JP2003511660A - 電気化学ルミネセンスヘリカーゼアッセイ - Google Patents

電気化学ルミネセンスヘリカーゼアッセイ

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Abstract

(57)【要約】 本発明はヘリカーゼ活性を検出するための電気化学ルミネセンスアッセイに関する。本発明は迅速かつ高感度であり、ヘリカーゼインヒビターの高いスループットでのスクリーニングに適当なヘリカーゼアッセイを提供する。ヘリカーゼインヒビターは疾患の処置に有用な一群の薬理学的物質を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明はヘリカーゼ活性の検出のために電気化学ルミネセンスを使用するアッ
セイに関する。したがって、本発明は迅速な、高感度の、一般にヘリカーゼ活性
の高いスループットでのスクリーニングに適当なアッセイ、とくにヘリカーゼイ
ンヒビターとしての可能性を有するかどうかのヘリカーゼアッセイを提供する。
ヘリカーゼインヒビターは疾患の処置に有用な一群の薬理学的物質を提供する。
【０００２】
【背景技術】ＤＮＡヘリカーゼ ＤＮＡヘリカーゼは、核酸代謝のすべての態様に関与する酵素である（Lohman
& Bjornson, Annu.Rev.Biochem. 1996, 65: 169-214; Matson, SW, Progress i
n Nuclear Acid Research and Molecular Biology, 1991, 40: 289-326）。イン
ビボにおける大部分のＤＮＡの最も安定な型は二重鎖ＤＮＡヘリックスＤＮＡで
ある。一本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡの複製、再修復、再組換えおよび接合を要求する
。二重鎖から一本鎖ＤＮＡを形成させるためには、ＤＮＡ二重鎖を少なくとも部
分的に解いて分離しなければならない。安定な二重鎖ＤＮＡの解離は、ヌクレオ
シド５′−トリホスフェート（ＮＴＰ）の加水分解に由来するエネルギーを使用
してＤＮＡヘリカーゼによって触媒される。ヘリカーゼ酵素はＤＮＡとともに移
動し、二重鎖を５００〜１０００bp／秒もの速度で解離（非ハイブリダイズ）す
る。
【０００３】 ＤＮＡヘリカーゼは、様々な原核細胞、真核細胞、バクテリオファージおよび
ウイルス中に同定されてきた。大部分の生物体は多重のヘリカーゼをコードする
。たとえば大腸菌は、少なくとも 12 の異なるヘリカーゼをコードし（Matsonら
, BioEssays, 1994, 16: 13-22）、S.cerevisiae（ビール酵母）は少なくとも６
種類のヘリカーゼ型をコードする（Liら, Chromosoma, 1992, 102: S93-S99）。
これらのＤＮＡヘリカーゼはＤＮＡの代謝において多くの様々な機能を果たすが
、現在では、ヘリカーゼ活性はＤＮＡ二重鎖の解離による機能であることが明ら
かにされている。細胞の代謝に必須のヘリカーゼの機能により、これらの酵素は
治療剤の開発のための重要な標的を提供する。
【０００４】ヘリカーゼアッセイ ヘリカーゼによる二重鎖核酸の解離を測定するために、数種のアッセイが開発
されている。このようなアッセイの一つは、一本鎖特異的ヌクレアーゼたとえば
Ｓ１またはエキソヌクレアーゼＩに対する標識二重鎖ＤＮＡの感受性を、解離時
の ssＤＮＡの産生によって測定するものである（Palasら, J.Biol.Chem. 1990,
265: 3447）。タンパク質たとえば recＢＣＤ酵素、rep タンパク質、大腸菌ヘ
リカーゼＩおよびIIならびにＳＶ40Ｔ抗原によるＤＮＡ解離の領域を直接可視化
するために電子顕微鏡も用いられてきた（Runyonら, Proc.Natl.Acad.Sci. 1990
, 87: 6383）。
【０００５】 インビトロにおいてヘリカーゼ活性を定量する最も一般的なアッセイでは電気
泳動を使用する（Venkatesanetら, J.Biol.Chem. 1982, 257: 12426; Matsonら,
J.Biol.Chem. 1983, 258: 14017）。ヘリカーゼ酵素は二重鎖ＤＮＡをほどいて
一本鎖ＤＮＡを生成する。この反応の生成物は、ポリアクリルアミドまたはアガ
ロースゲル上で分割される。ＤＮＡ内の放射標識は結果の直接的な可視化および
定量を可能にする。
【０００６】 recＢＣＤ酵素ヘリカーゼ活性を検討するために開発された連続的な分光分析
アッセイでは、レポーター分子（Romanら, Biochemistry 1989, 28: 2863）とし
て ssＤＮＡ結合タンパク質、大腸菌ＳＳＢタンパク質（一本鎖ＤＮＡ結合タン
パク質）、またはファージＴ４遺伝子３２タンパク質のいずれかが使用される。
dsＤＮＡは解けているので、ＳＳＢタンパク質は形成された ssＤＮＡに結合し
、その固有の蛍光の消光を生じる。他のヘリカーゼアッセイは米国特許4,568,64
9、5,705,344 および 5,747,247 に記載されている。
【０００７】 これらのアッセイはそれぞれ、感度、アッセイの実施に要求される工程の数お
よび／または試験できるサンプル数の限定に関して、ある種の限界がある。この
ような方法は、自明のように、高い感度、高いスループットの薬物スクリーニン
グフォーマットへの適用が容易ではない。したがって、本技術分野には簡単で、
しかも高いスループットで実施できる感度の高いヘリカーゼアッセイが要求され
る。本発明は、これらの障害を克服し、迅速で、高感度の、ヘリカーゼインヒビ
ターの可能性について、スループットの高いスクリーニングに適したヘリカーゼ
アッセイを提供することにある。
【０００８】電気化学ルミネセンスアッセイ 電気化学ルミネセンスアッセイは、低電圧を電極に適用した場合に発生する光
であり、それによってトリス−（ビピリジン）のキレートにおけるルテニウムの
環状酸化および還元反応を誘発する。この技術は微生物学的、生化学的および化
学的アナライトの検出の広い適用可能性をもっている（Brunoら, 1997, Rec. Re
s. Devel. In Micro. 1: 25）。
【０００９】 ＤＮＡに対する電気化学ルミネセンス標識が開発され（Kentenら, 1991, Clin
. Chem. 37: 1626; Kentenら, 1992, Clin.Chem. 38: 873; IGEN Inc. から入手
可能な Origen（登録商標）標識、Origen（登録商標）ならびにＴＡＧホスホロ
アミダイト）、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出に用いられている（Schutzbank
ら, 1995, J.Clin.Microbiol. 33: 2023）。これらのアッセイは増幅されたＰＣ
Ｒ産物の検出に迅速かつ有効であることが示されている。 本明細書における参考文献の引用はすべて本出願に対する「従来技術」として
利用できることの許可と解釈すべきではない。
【００１０】
【発明の開示】
本発明は、迅速な、高感度の、ヘリカーゼインヒビターの可能性について高い
スループットでのスクリーニングに適当なアッセイを提供する。ヘリカーゼイン
ヒビターは疾患の処置に有用な一群の薬理学的物質を提供する。
【００１１】 したがって第一の実施態様においては、本発明は (ａ) サンプルを、電気化学ルミネセンス標識からなり、相補性の第二の核酸
または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子と混合し、 (ｂ) サンプルと工程（ａ）からのハイブリダイズした核酸または核酸分子と
サンプル中に存在するヘリカーゼが第一および第二の核酸または核酸分子を解離
する条件下にインキュベートし、 (ｃ) 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで (ｄ) 捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測
定すること からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を検出する電気化学ルミネセンスアッセイ
法を提供する。 ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである。好ましくはヘリ
カーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼである。
【００１２】 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲するためには任意の方法が採用さ
れる。好ましい一連の工程においては、上記工程（ｂ）と（ｃ）の間に、解離さ
れた第一の核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補性であり捕
獲リガンドからなる第三の核酸または核酸分子と第一および第三の核酸または核
酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートする。ついで、ハイブリ
ダイズした第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲
受容体によって捕獲する。捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にあってもよい。好
ましい実施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビ
ジンである。好ましい電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである。
【００１３】 他の実施態様においては、本発明は、 (ａ) サンプルを、ヘリカーゼおよび電気化学ルミネセンス標識からなり相補
性の第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子
と混合して混合物を形成させ、 (ｂ) 工程（ａ）からの混合物を、ヘリカーゼがサンプルの不存在下に第一お
よび第二の核酸または核酸分子を解離できる条件下にインキュベートし、 (ｃ) 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで (ｄ) 捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測
定すること からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を修飾する物質を検出する方法を提供する
。 好ましい実施態様においては、物質はヘリカーゼ活性のインヒビターである。
ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである。好ましくは、ヘリ
カーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼである。
【００１４】 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲するためには任意の方法が採用さ
れる。好ましい一連の工程においては、上記工程（ｂ）と（ｃ）の間に、解離さ
れた核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補性であり捕獲リガ
ンドからなる第三の核酸または核酸分子と第一および第三の核酸または核酸分子
がハイブリダイズできる条件下にインキュベートする。ついでハイブリダイズし
た第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体に
よって捕獲する。捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にあってもよい。好ましい実
施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンであ
る。好ましい電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである。
【００１５】 さらに他の実施態様においては、本発明はヘリカーゼ活性の電気化学ルミネセ
ンス検出のためのキットを提供する。このようなキットは、 (ａ) 電気化学ルミネセンス標識からなる第一の核酸または核酸分子、 (ｂ) 第一の核酸または核酸分子に相補性な第二の核酸または核酸分子および (ｃ) 電気化学ルミネセンス検出を促進するのに適当なヘリカーゼおよび／ま
たは磁性ビーズからなる。
【００１６】 一態様においては、第一の核酸または核酸分子は既に第二の核酸または核酸分
子とハイブリダイズしている。本発明によるキットはさらに、第一の核酸または
核酸分子と相補性であり捕獲リガンドからなる第三の核酸または核酸分子からな
る。このような環境下には、キットは一般に捕獲リガンドを結合できる捕獲受容
体を包含する。好ましい実施態様においては、捕獲受容体は磁性ビーズの表面上
にあってもよい。好ましい実施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり
、捕獲受容体はアビジンである。
【００１７】 ［図面の簡単な説明］ 図１：大腸菌ＤnaＢヘリカーゼ活性の放射分析法による定量。 ６０bpオリゴヌクレオチドを３′末端において32Ｐで標識した。ついで相補性
の６０bpオリゴヌクレオチドを標識ヌクレオチドとハイブリダイズさせた。指示
した様々な量のＤnaＢヘリカーゼを加え、反応混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベートした。ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、サンプルをＰＡＧＥゲル上で
分離し、オートラジオグラフィーで検出した。レーン８は煮沸サンプルを含有し
、ssＤＮＡおよび dsＤＮＡの分離を示す。レーン９は標識 ssＤＮＡのみを含む
。
【００１８】 図２：3Ｈ−放射標識オリゴヌクレオチドおよびＭ13ssＤＮＡを用いるヘリカ
ーゼ活性の定量のためのシンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）の模式図。 図３：様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いた3Ｈ-基質の解離。 １分あたりのカウント（cpm）を各反応に加えたＤnaＢヘリカーゼの量の関数
としてプロットする。
【００１９】 図４：ＳＰＡアッセイを用いたＤnaＢヘリカーゼ活性の棒グラフ。 図５：Ｅｕ−放射標識オリゴヌクレオチドおよびローダミン標識相補性オリゴ
ヌクレオチドを用いたヘリカーゼ活性の定量のための時間リゾールビング蛍光消
光アッセイの模式図。
【００２０】 図６：様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いたハイブリダイズ基質の解離。 非解離 dsＤＮＡから放出された蛍光の量を各反応に加えたＤnaＢヘリカーゼ
の量の関数としてプロットする。 図７：ルテニウム標識オリゴヌクレオチドおよびＭ13ssＤＮＡを使用するヘリ
カーゼ活性の定量のための電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）アッセイの模式図。 図８：様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いた未解離二重鎖基質により発生した
電気化学ルミネセンスシグナル。 ＥＣＬシグナルを反応に加えたヘリカーゼの量の関数としてプロットする。
【００２１】
【発明の詳述】
本発明は、有利には、ヘリカーゼ活性を検出するための電気化学ルミネセンス
アッセイ法およびヘリカーゼ活性のモジュレーターを同定するための方法を提供
する。したがって、本発明は迅速な、高感度の、ヘリカーゼインヒビターの可能
性について高いスループットでのスクリーニングに適当なアッセイを提供する。
本発明はまた、ヘリカーゼ活性の同定およびヘリカーゼ活性のモジュレーターの
可能性についてのスクリーニングに使用するキットを提供する。このようなキッ
トには開示された方法に用いられる予め測定された成分が包含される。
【００２２】 ヘリカーゼは広範囲の様々な細胞機能たとえば成長に必要であり、標的疾患は
１または２種以上の特異的なヘリカーゼの活性を修飾することによる疾患または
疾患の進行が阻害される疾患のみに限定される。たとえば標的疾患にはウイルス
、細菌および真菌感染、代謝性疾患、遺伝的疾患、細胞の成長および調節機能不
全たとえば新生物、炎症、過敏症等が包含される。標的疾患は、植物とくに穀類
または動物とくに家畜、愛玩動物およびヒトの疾患であってもよい。
【００２３】 本発明の様々な態様を以下の項でさらに詳細に説明する。各項へのこの構成は
本発明の理解を容易にすることを意図するものであり、いかなる意味においても
本発明の限定を意図するものではない。
【００２４】定義 以下に定義される語は本出願を通じて使用され、本発明の範囲および実際の理
解を助けるものである。 特定の実施態様における「約」または「およそ」の語は、与えられた値または
範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内を意味す
る。 本明細書で用いられる「ある種の」の語は１または２以上の意味である。ヘリ
カーゼは１または２以上のヘリカーゼが関与するアッセイ、たとえば数種のヘリ
カーゼのインヒビターの同時スクリーニングを包含する意味である。
【００２５】 「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットからなるポリ
マー化合物である。核酸にはポリリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにポリデオキシリボ
核酸（ＤＮＡ）が包含され、それらはいずれも一本鎖または二重鎖である。ＤＮ
ＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが包含される
。
【００２６】 「核酸分子」はリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしく
はシチジン；「ＲＮＡ分子」）、またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシア
デノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン；
「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー型、またはそれらの任意のホスホエ
ステル類縁体たとえばホスホロチオエートおよびチオエステルの一本鎖または二
重鎖ヘリックスを意味する。二重鎖ＤＮＡ-ＤＮＡ，ＤＮＡ-ＲＮＡおよびＲＮＡ
-ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子とくにＤＮＡまたはＲＮＡ分子の語
は分子の一次および二次構造を意味するのみであり、それを特定の三次型に限定
するものではない。すなわち、この語はとくに線状および環状のＤＮＡ分子（た
とえば、制限フラグメント）、プラスミドおよび染色体中に見いだされる二重鎖
ＤＮＡを包含する。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、配列は本明細
書ではＤＮＡの非転写鎖（すなわちｍＲＮＡに相同の配列を有する鎖）に沿って
５′→３′方向の配列のみを与える通常の慣例に従って記載する。「組換えＤＮ
Ａ分子」は分子生物学的な操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００２７】 核酸は、核酸分子の一本鎖型が他の核酸分子に温度および溶液のイオン強度の
適当な条件下にアニーリングできる場合、他の核酸分子たとえばオリゴヌクレオ
チド、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに「ハイブリダイズ」するという。
温度および溶液のイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「緊縮度」を
決定する。低緊縮度のハイブリダイゼーション条件はＴｍ：５５℃、たとえば５
×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、０.２５％ミルク，ホルムアルデヒド：なし；もしく
は３０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳに相当する。中等度の
ハイブリダイゼーション条件は、高いＴｍ、たとえば４０％ホルムアルデヒド、
５×または６×ＳＳＣに相当する。高度なハイブリダイゼーション条件は最高の
Ｔｍ：たとえば５０％ホルムアルデヒド、５×または６×ＳＳＣに相当する。ハ
イブリダイゼーションはその２つの核酸が相補性配列を含むことを要求するが、
ハイブリダイゼーションの緊縮度に依存して塩基間のミスマッチも可能である。
核酸をハイブリダイズするのに適当な緊縮度は核酸の長さおよび相補性の程度、
本技術分野でよく知られた変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性
または相同性が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリドにおけるＴ
ｍ値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（高いＴｍに相当
する）は次の順序、すなわちＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ
の順序である。１００ ヌクレオチドよりも長いハイブリドについては、Ｔｍの
計算式が誘導されている（Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press
, Cold Spring Harbor, New York, 9.50-0.51 参照）。好ましくは短い核酸、す
なわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにおいては、ミスマッチの
位置が重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambro
okら, 11.7-11.8 参照）。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは
少なくとも約10であり、好ましくは少なくとも約15、最も好ましくは少なくとも
約20の長さである。
【００２８】 本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」の語は一般的に、相補性
の核酸にハイブリダイズできる少なくとも18ヌクレオチドである。オリゴヌクレ
オチドは32Ｐ−ヌクレオチド（単数または複数）によって標識することが可能で
、それにはビオチンまたはルテニウムキレートのような標識が共有結合によって
接合されている。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザ
ー上で合成的に調製される。したがって、天然に存在しないホスホエステルアナ
ログの結合たとえばチオエステル結合等を有するオリゴヌクレオチドが製造でき
る。
【００２９】 「アビジン」には、ビオチンに高い親和性で結合できる任意のタンパク質およ
びポリペプチドが包含される。ストレプトアビジンがこのようなアビジンの例で
ある。 「ヘリカーゼ」は相補性の核酸または核酸分子の二重鎖を解く（または非ハイ
ブリダイズする）能力を有する任意のタンパク質またはポリペプチドである。
【００３０】ヘリカーゼアッセイ 本発明によって特定される方法は、電気化学ルミネセンス標識からなり、相補
性の第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子
の混合物の形成を包含する。ハイブリダイズした第一および第二の核酸または核
酸分子は、標的化されるヘリカーゼに依存して、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、線
状または環状である。さらに、他の核酸もしくは核酸分子または構造類縁体も、
それらが標的化ヘリカーゼ活性に対する活性な基質を提供する限り置換できる。
核酸または核酸分子はアッセイ条件および要求に服する任意の長さとすることが
できる。たとえば、ヘリカーゼ基質特異性を保証し、非特異的な再生を最小限に
するためには、第一および第二の核酸または核酸分子間に最小の相補性領域、通
常は少なくとも約12，さらに通常には少なくとも約18，好ましくは約24の連続し
た塩基対が要求される。鎖の間にはサイズの差があってもよい。サイズはアッセ
イを容易にし、統計的に有意な結果を提供するように選択され、多くの場合、サ
イズは少なくとも１または２以上のオーダーの大きさで異なる。一般的に至適な
長さは経験的に容易に決定することができる。
【００３１】 核酸または核酸分子は、標的化ヘリカーゼ（単数または複数）に対して慣用の
基質を提供する任意の配列とすることができる。核酸または核酸分子は少なくと
も１種の核酸または核酸分子の全体の長さにわたって相補性であるか、または相
補性領域の非相補性５′および／または３′領域があってもよい。これらの非相
補性５′および／または３′領域の導入はある種のヘリカーゼの良好な基質を生
成する分子フォークを提供する。一般に慣用の複製ベクター（たとえばファージ
またはその制限フラグメント）は核酸または核酸分子の安価なソースを提供する
。アッセイは一般にＤＮＡ結合タンパク質たとえばヒストンの存在に適合する。
可能性のある様々な基質、たとえば様々なサイズ、配列、タンパク質複合性を有
する二重鎖核酸を包含することは、基質感受性ヘリカーゼの検出の可能性を改良
するために有利なことが多い。
【００３２】 第一の核酸または核酸分子は検出可能な電気化学ルミネセンス標識からなる。
電気化学ルミネセンスは電極に低電圧を適用した場合に発生する光であり、この
際、標識の環化的酸化および還元反応が誘発される。このような環化的酸化／還
元反応および光の発生が可能な任意の電気化学ルミネセンス標識が、本発明によ
り使用できる。好ましい標識はトリス-(ビピリジン）のキレートに結合したルテ
ニウム金属イオンである。ＤＮＡに対する特異的な電気化学ルミネセンス標識が
開発されていて（Kentenら, 1991, Clin.Chem. 37: 1626; Kentonら, 1992, Cli
n. Chem. 38: 873; Origen(登録商標), Origen(登録商標)ホスホロアミダイトお
よびＴＡＧホスホロアミダイト，IGEN Inc, Rockville, MD）、本発明に最も好
ましい。
【００３３】 任意の病原性ヘリカーゼ（すなわち、宿主細胞または生物体に有害に作用でき
るヘリカーゼ）を本発明によって分析することができる。急速に増殖している細
胞（たとえば新生物における細胞）は、ヒトヘリカーゼとくに複製ヘリカーゼの
インヒビターによって標的化される。さらに、病原体-選択的または-特異的ヘリ
カーゼは感染性疾患の処置のための医薬治療剤を同定するために使用することが
できる。真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼはとくに、本発明の方
法によるインヒビターの同定に、医学的に緊急な標的を提供する。また、複数個
のヘリカーゼまたは予め選択された範囲の様々なヘリカーゼのパネルがアッセイ
の範囲を最大限にするために使用できる。
【００３４】 好ましい病原体ヘリカーゼは、医学的に重要な感染性真菌たとえばアスペルギ
ルス、カンジダ属、大腸菌たとえばブドウ球菌属（たとえば黄色ブドウ球菌）、
ストレプトコッカス（たとえば肺炎球菌）クロストリジウム（たとえば perfrin
gens）、ナイセリア（たとえば gonorrhoeae）、腸内細菌（たとえば coli）、
ヘリコバクター（たとえば pylori）、ビブリオ（たとえば cholerae）、キャピ
ロバクター（たとえば jejuni）、シュードモナス（たとえば aeruginosa）、ヘ
モフィリス（たとえば influenzae）、ボルデテラ（たとえば pertussis）、マ
イコプラズマ（たとえば pneumoniae）、ウレアプラズマ（たとえば urealyticu
m）、レジオネラ（たとえば pneumophila）スピロヘータ（たとえば Treponema,
Leptospira および Borrelia）、マイコバクテリア（たとえば tuberculosis,
smegmatis）、アクチノマイセス（たとえばisraelii), Nocardia (たとえば ast
eroides), クラミジア（たとえば trachomatis）、リケッチア、コクシェラ、エ
ールリヒア、ロカリーマ、ブルセラ、エルシニア、フラシセラおよびパスツレラ
；原生動物、たとえば胞子虫類（たとえばPlasmodia）、根足虫類（たとえば En
tamoeba）および鞭毛虫類（Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia
等）；ならびにウイルス、たとえば（＋）ＲＮＡウイルス（例にはピコルナウイ
ルスたとえばポリオ；トガウイルスたとえば風疹；フラビウイルスたとえばＨＣ
Ｖ；およびコロナウイルスが包含される）、（−）ＲＮＡウイルス（例にはラブ
ドウイルスたとえばＶＳＶ；パラミクソウイルスたとえばＲＳＶ；オルトミクソ
ウイルスたとえばインフルエンザ；ブンヤウイルスおよびアレナウイルスが包含
される）、dsＤＮＡウイルス（たとえばレオウイルス）、ＲＮＡ−ＤＮＡウイル
スすなわちレトロウイルスたとえばＨＩＶ，ならびにある種のＤＮＡ−ＲＮＡウ
イルスたとえばＢ型肝炎ウイルスから誘導される。
【００３５】 ヘリカーゼは天然のソースから精製されてもよくまた組換えであってもよい。
ヘリカーゼは通常、少なくとも部分的に精製された型で提供される。ヘリカーゼ
活性に十分なヘリカーゼの部分のみが本発明のアッセイに使用される。前提とな
る結合特異性および親和性を付与できる部分は一般分子学および生化学的方法を
用いて本技術分野の熟練者には容易に同定され製造される。たとえば Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis,
Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (Ed. Aufubel
, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Green Publ.Assoc.Wile
y-Interscience, NY, NY, 1992）または本技術分野において知られた他の方法を
参照されたい。
【００３６】 本発明の方法では、本発明のアッセイ中に存在するヘリカーゼ活性により産生
され解離した第一の核酸または核酸分子を捕獲する必要がある。解離された第一
の核酸または核酸分子を捕獲するためには、任意の方法が採用される。好ましい
一連の工程においては、解離された第一または第二の核酸または核酸分子を第一
の核酸または核酸分子と相補性であり、捕獲リガンドからなる第三の核酸または
核酸分子と、第一および第三の核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件
下にインキュベートする。ついでハイブリダイズした第一および第三の核酸また
は核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体によって捕獲する。捕獲受容体
は直接、電気化学ルミネセンス検出を促進するために磁性ビーズの表面上にあっ
てもよい。
【００３７】 本発明のアッセイ方法には、電気化学ルミネセンス検出に影響することのない
任意の捕獲リガンド-受容体の組み合わせまたは第一の核酸または核酸分子を特
異的に捕獲するシステムによる接合を使用することができる。適当なリガンド-
受容体の組み合わせの例には、抗体およびそれらの相当する抗原が包含される。
他のリガンド-受容体システムはプロテインＡおよび免疫グロブリンまたはその
Ｆc 部分から構成されてもよい。本発明に使用できるその他の捕獲システムには
（１）レクチン-オリゴサッカライドまたは糖タンパク質；（２）ビオチン-アビ
ジン；（３）ホルモン受容体−ホルモン；（４）酵素-基質または補因子；（５
）ＲＮＡ-ＤＮＡ；および（６）ＤＮＡ-ＤＮＡが包含される。本発明においては
、いずれのエレメントもリガンドまたは受容体として働くことを理解すべきであ
る。好ましい実施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体
はアビジンである。ビオチン化オリゴヌクレオチドならびにアビジンでコートさ
れた磁性ビーズの製造は Kentenら, 1991（Clin.Chem. 37: 1626）および Kente
nら,1992（Clin.Chem. 38: 873）に記載されている。
【００３８】 本発明はとくに、ヘリカーゼ活性、とくにその阻害活性を修飾する能力がある
候補物質をスクリーニングするために適している。本発明は、候補物質のライブ
ラリーの高いスループットでの薬物スクリーニングに適している。ライブラリー
由来の候補物質には多くの化学的クラスが包含されるが、典型的にはそれらは有
機化合物、好ましくは小有機化合物である。ライブラリーは合成および／または
天然由来の化合物から構成される。たとえば、多くの方法が広範囲の有機化合物
および生物分子のランダムなおよび指示された合成に、たとえばランダムなオリ
ゴヌクレオチドの発現に利用される。また、細菌、真菌、植物および動物の抽出
物の型での天然の化合物のライブラリーも利用可能であり、容易に製造される。
さらに、天然のおよび合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、慣用の
化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。加えて、既知の
薬理学的物質は指示されたまたはランダムな化学修飾たとえばアシル化、アルキ
ル化、エステル化、アミド化等に付し、構造的な類縁体を製造することができる
。物質は標準系列希釈標（standard serial dilution）または既知のモジュレー
ターからの類推によって決定された量で提供される。
【００３９】 典型的には、本発明のアッセイには通常、ヘリカーゼ活性を促進または最大に
するための付加的な試薬、たとえば塩、緩衝剤等が包含される。また、非特異的
もしくはバックグランド変性を低下させる試薬または他の方法でアッセイの効率
を改善する試薬たとえばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター
、抗菌性物質、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質等も使用できる。
【００４０】
【実施例】
本発明の例を提供する以下の非限定的実施例を参照すれば、本発明をよりよく
理解できるものと確信する。一般的な分子生物学的技術 分子生物学において旧来的に使用される方法、たとえばプラスミドＤＮＡのプ
レパラティブ抽出、塩化カルシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心分離、
アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメ
ントの精製、フェノールまたはフェノール／クロロホルムによるタンパク質抽出
、塩メジウム中ＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌のトラ
ンスフォーメーション等は本技術分野の熟練者には周知であり、文献に詳細に記
載されている（Maniatis T ら,“Molecular Cloning, a Laboratory Manual", C
old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 (2nd Ed., 1
989; Ausubel F.M.ら編,“Current Protocols in Molecular Biology", John Wi
ley & Sons, New York, 1987）。
【００４１】 慣用のクローニングビヒクルにはｐＢＲ322 およびｐＵＣ型プラスミドならび
にＭ13 シリーズのファージが包含される。これらは市販品を入手することがで
きる（Bethesda Research Laboratories または New England Biolabs）。
【００４２】 ライゲーションのためには、ＤＮＡフラグメントをアガロースまたはアクリル
アミドゲル電気泳動でそれらのサイズにより分離し、フェノールまたはフェノー
ル／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、ついで供給者の推薦
に従ってファージＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下にインキュベートす
る。
【００４３】 ５′突出末端の充填は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Biolabs）のクレノウフ
ラグメントにより供給者の説明書に従って実施する。３′突出末端の破壊は、供
給者の推薦に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下に実施す
る。５′突出末端の破壊はＳ１ヌクレアーゼでの制御された処置によって実施す
る。
【００４４】 合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロの突然変異誘発は Taylor
ら（Nucleic Acids Res. 1985, 13: 8749-8764）によって開発された方法に従い
Amersham より市販されているキットを用いて実施する。
【００４５】 ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ（ポリメラーゼ触媒連鎖反応，Saiki RK ら, Sci
ence, 1985, 230: 1350-1354; Mullis KB & Faloona FA, Meth. Enzym., 1987,
155: 335-350）技術による酵素的増幅は「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Perkin
Elmer Cetus）を用いて製造業者の説明書に従って実施する。
【００４６】 ヌクレオチド配列の確証には Sangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1977, 74:
5463-5467）によって開発された方法により、Amersham より市販されているキ
ットを用いて実施される。 プラスミドＤＮＡは Qiagen プラスミド精製システムにより製造業者の説明書
に従って精製することができる。
【００４７】実施例１：旧来のヘリカーゼアッセイ ６０bpオリゴヌクレオチド（5′−TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3′；配列番号：１）をＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐで標識し、相補性の非標識６０bpオリゴヌク
レオチドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした基質および様々な量のＤ
naＢヘリカーゼ（Reha-Krantzら, J. Biol. Chem. 253 (1978): 4043-4050; LeB
owitzら, J. Biol. Chem. 261 (1986): 4738-4748）を、アッセイ緩衝液（４０
０mM Ｈepes pH７.４, ５mM ＤＤＴ，２mg／mLのＢＳＡ,１２.５mM ＭｇＣｌ2お
よび６.２５mM ＡＴＰ）中に混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。０
.５mM ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、ついで各反応液に２.５mgのプロテイ
ナーゼＫを加えてＤnaＢヘリカーゼに結合した残ったオリゴヌクレオチドがあれ
ば放出させた。ついでサンプルを１５％ＴＢＥゲルに通した。ＤＮＡ一本鎖およ
び二重鎖をオートラジオグラフィーで識別した。
【００４８】 旧来のヘリカーゼアッセイを用い、大腸菌ＤnaＢは二重鎖基質を解離（unhybr
idize）して一本鎖ＤＮＡを生成することができた。しかしながら、この方法に
よって二重鎖ＤＮＡから解離された一本鎖ＤＮＡを観察するために二重鎖ＤＮＡ
基質１７５fmolを完全に解離するには少なくとも０.７５μgのＤnaＢが必要であ
る。したがって、このアプローチは時間がかかり、感度は低い。
【００４９】実施例２：ヘリカーゼ [3Ｈ] シンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）酵素ア
ッセイ シンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）は図２に記載する。このアッセイは
一本鎖Ｍ13 ＤＮＡ（Ｍ13ssＤＮＡ）にアニーリングする [3Ｈ]-オリゴヌクレオ
チドの使用を可能にする。ヘリカーゼ活性の結果として、3Ｈ-オリゴヌクレオチ
ドはＭ13ssＤＮＡから解離される。放出されたオリゴヌクレオチドは、ついでビ
オチン化された第二のオリゴヌクレオチドにアニーリングさせる。この複合体は
ストレプトアビジンでコートされたＳＰＡビーズにより捕獲される。ＳＰＡビー
ズへのその密接な近似性によって、複合体はビーズ内のシンチラントを刺激する
ことが可能で、シグナルの増大を生じる。Ｍ13ssＤＮＡ遊離溶液に結合したまま
残る標識されたオリゴヌクレオチドはシンチラントを刺激しない。
【００５０】 ＳＰＡヘリカーゼアッセイキットは Amersham Life Science から購入した。
アッセイは提供された指示書を以下に記載のようにわずかに改変して実施した。
[3Ｈ] 標識オリゴヌクレオチドをＭ13一本鎖ＤＮＡ（Ｍ13ssＤＮＡ）鋳型にアニ
ーリングさせて部分二重鎖基質を形成させる。ＤnaＢヘリカーゼおよび二重鎖基
質をアッセイ緩衝液中に混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。ＥＤＴ
Ａの添加によって反応を停止させる。ビオチン化された相補性オリゴヌクレオチ
ドを、ついでＭ13ssＤＮＡから放出された放射標識オリゴヌクレオチドにアニー
リングさせる。複合体は室温で１５分間インキュベートして、ストレプトアビジ
ンでコートしたＳＰＡビーズにより捕獲し、放射性シグナルをカウントする。
【００５１】 ＤnaＢヘリカーゼの滴定（図３）により至適な活性は０.１６μgのＤnaＢヘリ
カーゼによって得られることが指示される。０.１６μg未満のＤnaＢヘリカーゼ
を用いた場合はヘリカーゼ活性は低下し、二重鎖ＤＮＡを解くのに十分なヘリカ
ーゼがないことが示唆される。しかしながら、０.１６μgを越えるＤnaＢヘリカ
ーゼを各反応に使用しても、ヘリカーゼ活性は低下する。これは過剰なヘリカー
ゼが二重鎖ＤＮＡ基質から放出される一本鎖ＤＮＡに非特異的に結合して、これ
らの一本鎖ＤＮＡ産物の結合から、相補性ビオチン化オリゴヌクレオチドを防止
することから生じると考えられる。至適アッセイ条件下には、このアッセイの最
良のシグナル対ノイズは約１０倍である（図４）。煮沸変性した二重鎖基質から
放出される産物より発生するシグナルによって測定すると、ＤnaＢヘリカーゼの
活性は可能な最大活性の95％である。この方法は迅速であり、多数のサンプルを
測定できる可能性を提供するするが、高価なことおよび有意な放射性廃物の発生
という欠点がある。
【００５２】実施例３：蛍光消光ヘリカーゼアッセイ 蛍光消光アッセイが検討されている（図５）。このアッセイでは、ユーロピウ
ムおよびローダミン標識プローブが蛍光消光二重鎖として存在する。ヘリカーゼ
を添加すると、二重鎖ＤＮＡ基質は解離して２つの一本鎖ＤＮＡが生成する。二
重鎖から放出されたランスユーロピウムで標識されたオリゴヌクレオチドは時間
分割蛍光シグナルを発生する。
【００５３】 ６０bpオリゴヌクレオチド（5′-GT GAC GAT CCC GCA AAA GCG GCC TTT AAC T
CC CTG CAA GCC TCA GCG ACC GAA TAT ATC G-3′；配列番号：2）をその５′末
端においてランスユーロピウムで標識した。配列番号：２と相補性領域を有する
オリゴヌクレオチド（5′-T TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AA
A GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC CA-3′；配列番号：３）をその５′末端におい
てローダミンにより標識した。Ｅu−標識およびＲh−標識プローブを１：２の比
で混合し、ハイブリダイズさせてＹ−型の基質を形成させた。様々な量のＤnaＢ
ヘリカーゼおよび５０fmolの蛍光標識基質をアッセイ緩衝液中に混合し、３７℃
で４５分間インキュベートした。ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させる。二
重鎖ＤＮＡ基質から放出されたＥu−オリゴヌクレオチドによって発生した蛍光
シグナルをついで記録した。
【００５４】 ＤnaＢヘリカーゼの滴定（図６）により、最大活性は１.２５μgのＤnaＢヘリ
カーゼを要求し、シグナル対ノイズは約４倍であることが指示される。いずれも
これらの結果は、このアプローチの感度は低いことを示している。
【００５５】実施例４：電気化学ルミネセンスヘリカーゼアッセイ 電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）ヘリカーゼアッセイは図７に示す。短いオリ
ゴヌクレオチドをルテニウム金属キレートで標識し、Ｍ13一本鎖ＤＮＡにアニー
リングさせる。ヘリカーゼを添加すると標識オリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡ
から解けて、ビオチンで標識した第二の相補性オリゴヌクレオチドへのアニーリ
ングに使用できる。得られた複合体はストレプトアビジンでコートした磁性ビー
ズにより捕獲される。ビーズ／複合体をフローセルを通して流し、磁場によって
電極に捕獲させる。電極に電圧を適用し、ルテニウム標識に由来するＥＣＬシグ
ナルを、電気化学ルミネセンス検出計たとえば Origen 分析計（IGEN Inc, Rock
ville, MD）を用いて測定する。
【００５６】 ６０bpオリゴヌクレオチド（5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT
GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3′；配列番号：４）または３０bp
オリゴヌクレオチド（5′-GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3′；配
列番号：５）をその５′末端でルテニウムで標識し（Kentenら, Clin.Chem. 199
2, 38:873-879）、ＴＥ緩衝液（10ｍＭ Ｔris ＨＣｌ, １mM ＥＤＴＡ，pH７.４
）に最終保存濃度２５pmole／μLで再懸濁する。Ｍ13mp18ssＤＮＡを０.１８pmo
le／mLの濃度でＴＥ緩衝液に溶解する。等濃度のＭ13mp18ssＤＮＡおよびオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイゼーション緩衝液（１０mM Ｔris ＨＣｌ, ０.３mM
ＮａＣｌ，３０mM クエン酸Ｎａ，pH８.５）中に混合する。この溶液を次に１
００℃で２分間インキュベートし室温に冷却する。二重鎖基質（３０または６０
オリゴヌクレオチドとアニーリングしたＭ13ssＤＮＡ）２５fmoleを大腸菌Ｄna
Ｂヘリカーゼ２５ngをアッセイ緩衝液（４０mM Ｈepes pH７.４, ０.５mM ＤＴ
Ｔ，０.２mg／ml ＢＳＡ，８mM ＭｇＣｌ2, ５mM ＡＴＰ）中に混合する。反応
混合物を３７℃、４５分間インキュベートする。この反応液に０.５Ｍ ＥＤＴＡ
中配列番号：４および５に相補性のビオチン化オリゴヌクレオチド（5′-GGT GA
C GAT CCC GCA AAA GCG GCC TTT AAC AGC-3′; 配列番号：６）１２５fmoleを加
えて反応液を３７℃で１５分間インキュベートする。ビオチン化は Clontech か
らの Biotin-ON（登録商標）ホスホロアミデートキット（PT 1402-1）により、
キットとともに提供された操作を用いて実施する。配列番号：６内の位置３２に
おけるアデニンがビオチン標識を受けた。最後に、総容量０.２５mLのＴＥ緩衝
液中２０μgのストレプトアビジン磁性ビーズを加え、この溶液を撹拌しながら
１５分間インキュベートする。ＥＣＬシグナルは、Origen 分析計（IGEN Inc, R
ockville, MD）を用い、製造業者により指示された条件により記録する。
【００５７】 ＤnaＢヘリカーゼの滴定のデータは、２５fmoleの二重鎖基質の解離にわずか
２５ngの酵素が要求されること、およびシグナル対ノイズは約３０倍であること
が指示される（図８参照）。付加的な実験により、一般にシグナル対ノイズは少
なくとも約３０倍で、４０倍程度大きいことが証明される。この検出方法は以前
に記載されたすべての方法に比較して有意に高い感度および再現性を示している
（表１参照）。
【００５８】
【表１】
【００５９】 電気化学ルミネセンスアッセイの感度は、蛍光消光アッセイより少なくとも７
倍大きく、ＳＰＡアッセイよりも３倍大きい。全体として、その感度はＳＰＡア
ッセイよりも約１８倍良好であり、蛍光アッセイに比較しても大きい。電気化学
ルミネセンス検出に必要な酵素の量は、ＳＰＡアッセイより 1/6 に低下し、消
光アッセイより 1/50 に低下する。電気化学ルミネセンスアッセイにおいて用い
られる基質の量はＳＰＡおよび消光アッセイいずれにに比べても 1/2 に低下す
る。電気化学ルミネセンスアッセイによれば、ヘリカーゼ活性の迅速かつ高感度
での検出が可能であり、高いスループットでのスクリーニングのために容易にフ
ォーマットすることができる。このアプローチは包括的であり、ヘリカーゼ活性
を有する任意の酵素に適している。
【００６０】 本発明は本明細書に記載の特定の実施態様に限定されるものではない。実際、
本明細書に記載した態様に加えて、本発明には様々な修飾が可能であり、それら
は以上の説明および添付された図面から本技術分野の熟練者には明らかな通りで
ある。このような修飾は上述の特許請求の範囲内に包含される意図である。 本明細書には様々な刊行物が引用されるが、これらの開示はそれらの全体が引
用により本明細書に導入される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 大腸菌ＤnaＢヘリカーゼ活性の放射分析法による定量を示す。
【図２】 3Ｈ-放射標識オリゴヌクレオチドおよびＭ13ssＤＮＡを用いるヘリカーゼ活性
の定量のためのシンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）の模式図である。
【図３】 様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いた3Ｈ-基質の解離を示す。
【図４】 ＳＰＡアッセイを用いたＤnaＢヘリカーゼ活性の棒グラフである。
【図５】 Ｅｕ−放射標識オリゴヌクレオチドおよびローダミン標識相補性オリゴヌクレ
オチドを用いたヘリカーゼ活性の定量のための時間リゾールビング蛍光消光アッ
セイの模式図である。
【図６】 様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いたハイブリダイズ基質の解離を示す。
【図７】 ルテニウム標識オリゴヌクレオチドおよびＭ13ssＤＮＡを使用するヘリカーゼ
活性の定量のための電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）アッセイの模式図である。
【図８】 様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いた未解離二重鎖基質により発生した電気化
学ルミネセンスシグナルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ 33/532 33/553 33/553 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リチャード・ケイ・ハリソン アメリカ合衆国ペンシルベニア州19343． グレンムーア．アシュリードライブ５ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB21 DA12 DA13 DA20 FA11 FA36 FB02 FB05 FB07 FB12 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA08 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR22 QR32 QR35 QR38 QR56 QR83 QS34 QS36 QS39 QX02

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (ａ) サンプルを、電気化学ルミネセンス標識からなり、相
    補性の第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分
    子と混合し、 (ｂ) サンプルと工程（ａ）からのハイブリダイズした核酸または核酸分子と
    サンプル中に存在するヘリカーゼが第一および第二の核酸または核酸分子を解離
    する条件下にインキュベートし、 (ｃ) 解離した第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで （ｄ）捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測
    定すること からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を検出する電気化学ルミネセンスアッセイ
    法。
  2. 【請求項２】 ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである
    請求項１記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
  3. 【請求項３】 病原体ヘリカーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘ
    リカーゼである請求項２記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
  4. 【請求項４】 工程（ｂ）と（ｃ）の間に、 (ｉ) 解離した第一の核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相
    補性であり捕獲リガンドからなる第三の核酸または核酸分子と第一および第三の
    核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートし、 (ii) 工程（ｉ）からのハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸
    分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体とともにインキュベートすること からなる請求項１記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
  5. 【請求項５】 捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンであ
    る請求項４記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
  6. 【請求項６】 捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にある請求項４記載の電気
    化学ルミネセンスアッセイ法。
  7. 【請求項７】 捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンであ
    る請求項６記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
  8. 【請求項８】 電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである請求
    項１記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
  9. 【請求項９】 (ａ) サンプルをヘリカーゼ、および電気化学ルミネセンス
    標識からなり、相補性の第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の
    核酸または核酸分子と混合して混合物を形成させ、 (ｂ) 工程（ａ）からの混合物を、ヘリカーゼがサンプルの不存在下に第一お
    よび第二の核酸または核酸分子を解離できる条件下にインキュベートし、 (ｃ) 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで (ｄ) 捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測
    定すること からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を修飾する物質を検出する方法。
  10. 【請求項１０】 物質はヘリカーゼ活性のインヒビターである請求項９記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼであ
    る請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 病原体ヘリカーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体の
    ヘリカーゼである請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 工程（ｂ）と（ｃ）の間に (ｉ) 解離した核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補性で
    あり捕獲リガンドからなる第三の核酸または核酸分子と、第一および第三の核酸
    または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートし、 (ii) 工程（ｉ）からのハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸
    分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体とともにインキュベートすること からなる請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンで
    ある請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にある請求項１３記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンで
    ある請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである請
    求項９記載の方法。
  18. 【請求項１８】 （ａ）電気化学ルミネセンス標識からなる第一の核酸また
    は核酸分子、（ｂ）第一の核酸または核酸分子に相補性な第二の核酸または核酸
    分子および（ｃ）ヘリカーゼからなる、ヘリカーゼ活性の電気化学ルミネセンス
    による検出のためのキット。
  19. 【請求項１９】 第一の核酸または核酸分子は第二の核酸または核酸分子に
    ハイブリダイズする請求項１８記載のキット。
  20. 【請求項２０】 さらに第一の核酸または核酸分子に相補性で、捕獲リガン
    ドからなる第三の核酸または核酸分子から構成される請求項１８記載のキット。
  21. 【請求項２１】 さらに捕獲受容体からなる請求項２０記載のキット。
  22. 【請求項２２】 捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にある請求項２１記載の
    キット。
  23. 【請求項２３】 捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンで
    ある請求項２２記載のキット。
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