화 가능성을 실현하려면 많은 DNA 표적을 한 번에 모니터링해야 한다. 따라서 본 발명자들은 겔 전기영동에 의해 풀링된 DNA 표적으로부터 별개의 절단 생성물을 분해하는 것에 기초한 판독 계획을 고안하였다(도 18c). 각 표적은 한쪽 말단에 형광단으로 표지되어, 두 개의 가시화 가능한 생성물-절단 및 비절단-만을 생성한다. 그후 이들은 이러한 계획을 적용하여 SARS-CoV-2 코로나바이러스(COVID-19의 원인 인자)에서 2개, 다른 코로나바이러스에서 6개, 인플루엔자 H1N1에서 1개를 포함하여 호흡기 바이러스와 관련된 9개의 ~150-nt RNA 단편을 특이적으로 검출한다(도 18 b, d). 본 발명자들은 각각의 DNA 표적이 상응하는 RNA의 존재하에서만 Cas9에 의해 절단된다는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 계획은 동일한 반응에서 3개 또는 5개의 RNA 단편을 특이적으로 검출할 수 있게 하여, 다중 검출을 위한 LEOPARD의 능력을 입증하였다. 마지막으로, 바이러스 RNA 서열은 상동성을 최소화하기 위해 선택되었기 때문에, LEOPARD가 단일-뉴클레오티드 차이도 검출할 수 있는지 질문하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Helmholtz-Zentrum f? Infektionsforschung GmbH
Julius-Maximilians-Universit? W?zburg
<120> RNA detection and transcription-dependent editing with
reprogrammed tracrRNAs
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ccgagagcat cgatcctagc atggatgcat ttgacagcta gctcagtcct a 51
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gatcctacag tatcccagtg tcgaggtatt atccggatat agttcctcct tt 52
<210> 5
<211> 224
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagctataa attagaaagt gaaaataaag 60
ttttagtccc tttttaaatt tctttatggt aaaatctgct aacaaagccc gaaaggaagc 120
tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg 180
ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggat 224
<210> 6
<211> 274
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccaagt tcttctgctg caattgtagc 60
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tttttaaatt tctttatggt aaaatctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct 180
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ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggat 274
<210> 7
<211> 374
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcattat agttgtggtt gggtttttgg 60
tttttttagc tttatttcgt ggaagtggta gtaatgcaaa taatggatat gcagttttag 120
ttgaaaatgt aagcccaagt tcttctgctg caattgtagc taaacttgaa caaaataata 180
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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gugccggugu cguugucggc auggguuuua gucccugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcu 98
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<211> 99
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucuaggaaa cuagacuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<211> 99
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua aguccugaaa aggacuuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<211> 99
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuccg gucccugaaa agggaccgga auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<211> 99
<212> RNA
<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaagcguua gucccugaaa agggacuaac guaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua guccugaaaa gggacuaaaa uaaagaguuu 60
gcgggacucu gcgggguuac aauccccuaa aaccgcuu 98
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua ucccugaaaa gggacuaaaa uaaagaguuu 60
gcgggacucu gcgggguuac aauccccuaa aaccgcuu 98
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuag ucccugaaaa gggacuaaaa uaaagaguuu 60
gcgggacucu gcgggguuac aauccccuaa aaccgcuu 98
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucugaaaag ggacuaaaau aaagaguuug 60
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuuu cccugaaaag ggacuaaaau aaagaguuug 60
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuagu cccugaaaag ggacuaaaau aaagaguuug 60
cgggacucug cgggguuaca auccccuaaa accgcuu 97
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua guccaacuga aaagggacua aaauaaagag 60
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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uuugcgggac ucugcggggu uacaaucccc uaaaaccgcu u 101
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua guaacugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaagaauua gucccugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucucugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua guuccugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
ugcgggacuc ugcgggguua caauccccua aaaccgcuu 99
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<213> Homo sapiens
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uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua guuucugaaa agggacuaaa auaaagaguu 60
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<213> Homo sapiens
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gugccggugu cguugucggc auggguuuua gucccuuuuu aaauuucuuu augguaaaau 60
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<213> Homo sapiens
<400> 47
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuuuu aaauuucuuu augguaaaau 60
aucgucaaag aauguuuauu gcaagcgaag gucuuauaaa agauagucgc guggguuuug 120
aagcuuuuga uacucaagcu uuuggagcua caaaugaaga gcaaaaggua aaauaccaaa 180
gagccauaga aggcgaacuu gcaagaacua uugagacuuu agaaccuauu cguagcgcug 240
uuguacacau agcauuuccu aaagauagug uuuuuaccga aaggcaaauu ccgccuacag 300
cuucaguugu uguuaauguu cgcgaaggcu uaaagcuuac uagaaaacaa auugauggua 360
<210> 48
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
uugacagcua gcucaguccu agguauaaug cuagcuauaa auuagaaagu gaaaauaaag 60
uuuuaguccc uuuuuaauuu ucuuuauggu aaaauaucgu caaagaaugu uuauugcaag 120
cgaaggucuu auaaaagaua gucgcguggg uuuugaagcu uuugauacuc aagcuuuugg 180
agcuacaaau gaagagcaaa agguaaaaua ccaaagagcc auagaaggcg aacuugcaag 240
aacuauugag acuuuagaac cuauucguag cgcuguugua cacauagcau uuccuaaaga 300
uaguguuuuu accgaaaggc aaauuccgcc uacagcuuca guuguuguua auguucgcga 360
aggcuuaaag cuuacuagaa aacaaauuga uggua 395
<210> 49
<211> 360
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuugu agcuuuuuuu augguaaaau 60
aucgucaaag aauguuuauu gcaagcgaag gucuuauaaa agauagucgc guggguuuug 120
aagcuuuuga uacucaagcu uuuggagcua caaaugaaga gcaaaaggua aaauaccaaa 180
gagccauaga aggcgaacuu gcaagaacua uugagacuuu agaaccuauu cguagcgcug 240
uuguacacau agcauuuccu aaagauagug uuuuuaccga aaggcaaauu ccgccuacag 300
cuucaguugu uguuaauguu cgcgaaggcu uaaagcuuac uagaaaacaa auugauggua 360
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<211> 360
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuugc cgccuuuucu augguaaaau 60
aucgucaaag aauguuuauu gcaagcgaag gucuuauaaa agauagucgc guggguuuug 120
aagcuuuuga uacucaagcu uuuggagcua caaaugaaga gcaaaaggua aaauaccaaa 180
gagccauaga aggcgaacuu gcaagaacua uugagacuuu agaaccuauu cguagcgcug 240
uuguacacau agcauuuccu aaagauagug uuuuuaccga aaggcaaauu ccgccuacag 300
cuucaguugu uguuaauguu cgcgaaggcu uaaagcuuac uagaaaacaa auugauggua 360
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuuaa auuucuuuau gguaaaauau 60
cgucaaagaa uguuuauugc aagcgaaggu cuuauaaaag auagucgcgu ggguuuugaa 120
gcuuuugaua cucaagcuuu uggagcuaca aaugaagagc aaaagguaaa auaccaaaga 180
gccauagaag gcgaacuugc aagaacuauu gagacuuuag aaccuauucg uagcgcuguu 240
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<211> 362
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuccu uuaaauuucu uuaugguaaa 60
auaucgucaa agaauguuua uugcaagcga aggucuuaua aaagauaguc gcguggguuu 120
ugaagcuuuu gauacucaag cuuuuggagc uacaaaugaa gagcaaaagg uaaaauacca 180
aagagccaua gaaggcgaac uugcaagaac uauugagacu uuagaaccua uucguagcgc 240
uguuguacac auagcauuuc cuaaagauag uguuuuuacc gaaaggcaaa uuccgccuac 300
agcuucaguu guuguuaaug uucgcgaagg cuuaaagcuu acuagaaaac aaauugaugg 360
ua 362
<210> 53
<211> 358
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucuuuuuaa auuucuuuau gguaaaauau 60
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guacacauag cauuuccuaa agauaguguu uuuaccgaaa ggcaaauucc gccuacagcu 300
ucaguuguug uuaauguucg cgaaggcuua aagcuuacua gaaaacaaau ugauggua 358
<210> 54
<211> 362
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccaauuu uuaaauuucu uuaugguaaa 60
auaucgucaa agaauguuua uugcaagcga aggucuuaua aaagauaguc gcguggguuu 120
ugaagcuuuu gauacucaag cuuuuggagc uacaaaugaa gagcaaaagg uaaaauacca 180
aagagccaua gaaggcgaac uugcaagaac uauugagacu uuagaaccua uucguagcgc 240
uguuguacac auagcauuuc cuaaagauag uguuuuuacc gaaaggcaaa uuccgccuac 300
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ua 362
<210> 55
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuuuu aaauuucuuu augguaaaau 60
<210> 56
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
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<211> 210
<212> RNA
<213> Homo sapiens
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
auggauuuag aaaauauccu agaaaauaau caaagcauag guuuauacca cccaaagaac 60
gaacacgaug ccugugguau cgcugcaguu gcuaauauac gcgguauugc uucuuauaag 120
guuauuugug augcuuuaga aauuuugaug aaucuugaac accgaggugg ugcaggagcu 180
gaagaaaauu caggugaugg ggcggggauu uuaauccaaa uuccacauga uuuuuuuaaa 240
acucaagaau uggguuuuga acuuccuaaa aagggugauu augcuguagc acagauguuu 300
uuaucaccca auacugaugc aaaagaagaa gcaaaagaaa uauuuuuaca agguuuaaag 360
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agagcuauua augugccaaa auuuuauuuu ucaaguuuuu cuucacgcac cauaguuuau 600
aaaggaaugc uucuuucaac ucaauugagc gauuuuuauc uugauuuuaa agaugucaau 660
augaaaucag ccaucgcuuu ggugcauucu cgcuuuucga cuaauaccuu cccaaguugg 720
gaaagagccc auccaaaccg uuauauggug cauaauggag agauuaauac cauacgcgga 780
aauguugaua gcauaagagc uagagaaggc uugaugcaaa gugaguauuu ugaaaauuua 840
gaugaaauuu auuauaguug ugguuggguu uuugguuuuu uuagcuuuau uucguggaag 900
ugguaguaau gcaaauaaug gauaugcagu uuuaguugaa aauguaagcc caaguucuuc 960
ugcugcaauu guagcuaaac uugaacaaaa uaauauuccc uauaaauuag aaagugaaaa 1020
uaaaguuuua gucccuuuuu aaauuucuuu augguaaaau 1060
<210> 59
<211> 210
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuuuu aaauuucuuu augguaaaau 60
aucgucaaag aauguuuauu gcaagcgaag gucuuauaaa agauagucgc guggguuuug 120
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<211> 360
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
uauaaauuag aaagugaaaa uaaaguuuua gucccuuuuu aaauuucuuu augguaaaau 60
aucgucaaag aauguuuauu gcaagcgaag gucuuauaaa agauagucgc guggguuuug 120
aagcuuuuga uacucaagcu uuuggagcua caaaugaaga gcaaaaggua aaauaccaaa 180
gagccauaga aggcgaacuu gcaagaacua uugagacuuu agaaccuauu cguagcgcug 240
uuguacacau agcauuuccu aaagauagug uuuuuaccga aaggcaaauu ccgccuacag 300
cuucaguugu uguuaauguu cgcgaaggcu uaaagcuuac uagaaaacaa auugauggua 360
<210> 61
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
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aaauucuuua gaaacauuug guaaauuauc agcagaaauu auuauaucag cauuuaaaga 180
uaaacuuaaa auaguaauaa uauuuaaaaa uuuaauuuuc aauauuuuuc cuaaauuauu 240
uuuuaguaaa auuguaaaga auuuauguga auuuuaugug aauuuuaaga caauauuaua 300
aaaaauaaag guuuuauauu uugcuuacaa uuuuuuuaau uuuuuuaaau auuuuauguu 360
auuuuuugau uucuuaugau uauuacaaua uccuugguuu gaauauuuua uuuuuuaaug 420
gagcuuauug gcagcuuuua aguucaaugu uuuuacaugg aaauuuaacu caucuuauau 480
uaaauaugau aguuuuguuu caauuugggc guauguuaga aacuuauuug ggugcuuugu 540
guuuuauuuu uauuuauuuu auuggcggau uguugugcuc acuuuuaagu guuuuuuaug 600
uguauuuuga uuuuaaauau uuuggagaaa auauaaaugu cauaggcgcu aguggugcaa 660
uuuguguuuu aaugggcuuu uaugcuguua uugauaaaaa uagcacaaaa ggacuuauag 720
uggcaauuuu acuuaugagu uuugugccau ugcuuauggg gauaaauguu gcuugguaug 780
gucauauuuu cggguuuaug ugugguuaua uuuuagcuaa aauaaaagag guaaaaugaa 840
aaaaauuuau auuauaagac augcaaaagc aaguaagagu gaagacaucg augauuuuga 900
aagaaagcuu acuaagagug gaaaggaaga uuuaaaaaaa cuuuuuaaaa aucuugcuuc 960
gcaugaaauu cauccugauu uggugcuauc aaguccugcu guuagaaccg cuaaaacagc 1020
gaaaaaaaua gccaaauuuu auaauuuuga uaaaaauaga auuuguuuug augaaagauu 1080
guaucuuugc aauguugaaa auuugcuaaa aauucugcaa gauauugaug augaguuuaa 1140
ugaaguauuu uuaguggguc auaauccuag uuuaauggag cuuggagag 1189
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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uaaauaugau aguuuuguuu caauuugggc guauguuaga aacuuauuug ggugcuuugu 540
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aa 122
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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a 121
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 120
guccaagaaa aaagaaauga uacgaggcau uagcacgaaa uuauuauauc agcauuuaa 59
<210> 121
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<213> Homo sapiens
<400> 121
guucugucuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60
cuauugcugg acgaugucuc uuuuauuucu uuuuucuugg aucu 104
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
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guccaagaaa aaagaaauga aagaggcauu agcacgaaau uauuauauca gcauuuaa 58
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
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uccaagaaaa aagaaauga 19
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 124
uuauuucuuu uuucuugga 19
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 125
cuguacuauc gauuucagu 19
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<211> 19
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<213> Homo sapiens
<400> 126
acugaaaucg auaguacag 19
<210> 127
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 127
acguuaaugc uuaagcua 19
<210> 128
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 128
uagcuuaagc auuaacguc 19
Claims (19)
- 천연 crRNA:tracrRNA 이중체(duplex)를 모방하는 복합체(complex)를 형성함을 통해 미리 선택된 감지된 RNA 서열(preselected sensed RNA sequence)에 특이적으로 혼성화하도록 설계된 항-반복 영역 서열(anti-repeat region sequence)을 포함하는 부분을 포함하는, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자.
- 제1항에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자, 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소, 및 적어도 하나의 감지된 RNA를 포함하는 복합체.
- 제2항에 있어서, 적어도 하나의 감지된 RNA 서열을 기반으로 한 또는 기반으로 하여 설계된 서열을 포함하는 표적 DNA 핵산 분자에 추가로 결합되는, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자.
- 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은, 적어도 하나의 RNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있는 단계;
b) 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 대한 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 결합을 검출하는 단계를 포함하고;
c) 여기서 결합이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하며,
여기서 바람직하게는 상기 뉴클레아제가 이의 절단 및/또는 닉킹(nicking) 활성이 불활성화되는 방법. - 세포 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은, 적어도 하나의 RNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있는 단계;
b) 상기 뉴클레아제 효소에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단을 검출하는 단계를 포함하고;
c) 여기서 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 절단을 검출하는 것이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법. - 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 결합된 및/또는 절단된 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 것이 염료, 형광단 또는 전기 전도도와 같은 적합한 표지(label)의 신호의 변화를 검출하고/하거나 상기 절단된 적어도 하나의 표적 핵산 단편 자체를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 상기 샘플을 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 핵산과 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은, 적어도 하나의 RNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있는 단계; 및
b) 상기 뉴클레아제에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 닉킹 또는 절단하는 단계,
c) 예를 들면, 비상동 말단 접합(non-homologuous end joining; NHEJ) 수선(repair), 미세상동-매개 말단 접합(microhomology-mediated end joining; MMEJ), 상동-지향 수선(homologuous-directed repair; HDR), 염기 편집, 프라임 편집(prime editing) 또는 RNA 편집을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 검출가능하게 편집하는 단계, 및
d) 예를 들면, 인델(indel) 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이 검출, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제, 및/또는 상기 프라임 또는 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 적절하게 검출하는 단계를 포함하고;
e) 여기서 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 상기 편집을 검출하는 것이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA를 검출하는 방법. - 세포, 조직 및/또는 샘플에서 적어도 하나의 표적 DNA의 전사를 기록하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 상기 샘플, 세포 또는 조직을 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 포함하는 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 감지된 RNA의 제2 부분은 적어도 하나의 표적 DNA와 특이적으로 혼성화하고; 여기서 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA는 RNase III과 같은, 적어도 하나의 RNA-절단 효소의 존재를 임의로 추가로 포함하는 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소의 존재하에 상기 감지된 RNA와 혼성화되거나 혼성화될 수 있는 단계; 및
b) 상기 뉴클레아제에 의해 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산을 닉킹 또는 절단하는 단계,
c) 예를 들면, 비상동 말단 접합(NHEJ) 수선, 미세상동-매개 말단 접합(MMEJ), 상동-지향 수선(HDR), 검출 가능한 마커, 검출 가능한 변형, 염기 편집, 프라임 편집 또는 RNA 편집을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 DNA를 검출가능하게 편집하는 단계, 및
d) 임의로, 예를 들면, 인델 또는 유전자 편집의 존재 및/또는 길이 검출, 상기 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 암호화된 바와 같은 유전자 또는 다른 유전 요소의 활성화/억제, 및/또는 상기 프라임 또는 염기 편집의 검출로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하여 상기 적어도 하나의 표적 DNA의 상기 편집을 적절하게 검출하는 단계를 포함하고;
e) 여기서 상기 적어도 하나의 표적 DNA의 상기 편집을 검출하는 것이 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에서 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 전사를 기록하는 방법. - 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 여러 개 또는 다수의 감지된 RNA가 하나 이상의 샘플, 조직 및/또는 세포에서 검출되는 방법.
- 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 환경, 종(species), 균주, 질병, 세포 및/또는 조직 특이적이거나 바이러스 감염, 예를 들어 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스로부터 선택된 상태와 관련되는 방법.
- 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 단계 a) 전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가되고/되거나 단계 a) 전에 DNA를 감지된 RNA로 전사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소가 유형 II Cas9 및 유형 V Cas12 뉴클레아제 효소, 예를 들어 II-A, -B 및 -C로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유형 II Cas9 뉴클레아제, 및 유형 V-B, -C, -D, -E, -F, -G, 및 -K로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유형 Cas12 뉴클레아제로부터 선택되는, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 적어도 하나의 비-자연 발생 tracrRNA의 상기 부분이 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 11개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 12개 이상의 뉴클레오티드와 혼성화하고, 여기서 바람직하게는 상기 감지된 RNA의 상기 제1 부분이 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif; PAM)를 포함하는, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감지된 RNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 상기 tracrRNA의 상기 적어도 하나의 부분의 뉴클레오티드 서열이 상기 감지된 RNA에 대한 상기 제1 부분에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100% 상보적이 되도록 하기 위해 생산 및/또는 변형되는, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각이 상기 감지된 RNA의 상이한 부분과 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 비-자연 발생 tracrRNA가 생성되고 사용되는, 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 방법.
- 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 mRNA의 양, 바람직하게는 샘플, 조직 및/또는 세포당 양을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 바람직하게는 대조군과 비교할 때 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 상기 적어도 하나의 표적 핵산 및/또는 상기 적어도 하나의 감지된 mRNA의 양의 변화를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 포유동물에서 의학적 상태(medical condition)를 검출하는 방법으로서, 여기서 상기 상태가 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)와 관련되고, 상기 방법이 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 검출된 바와 같은 상기 적어도 하나의 감지된 RNA의 존재, 발현 및/또는 돌연변이(들)에 기반하여 상기 의학적 상태를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 바람직하게는 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 환경, 종, 균주, 질병, 세포 및/또는 조직 특이적이거나 바이러스 감염, 예를 들어 코로나바이러스 감염, 병원체에 의한 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물, 및 생물적 또는 비생물적 스트레스로부터 선택된 상태와 관련되며, 여기서 임의로 상기 적어도 하나의 감지된 RNA가 단계 a) 전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가되고/되거나 단계 a) 전에 DNA를 감지된 RNA로 전사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- a) 상기 감지된 RNA의 적어도 한 부분에 결합하도록 설계된 비-자연 발생 tracrRNA로서, 여기서 상기 감지된 RNA는 표적 DNA의 제1 부분과 특이적으로 혼성화하는 부분을 추가로 포함하는 비-자연 발생 tracrRNA, 및 b) 적어도 하나의 tracrRNA-의존성 CRISPR 뉴클레아제 효소를 포함하고, 바람직하게는 c) 상기 표적 핵산의 절단을 검출하기 위한 표지를 포함하는 적어도 하나의 표적 핵산 분자를 추가로 포함하고, 임의로 d) RNase III 효소와 같은 적어도 하나의 RNA 절단 효소를 추가로 포함하는, 감지된 RNA 검출 시스템.
- 제4항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한, 특히 감지된 RNA, 바이러스 감지된 RNA, 질병 마커(disease marker)로부터 전사된 감지된 RNA를 검출하기 위한, 또는 하나 이상의 감지된 RNA에 대한 발현 프로파일(expression profile)을 생성하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 비-자연 발생 tracrRNA 핵산 분자 또는 제18항에 따른 감지된 RNA 검출 시스템의 용도.
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