JP2022145605A - 希釈または非精製試料における核酸の正確な並行定量のための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】大量の試料（最大数十ミリリットル）、ならびに／または希釈かつ／もしくは非精製試料材料からの高度にスケーラブルで正確な標的定量のために次世代シーケンシングを使用する方法を提供する。【解決手段】本発明は、複合試料中の遺伝子標的を検出および定量するためのプローブを含む方法およびキットに関する。本発明は、遺伝子標的毎に１以上の標的特異性核酸プローブ、および架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を含む。【選択図】図２Ｂ

Description

本発明の開示は、１以上の核酸標的を正確に、かつ大規模に並行して定量するための改良された次世代ＤＮＡシーケンシング方法に関する。より詳細には、本開示は、主に遺伝子標的および変異体の検出に使用される、複雑なＤＮＡプール中の遺伝子標的を検出および定量するためのプローブを含む方法およびキットに関する。本発明は、非常に不純な試料、例えばこれらに限定されないが、尿、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検）などを含む、ヒトまたは動物の身体から得られた試料において疾患を引き起こす遺伝子変異を検出する分野での特定の用途を見出す。本発明は、遺伝子標的毎に１以上の標的特異性核酸プローブ（左プローブおよび右プローブ）、および架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を使用する。

ある植物および動物における遺伝的変異の検出は、研究技術の進歩によって、面倒なものではない。しかしながら、特に弱いシグナルを有する試料における突然変異などの遺伝子変異の検出および正確な定量は、シーケンシングコストの低下にもかかわらず、現在依然として面倒で、労力を要し、高価である。コンセンサスバックグラウンドに対する遺伝子シグナルを検出するための特異性、弱い遺伝子シグナルを検出するための感度、検出されたシグナルを正確に定量するための精度、アッセイあたりの標的化遺伝子標的のスループット数、アッセイあたりのコスト、複数の試料を並行してアッセイする場合のアッセイコスト規模を決定するための評価、および試料採取から結果までの時間の長さを決定するためのターンオーバーなど、様々な問題はより正確に示されうる。

現在、液体生検の典型的な定量方法および概念的に類似したアッセイ（抗生物質耐性遺伝子検出など）には、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、アレイｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、または次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの定量が含まれる。定量方法は確固とした、かつ良好に確立された方法であるが、各方法は、以下により詳細に説明する特定の問題に関連している。

定量ＰＣＲ：定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ中の、すなわちリアルタイムでの標的ＤＮＡ分子の増幅を含む技術である。リアルタイムＰＣＲは、定量的に（定量的リアルタイムＰＣＲ）、および半定量的に、すなわち一定量のＤＮＡ分子より多い／少ない（半定量的リアルタイムＰＣＲ）場合、に使用され得る。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、遺伝子標的定量の絶対的な基準である。現在、ｑＰＣＲ反応の実験室コストは約２ドルである。しかしながら、反応を準備するための相当な実践時間（労働コスト）、標準曲線の必要性、および各定量化標的についての反復を考慮に入れると、事実、実際のコストははるかに高い。各遺伝子標的について別個の定量実験が必要とされるため、実践時間の量は、試料数の増加に伴って急激に変化する。

アレイＰＣＲ：ＰＣＲアレイは、関連する経路または疾患に焦点を当てた遺伝子のパネルの発現を分析するための最も信頼性の高いツールである。９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１００ウェルディスクのＰＣＲアレイは、それぞれ、焦点を当てた遺伝子パネルの徹底的に研究されたパネルのためのSYBR Green最適化プライマーアッセイを含む。ｑＰＣＲ技術のより新しい反復法は、個々のｑＰＣＲ反応を小型化するアレイｑＰＣＲである。アレイＰＣＲは、個々のｑＰＣＲ反応のコストを下げ、複数の標的および試料に対する方法のスケーラビリティを改善する。しかしながら、この方法は、現在、チップあたり数千ドルのコストに、さらに読み出し基礎設備の大きな資本を加えたコストで、１２個の試料からの３８４個の標的（または逆に３８４個の試料からの１２個の標的）に限定されている。従って、前記機構を使用した数千の試料のプロファイリングは、依然として極端に費用が高い。

デジタルＰＣＲ：デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲ、またはｄｅＰＣＲ）は、液滴マイクロ流体および蛍光検出によって標的の絶対定量を提供する方法である。この方法論は比較的費用対効果が高い（試料あたり１つの標的のコストは約３ドル）が、各試料の各標的についてそれぞれ実験を準備し、設定し、実行するための実践時間は、数千の試料規模には不十分である。

多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）は、個々の試料中の複数の遺伝子標的の検出を単純化するためのアプローチを提供する。しかしながら、ＭＬＰＡは、標的の相対的な定量しか提供せず、各試料について別個の検出実験を必要とする。さらに最近では、ＭＬＰＡの変形は、ＤＮＡのバーコード化からコンセプトを導入する。このコンセプトは、従来のＭＬＰＡワークフローよりも良好な定量的分離および試料多重化を可能にする。

次世代シーケンシングベースのアプローチ：次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、配列ベースの遺伝子発現分析をアナログ技術の「デジタル」代替物にするハイスループットシーケンシングとしても知られる。次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの標的計数は、ＤＮＡシーケンシングのコストが低下し続けるにつれてますます魅力的になってきており、現在、例えばＮＩＰＴスクリーニングで使用されている。しかしながら、現在のアプローチは、高いシーケンシングライブラリー調製コスト、および関連性のない遺伝子標的のシーケンシングに浪費されるシーケンシング労力に悩まされている。例えば、癌関連液体生検では、非標的化アプローチは、腫瘍学的に関連性のない遺伝子座に対するシーケンシング労力の浪費をもたらす。胎児診断において、遺伝子座の非標的化試料採取は、データを解釈するための統計的選択肢をかなり制限する。Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃは、より標的化されたシーケンシングアプローチを提供し、それはＲＮＡ捕捉プローブのアレイが次世代ＤＮＡシーケンシングの標的を濃縮する。

Ａｋｈｒａｓら（２００７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（２）：ｅ２２３は、バーコード化標的特異性プローブ、標的環状化およびシーケンシングを含む多重病原体検出アッセイを開示している。標的特異性プローブをライゲーションするための架橋オリゴヌクレオチドの使用も開示される。
国際公開第２０１９／０３８３７２号は、目的の標的配列を選択的に増幅し、シーケンシングする次世代シーケンシングアプローチを記載している。この方法は、試料中の多くの標的配列の正確かつ並行した検出および定量を可能にするが、より複雑で大量かつ／または不純な試料は、依然として困難である。
したがって、前記議論に照らして、前記の欠点、例えば、これらに限定されないが、核酸標的の正確かつ大規模に並行した定量を通じた特異性、感度、精度、スループット、コスト、評価およびターンオーバーを克服する必要がある。

国際公開第２０１９／０３８３７２号公報

Ａｋｈｒａｓ ｅｔ ａｌ．（２００７） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（２）：ｅ２２３

本発明は、例えば大量の試料（最大数十ミリリットル）、ならびに／または希釈かつ／もしくは非精製試料材料からの高度にスケーラブルで正確な標的定量のために次世代シーケンシングを使用する方法を提供する。

第１の主要な態様では、本発明は、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、
第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み；
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み；
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、及び、選択的に第３のバーコードを有し；
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し；
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、第１の捕捉部分を含む、工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成できる複数のオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
（ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
（ｖｉｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
（ｖｉｉｉ）選択的に、前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
（ｉｘ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
（ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／または前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法。

第２の主要な態様では、本発明は、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
（ｉ）前記各試料の各標的ヌクレオチド配列を提供し、
単一プローブは、分子の５’末端から出発し、第１の標的特異性部分、バーコードを含むスペーサー部分、および第２のプローブの３’末端における第２の標的特異性部分を含み、
架橋オリゴは、前記単一プローブの前記スペーサー部分または前記スペーサー部分の一部と相補的な配列を有する架橋オリゴ、であって、
前記単一プローブまたは前記架橋オリゴが第１の捕捉部分を含む、工程と、
（ｉｉ）前記１以上の標的ヌクレオチド配列の各々について、前記単一プローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴと接触させ、自己アニーリングさせる工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記複数の試料に存在する核酸を、前記架橋オリゴにアニーリングされた前記単一プローブと接触させる工程と、
（ｉｖ）前記単一プローブの前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
（ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
（ｖｉｉ）前記単一プローブの５’末端および３’末端をライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
（ｖｉｉｉ）選択的に、前記複数の試料からの前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
（ｉｘ）前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
（ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／もしくは前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／もしくは前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る、方法。

本明細書の一実施形態による多重ライゲーションアッセイ（ＭＬＡ）のフロー図を示す。 本明細書の一実施形態による、複数のプローブエンティティを有するプローブトリプレットの原理構造を示す。 本明細書の一実施形態による、第１のプローブと第２のプローブとの間の間隙充填を示す。 本明細書の一実施形態による、第１のプローブと第２のプローブと架橋複合体との間の間隙充填を示す。 実施例に記載のワークフローを使用して調製した２つのＤＮＡシーケンシングライブラリー（レーン６～７）、ならびに適正ではないオリゴヌクレオチド標的をプローブに提供した２つのネガティブコントロール実験（レーン８～９）のゲル電気泳動を示す。 検出された分子数は、スパイクイン合成オリゴヌクレオチド標的の量を正確に反映する。各行は、指定された突然変異の３つのスパイクイン濃度を表す。反応は４桁にわたって線形である。 検出されたシグナルは、プローブおよびそれらのオリゴヌクレオチド標的の有無に非常に特異的である。ＰＩＫ３ＣＡについて、２つの異なる発癌性変異体が試験された。

（定義）
標的ヌクレオチド配列：標的ヌクレオチド配列という用語は、その検出が必要とされる目的の任意のヌクレオチド配列であり得る。所定の用語は、連続するヌクレオチドの配列ならびに相補的配列を有する核酸分子を指すことが理解されうる。いくつかの態様における標的配列は、多型を表すかまたは多型に関連するヌクレオチド配列である。

多型：多型という用語は、集団中の２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または対立遺伝子の発生を指す。多型マーカーまたは部位は、配列の相違が生じる遺伝子座である。多型遺伝子座は、１つの塩基対ほど小さくてもよい。

試料：試料という用語は、本明細書では、２つ以上の標的配列を含む２つ以上の試料に使用される。本発明による方法で提供される試料は、少なくとも標的核酸を抽出し、それらが本発明で使用されるプローブにアクセスできるようにするために調製されていてもよい。特に、いくつかの実施形態では、試料はそれぞれ、少なくとも２つの異なる標的配列、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２５０、より好ましくは少なくとも５００、最も好ましくは少なくとも２０００またはそれ以上の異なる標的配列を含む。試料という用語は、限定されるものではないが、尿、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検）を含むヒト／動物の体から得られた２つ以上の試料、または水、廃水、土壌、植物、ウイルスもしくは細菌等を含む試料などを含む環境から得られた２つ以上の試料を指すことができる。一実施形態では、複数の試料は、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料、他の体液の試料または、例えば毛髪または皮屑からの抽出物等の身体物質を含む。

プローブ：プローブという用語は、可変長（通常５０～１０００塩基長、好ましくは５０～２００塩基長）のＤＮＡまたはＲＮＡの断片であり、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料中に使用でき、プローブ中の配列に相補的なヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）の存在を検出することができる。標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのセクションは、試料中の各標的配列に対して、左右のプローブの対が提供されるように設計され、それにより、プローブはそれぞれ、それらの末端に標的配列の一部に相補的なセクションを含む。あるいは、スペーサーセクションによって分離された標的配列の一部に相補的な２つのセクションを含む単一のプローブが供給される。さらに、本開示には、左プローブおよび右プローブの接合、または単一プローブのスペーサーセクションとのハイブリダイズに用いられる架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体が記載されている。

ユニバーサル：増幅手順を説明するために使用される場合、ユニバーサルという用語は、単一のプライマーまたはプライマーセットを複数の増幅反応のために使用できるようにする配列を指す。そのようなプライマーの使用は、選択された複数の核酸配列を増幅するために必要なプライマーが２つのみであるという点で、多重化を大幅に単純化する。ユニバーサルという用語は、プライミング部位を説明するために使用される場合、ユニバーサルプライマーがハイブリダイズする部位である。ユニバーサルプライミング配列／プライマーの「セット」が使用され得ることにも留意すべきである。

ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション（hybridizationまたはhybridisation）という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子の、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡにアニーリングするプロセスを表す。ＤＮＡまたはＲＮＡの複製およびＲＮＡへのＤＮＡの転写は両方とも、ヌクレオチドハイブリダイゼーションに依存する。

ライゲーション：ライゲーションという用語は、酵素の作用による２つの核酸断片の連結である。ＤＮＡリガーゼは、相補鎖上の隣接部位に結合した２本のポリヌクレオチド鎖（の末端）間のホスホジエステル結合の形成を触媒することができる酵素である。一実施形態では、ライゲーションは、特に化学的ライゲーションができるようにポリヌクレオチドの隣接する末端の両方が修飾されている場合、化学的に行われうる。

増幅：本明細書で使用される増幅という用語は、ヌクレオチド配列の混合物内の特定のヌクレオチド配列の濃度を増加させるための、ポリメラーゼベース反応の使用を意味する。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ／ＲＮＡのインビトロ酵素増幅のための急速な手順である。増幅されるＤＮＡ／ＲＮＡは、試料を加熱することによって変性され得る。プライマーという用語は、ＤＮＡ合成の出発点として役立つＲＮＡまたはＤＮＡの短鎖（一般に約１８～２２塩基）である。ＤＮＡ複製にそれが必要であるのは、このプロセスを触媒する酵素、すなわちＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの既存の鎖に新しいヌクレオチドを付加することしかできないからである。T7 RNAポリメラーゼは、単一のＤＮＡ分子を、ｃＤＮＡに逆変換することができるＲＮＡの複数コピーに転写すること、および増幅することの両方ができる。

ポリメラーゼ：ポリメラーゼは、核酸の長鎖またはポリマーを合成する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを使用して、塩基対合相互作用を用いてＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型鎖をコピーすることによって、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡ分子を組み立てる。本明細書で使用される特定のポリメラーゼであるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、５’→３’方向のＲＮＡの形成を触媒するＴ７バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、部分的に二本鎖のＤＮＡ鋳型、および補因子としてＭｇ^２＋イオンをＲＮＡの合成のために必要とする。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、単一のＤＮＡ分子をＲＮＡの複数コピーに転写すること、および増幅することの両方ができる。本明細書で使用される別の特定のポリメラーゼである、ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、バクテリオファージｐｈｉ２９由来の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼは高度に進化しており、したがって、環状ＤＮＡ鋳型をローリングサークル増幅して、長いコンカテマー配列を生成するのに理想的なポリメラーゼである。

ハイスループット：ハイスループットという用語は、多数のＤＮＡ試料を同時に処理する、およびスクリーニングする能力、ならびに単一のＤＮＡ試料内の多数の異なる遺伝子座を同時にスクリーニングする能力を意味する。しばしばＨＴＳと略されるハイスループットシーケンシングまたはスクリーニングは、大量の試料を同時に効果的にスクリーニングするのに特に関連する科学的実験のための方法である。

ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）：デオキシウリジンヌクレオチドの存在下で、切断によって環状ＤＮＡ分子の線状化を可能にする試薬。

上述のように、本開示は、ライゲーション依存性アッセイを活用することによる、非常に多数の試料における標的ヌクレオチド配列検出のハイスループット検出のための方法に関する。本開示は、次世代シーケンシングによって許容される技術を使用して、複合核酸プール中の遺伝子標的の配列を決定する方法を提供する。本開示はまた、ライゲーション依存性アッセイを活用することによって、多数の試料、好ましくは非常に多数の試料中の複数の遺伝子標的をプロファイルする方法を提供する。本開示はさらに、複数の試料中の異なる標的核酸の照会を可能にする多重ライゲーション依存性プローブ増幅のための方法を提供する。本発明の方法は、異なる標的核酸のための複数の異なるプローブセットを提供して、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列のシーケンシングを可能にする。シーケンシングデータを処理する際に、試料プールから、遺伝子標的を同定すること、及び、個々の試料を絶対的に定量するために、固有の配列識別子が使用される。

第１の主要な態様では、本発明は、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出のための方法に関し、方法は、
複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、
第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み；
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み；
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、及び、選択的に第３のバーコードを有し；
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し；
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、第１の捕捉部分を含む、工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成できる複数のオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
（ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
（ｖｉｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
（ｖｉｉｉ）前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
（ｉｘ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程；
（ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／または前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法。

図１は、本発明の方法の一実施形態の非限定的な例示を提供する。

本発明の方法は、３つ以上の核酸プローブを利用し、そのうちの２つの標的特異性核酸プローブ（左プローブおよび右プローブ）は遺伝子標的に特異であり、１つの核酸プローブまたは複合体は典型的にはユニバーサルである（架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体）。左右のプローブは、架橋プローブまたは架橋オリゴ複合体にハイブリダイズし、ライゲーション複合体を形成する。試料ＤＮＡまたはＲＮＡ上に標的識別部位を有するライゲーション複合体（１以上のバーコード配列を含む）は、照会試料の相補的標的配列に対してハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション後、左右のプローブを化学的またはＤＮＡリガーゼにより酵素的にライゲーションして、ライゲートされたライゲーション複合体を形成する。本発明では、そのようなライゲーションされたライゲーション複合体の複数が、分析される複数の試料における試料分析中に形成されるであろう。

一実施形態では、「複数の試料」は、これらに限定されないが、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検）を含むヒトもしくは動物の体から得られた２つ以上の試料、水、廃水、土壌、植物、ウイルスもしくは細菌を含む試料などを含む環境から得られた２つ以上の試料等を指していてもよい。好ましい実施形態では、試料は、事前に核酸を精製または濃縮せずに使用される。別の実施形態では、例えば、細胞を溶解して核酸を露出させる等の試料の前処理をしてもよい。

標的配列は、検出が必要とされる目的の任意のヌクレオチド配列を含み得る。本開示の標的ヌクレオチド配列は、患者の血液中のＤＮＡの画分または母体血液中のＤＮＡの画分から得ることができるが、これらに限定されない。患者の血液中のＤＮＡの画分は、アポトーシス／壊死癌細胞から、または胎児および／または母体由来の母体血液中のＤＮＡの画分から得ることができる。さらに、分析の結果を使用して、例えば、所定のタイプの癌に対する個体のリスク、所定の癌に対する所定の治療の有効性の判定、腫瘍における薬物耐性関連変異の発生、または一般的なトリソミーダウン症候群、パトウ症候群およびエドワーズ症候群などの遺伝性障害を有する胎児のリスク等を評価する。特定の実施形態では、方法は、各標的ヌクレオチド配列に対して、複数の異なるプローブセットを提供することを含む。

本明細書で使用される場合、プローブセットという用語は、第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴ（または架橋オリゴ複合体）、または単一のプローブおよび架橋オリゴ（または架橋オリゴ複合体）を含む。

特定の実施形態では、第１のプローブは、分子の５’末端から出発して、選択的に５’リン酸、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１のユニバーサル配列、選択的に第１の配列バーコード、およびその３’末端における第１の標的特異性部分を含む。特定の実施形態では、第２のプローブは、分子の５’末端から出発して、選択的に５’リン酸、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、選択的に第２のユニバーサル配列、およびその３’末端における第２の架橋オリゴ特異性配列を含む。

好ましい実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブのいずれかは、第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコードのうちの少なくとも１つを含む。第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコード、またはその両方は、ランダム配列であってもよく、または標的ヌクレオチド配列識別子配列、試料識別子配列および／または標的列挙のための分子バーコードを含んでもよい。

好ましい実施形態では、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、第１および第２のプローブ中の第１および第２の架橋オリゴ特異性配列にそれぞれ相補的な配列、選択的にユニバーサル配列を含有し、および／またはランダム配列であり得るか、または試料もしくは配列識別子配列を含有し得る第３のバーコードを含有し得る。この点において、第３のバーコードは、必ずしも第１および第２のバーコードが既に存在することを意味するものではない。上述のように、少なくとも１つのバーコードがライゲーションされたライゲーション複合体中に存在すべきであり、これにより、試験されたすべての試料中のすべてのライゲーション複合体内で複合体を一意的に定義することが可能になる。

さらに、第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、第１の捕捉部分を含む。第１の捕捉部分は、本明細書で使用される場合、化学基などの部分を指し、これによって、固体支持体に連結された第２の捕捉部分はプローブ、ライゲーション複合体またはハイブリダイゼーション複合体を捕捉、すなわちこれらと結合することができる。この目的のために、当技術分野で公知の任意の適切な捕捉部分を使用することができる。周知の好適な例は、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを用いたビオチン化分子の捕捉である。したがって、一実施形態では、第１の捕捉部分はビオチン部分であり、磁気ビーズなどの固体支持体に連結されたストレプトアビジンまたはアビジン部分（第２の捕捉部分）と相互作用することができる。他の選択肢には、ストレプトアビジン／アビジンとのコンジュゲーションに使用することができる、二重ビオチン、デスチオビオチンまたは光切断性ビオチンなどのビオチン誘導体が含まれる。さらなる選択肢としては、アクリルダイト／アクリルアミドコンジュゲーションのためのチオール基およびアクリルダイト基、クリックケミストリーのためのアルキン基およびアジド基、ならびに抗ジゴキシゲニン抗体コンジュゲーションのためのジゴキシゲニンの使用を含む。コンジュゲーションパートナーは、ビーズ（磁性またはその他）など任意の固体表面、または固体支持体上に提供されうる。

いくつかの実施形態では、第１、第２または架橋プローブまたは架橋オリゴ複合体は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有する。プロモーター配列は、工程（ｉｘ）においてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ライゲーションされたライゲーション複合体を増幅させる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在することが好ましいが、プロモーターは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在する代わりに、第１または第２のプローブ中に存在することもできる。しかしながら、そのような場合、プローブおよびオリゴの設計は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、試料および標的の同定、ならびに標的配列の列挙に必要なすべての配列を転写することができるようなものでなければならない。

第１の標的特異性部分、第２の標的特異性部分、第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または第２の架橋オリゴ特異性配列は、好ましくは、プローブ結合を増加させるために互いに独立して少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドを含有する。プローブ結合を増加させる化学修飾には、リボ核酸、ペプチド核酸、およびロックド核酸（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０３８３７２号公報の図３に示される）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブ、またはその両方の架橋部分が、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む。別の実施形態では、第１の標的特異性部分、第２の標的特異性部分、第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、化学修飾は、隣接するプローブを化学的にライゲーションさせる。いくつかの実施形態では、前述のプローブは、完全に隣接する遺伝子座に、または最大５００塩基対離れて、例えば最大２００塩基対離れて、例えば最大５０塩基対離れて、好ましくは最大４０塩基対離れて、より好ましくは最大３０塩基対離れて、より好ましくは最大２０塩基対離れて、より好ましくは最大１０塩基対離れて、最も好ましくは最大５塩基対離れて結合する。

プローブを標的配列を含む試料と接触させる前に、第１のプローブおよび第２のプローブを、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドと、好ましくは別個のチューブ内の試料の各々について接触させ、ライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする（工程（ｉｉ））。架橋が１つのオリゴではなく、互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、例えば３つまたは５つのオリゴヌクレオチドである実施形態（本明細書では図２Ｃに示す）では、複数のオリゴヌクレオチドが第１および第２のプローブとアニーリングする前にプレアニーリングされても、またはすべてのアニーリング工程が一度行われてもよい。

好ましくは、各ライゲーション複合体は、第１の標的特異性配列、第２の標的特異性配列および１以上のバーコード配列の組み合わせに対して固有である。これにより、増幅後の標的配列の列挙および結果の分析が可能になる。

その後、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列を複数のライゲーション複合体と接触させる（工程（ｉｉｉ））。第１のプローブおよび第２のプローブそれぞれの第１の標的特異性部分および第２の標的特異性部分を、標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズして、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する（工程（ｉｖ））。いくつかの実施形態では、試料は、１００マイクロリットル超、例えば１ｍｌ超の体積を有する。さらなる実施形態では、試料は、５ｐｍｏｌ未満、例えば１ｐｍｏｌ未満、例えば２００ｆｍｏｌ未満の核酸濃度を有する。

続いて、ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、ハイブリダイゼーション複合体が固体支持体に連結されるように、第１の捕捉部分と第２の捕捉部分とを相互作用させる（工程（ｖ））。その後、固体支持体に連結されていない試料の成分から、固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する（工程（ｖｉ））。固体支持体が磁性ビーズである場合、磁石を用いてビーズを固定化し、残った液体試料を除去してもよい。選択的に、洗浄工程は、工程（ｖｉｉ）に進む前に行われる。

工程（ｖ）および（ｖｉ）によって、核酸が精製および濃縮され、特に非常に純度の低い試料について結果の改善を可能にする。一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｖｉ）の前に核酸を濃縮する工程を含まない。したがって、一実施形態では、方法は、工程（ｖｉ）の前に、元の試料中の核酸を２倍超、１０倍超、または１００倍超に濃縮する工程を含まない。別の実施形態では、本発明の方法は、工程（ｖｉｉ）のライゲーションの後に精製工程を含まない。

続いて、形成されたハイブリダイズ複合体中のプローブのライゲーションを酵素的または化学的に行い、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する（工程（ｖｉｉ））。工程（ｖｉｉ）の一部として任意に、第１のプローブと第２のプローブとの間に間隙が存在する場合、ポリメラーゼおよび１以上のヌクレオチドを導入することによって塞ぐことができる。ポリメラーゼは、（ａ）ユニバーサル架橋オリゴ配列または架橋オリゴ複合体に相補的であり、かつ／または（ｂ）バーコード配列に相補的である、ヌクレオチドを付加し、それによって第１のプローブと第２のプローブとの間の２つの間隙を埋め、その結果、左右のプローブがライゲーションし、ユニバーサル配列および／または第３のバーコード配列が架橋相補鎖に含まれる。架橋オリゴは、第１のプローブまたは第２のプローブに存在する標的配列識別子配列が架橋オリゴに組み込まれるように、ライゲーションされたプローブに相補的な５’部位または３’部位から伸長される。好ましくは、第１のプローブの第２のプローブへのライゲーションを、両方が標的配列にアニーリングされている場合に妨害しないために、二本鎖ＤＮＡを分解しないポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼなどが使用される。

ライゲーションされたライゲーション複合体は、そして、１以上の標的試料からプールされる（工程（ｖｉｉｉ））。工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）は、指定された順序で、または逆の順序で実行されてもよい。

次に、１以上のライゲーションされたライゲーション複合体から核酸は増幅される（工程（ｉｘ））。

一実施形態では、工程（ｉｘ）での増幅は、第１および第２のプローブのユニバーサル部分に結合するプライマーを使用したＰＣＲによって行われる。

別の実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含み、工程（ｉｘ）は、
（ａ）鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して、１以上のライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅すること、
（ｂ）選択的に、得られた増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、前記認識配列を含有する特定のオリゴヌクレオチドとのアニーリングに供し、前記特定のオリゴヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼに対する認識部位が得られるように前記認識配列とアニーリングし、
（ｃ）選択的に、得られた一本鎖コンカテマー配列または前記エンドヌクレアーゼで得られたアニーリングされた複合体を切断すること、で実施される。
適切な鎖置換ポリメラーゼには、ｐｈｉ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔポリメラーゼが含まれる。認識配列を含有する特定のオリゴヌクレオチドは、典型的には、切断のための安定な二重らせんの形成を可能にするために、認識配列の周りにいくつかの追加の特定の配列を含有するであろう。

いくつかの実施形態では、切断は行われず、その後のハイスループットシーケンシング工程（ｘ）がコンカテマー配列に対して行われる。

別の実施形態では、工程（ｉｘ）の増幅は、ライゲーションされたライゲーション複合体のオリゴ配列上の二本鎖Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位に結合し、ＲＮＡを下流に転写するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して行われる。１つまたは複数のライゲーションされたライゲーション複合体からの合成ＲＮＡの増幅は、例えば、エマルジョン逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することによって行われてもよい。遊離試料およびプローブ核酸の除去は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成後であるがｃＤＮＡ合成またはＲＴ－ＰＣＲの前に、ＤＮＡ特異性エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼをプールされた増幅反応物に添加することによって行うことができる。一実施形態では、プローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、ウラシル特異性切除試薬（ＵＳＥＲ）を用いた切断による線状化を可能にするデオキシウリジン部分を含有する。これにより、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体または第１もしくは第２のプローブに組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、線状化されたライゲーション複合体からのＲＮＡ転写が可能になる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列およびデオキシウリジン部分は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが異なる試料中の異なる標的の列挙に必要なすべての情報を転写することができるような位置にあるべきである。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとデオキシウリジン部分との間には、以下の配列が存在するべきである：

標的の特定を可能にする少なくとも１つの配列、
試料の特定を可能にする少なくとも１つの配列、および、
試料中の標的配列のコピー数の決定を可能にする少なくとも１つの固有のバーコード配列。

選択的に、ｃＤＮＡは、ユニバーサル部位に逆相補的なＤＮＡ－オリゴヌクレオチド分子を使用してＲＮＡ分子から調製される。ＲＮＡ分子は、選択的に、ｃＤＮＡに変換され、プローブのユニバーサル部分に結合するプライマーの使用によって、ＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲによって選択的に増幅される。あるいは、ＲＴ－ＰＣＲまたはエマルジョンＲＴ－ＰＣＲが使用されてもよい。

選択的に、増幅後、固体支持体は除去され、上清はその後の処理に使用される。例えば、固体支持体が磁性粒子である場合、これらは磁石を使用して除去することができる。

本発明の方法の別の実施形態では、第１の捕捉部分と第２の捕捉部分との間の相互作用は、工程（ｖｉ）の後、工程（ｖｉｉ）の後または工程（ｖｉｉｉ）の後直ちに中断される。例えば、第１の捕捉部分がビオチンであり、第２の捕捉部分がストレプトアビジンである場合、過剰の可溶性ビオチンを添加することによって相互作用を中断することができる。ストレプトアビジンが磁性粒子に結合している場合、その後磁石を用いて除去することができる。

工程（ｉｘ）の増幅方法にかかわらず、いくつかの実施形態では、ヌクレオチド分子（ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子）を第１のプライマーおよび第２のプライマーで（さらに）増幅して増幅産物を得る。好ましくは、ライゲーションされた複合体中に存在する第１または第２のユニバーサル配列に逆相補的なユニバーサル第１プライマーおよびユニバーサル第２プライマーが使用される。

複数の試料中の標的ヌクレオチド配列の存在および／または数の特定は、第１および／もしくは第２の標的特異性部分の少なくとも一部分、第１および／もしくは第２のバーコードの少なくとも一部分、ならびに／または第３のバーコードの少なくとも一部分を、ハイスループット次世代シーケンシング技術によって、例えば、これに限定するものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑまたはＮｏｖａＳｅｑを含む次世代シーケンシングプラットフォームを使用して決定すること（工程（ｘ）および（ｘｉ））によって行われ得る。好ましくは、遺伝子標的列挙は、標的あたりの、および試料あたりの分子バーコードの数を数えることによって可能になる。試料を配列データから分離（逆畳み込み）し、ＤＮＡシーケンシング後にイン シリコで配列標的を定量する。

上述したように、第２の主要な態様では、本発明は、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出のための方法に関し、その方法は、
複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
（ｉ）前記各試料の各標的ヌクレオチド配列を提供し、
単一プローブは、分子の５’末端から出発し、第１の標的特異性部分、バーコードを含むスペーサー部分、および第２のプローブの３’末端における第２の標的特異性部分を含み、
架橋オリゴは、前記単一プローブの前記スペーサー部分または前記スペーサー部分の一部と相補的な配列を有する架橋オリゴ、であって、
前記単一プローブまたは前記架橋オリゴが第１の捕捉部分を含む、工程と、
（ｉｉ）前記１以上の標的ヌクレオチド配列の各々について、前記単一プローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴと接触させ、自己アニーリングさせる工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記複数の試料に存在する核酸を、前記架橋オリゴにアニーリングされた前記単一プローブと接触させる工程と、
（ｉｖ）前記単一プローブの前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
（ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
（ｖｉｉ）前記単一プローブの５’末端および３’末端をライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
（ｖｉｉｉ）選択的に、前記複数の試料からの前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
（ｉｘ）前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
（ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／もしくは前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／もしくは前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る。

本発明の第１の態様についての上述の実施形態は、必要な変更を加えて本発明のこの第２の態様に適用される。

一実施形態では、単一プローブは、化学的に連結された２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。

一実施形態では、スペーサー部分は、２５超の塩基、例えば５０超の塩基、例えば７５超または１００超の塩基、例えば２０～１０００塩基、例えば５０～１０００塩基を含む。

本発明の両態様の利点には、従来の核酸シーケンシング技術と比較して、低コスト、高単純性、高特異性、高感度、高精度、ハイスループット、高スケーラビリティおよび高ターンオーバーでの定量アッセイが含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の態様は、本発明の方法が、ヒトおよび動物の集団を含み、大量の未精製試料材料を含む複数の試料中の複数の核酸標的の正確かつ大規模に並行して定量を可能にすることである。上述したように、好ましい実施形態では、尿試料などの試料は、事前に核酸を精製または濃縮せずに使用される。別の実施形態では、試料を前処理してもよく、例えば、細胞を溶解して核酸を露出させる。本発明の１つの特定の利点は、独自のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを使用して、目的の標的配列の検出および増幅を可能にすることである。プローブは、アニーリングおよび結合効率を改善する特別に配置された修飾ヌクレオチドを用いて設計される。結合特性の改善は、アッセイの特異性、感度および精度を向上させる。本発明の方法は、遺伝変異体の研究にも適用可能であり、これらに限定されないが、ＳＮＰおよび／またはインデルなど、１以上の配列および／または多型についての試料の遺伝子型同定、癌診断、または母体血液からの胎児染色体障害等を含む診断および予後への適用が見出される。好ましい実施形態では、２つ以上の試料または２つ以上の遺伝子座／対立遺伝子組み合わせについて、バーコード配列は、ＳＮＰおよび／またはインデルなどの１以上の配列および／または多型について試料の遺伝子型を同定するために使用される。

別の態様では、本発明は、本発明の方法で使用するためのキットを提供する。一実施形態では、パーツのキットは複数の容器を含み、
少なくとも１つの容器は、第１のプローブおよび第２のプローブの１以上のセットを含み、および少なくとも１つの容器が、１以上の架橋オリゴ、または架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列と、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端の第１の標的特異性部分とを含み；
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分と、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端の第２の架橋オリゴ特異性配列とを含み；
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、各前記第１および第２のプローブ中のそれぞれの前記第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および選択的に第３のバーコードを含み；
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中にそれぞれ存在し；及び、
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、固体支持体に連結された第２の捕捉部分と連結することが可能である第１の捕捉部分を含む。

好ましくは、第１のプローブの３’末端または第２のプローブの５’末端、またはその両方は、第１のプローブが第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される。

好ましくは、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、第１のプローブの配列に相補的な配列または第２のプローブの配列に相補的な配列またはその両方において、１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。

選択的に、第１のプローブ、第２のプローブ、または架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、ウラシル特異的切除試薬を用いた切断による線状化を可能にするデオキシウリジン部分を含む。

好ましくは、第１のプローブの３’末端または第２のプローブの５’末端、またはその両方は、第１のプローブが第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される。

好ましくは、第１のプローブまたは第２のプローブ、またはその両方の架橋部分は、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む。

１つの特定の実施形態では、第１および第２のプローブのセットを含む少なくとも１つの容器と、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つの容器とは、１つの同じ容器である。そのような場合、３つ以上のプローブは、予めアニーリングされ、ライゲーションされた複合体を形成していてもよい。

本発明の１つの特定の利点は、独自のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを使用して、目的の標的配列の検出および増幅を可能にすることである。プローブは、アッセイ特異性、感度および精度の向上につながる改善された結合特性で設計される。本発明は、分子生物学、進化生物学、メタゲノミクス、遺伝子型同定、より具体的には、ＳＮＰおよび／またはインデルなど、１以上の配列および／または多型についての試料の遺伝子型同定を含むがこれらに限定されない、癌診断または胎児染色体障害を含むがこれらに限定されない分野における用途を見出す。

１つの特定の好ましい実施形態では、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、試料を識別するための情報を備え、固有の識別子を含む。そのような場合、第１および第２のプローブは、すべての試料に一般的に適用可能である（標的を識別するための情報を含むだけである）。したがって、１つの好ましい実施形態では、本発明による方法またはキットが提供され、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、各試料の標的配列の列挙を可能にする固有の配列を含むバーコードを含む。

さらなる態様では、本発明は、複数の容器を含むパーツのキットに関し、少なくとも１つの容器は１以上の単一プローブを含み、少なくとも１つの容器は１以上の架橋オリゴを含み、
前記単一プローブは、分子の５’末端から出発して、第１の標的特異性部分、バーコードを含むスペーサー部分、および第２のプローブの３’末端の第２の標的特異性部分を含み、
前記架橋オリゴは、前記単一プローブの前記スペーサー部分または前記スペーサー部分の一部に相補的な配列を有し、及び、
前記単一プローブまたは前記架橋オリゴは、固体支持体に連結された第２の捕捉部分と連結されることができる第１の捕捉部分を含む。

さらに、本発明は、以下に関する：
実施形態１：複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、
第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み；
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み；
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、及び、選択的に第３のバーコードを有し；
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し；
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、第１の捕捉部分を含む、工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成できる複数のオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
（ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
（ｖｉｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
（ｖｉｉｉ）前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
（ｉｘ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
（ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／または前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法。

実施形態２：複数の試料が、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料を含む、実施形態１に記載の方法。

実施形態３：第１の捕捉部分がビオチン部分であり、第２の捕捉部分がストレプトアビジン部分またはアビジン部分である、実施形態１または２に記載の方法。

実施形態４：洗浄工程が工程（ｖｉ）と（ｖｉｉ）の間に行われる、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５：シーケンシングが次世代ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンシングによって行われる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６：第１のプローブの３’末端または第２のプローブの５’末端、またはその両方が、第１のプローブが第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７：第１のプローブまたは第２のプローブ、またはその両方の架橋部分が、架橋オリゴへの結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態８：第１の標的特異性部分、第２の標的特異性部分、第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを含有する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態９：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が、前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体に存在し、
工程（ｉｘ）における前記増幅が、前記ライゲーションされたライゲーション複合体に組み込まれた前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体からのＲＮＡ合成を含む実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１０：第１のプローブ、第２のプローブ、または架橋オリゴが、ウラシル特異的切除試薬を用いた切断による線状化を可能にするデオキシウリジン部分を含む、実施形態９に記載の方法。

実施形態１１：工程（ｘ）に先立ち、前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体に存在するユニバーサル部位に逆相補的なＤＮＡ－オリゴヌクレオチド分子を用いて、前記ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製する、実施形態９に記載の方法。

実施形態１２：前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含み、
（ａ）工程（ｉｘ）における前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体からの核酸の増幅は、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して行われ、続いて、
（ｂ）選択的に、得られた前記増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、前記認識配列を含有する特定のオリゴヌクレオチドとのアニーリングに供し、前記特定のオリゴヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼに対する認識部位が得られるように前記認識配列とアニーリングし、および、
（ｃ）選択的に、エンドヌクレアーゼで、前記得られた前記増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列または得られたアニーリングされた複合体を切断する、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１３：前記工程（ｉｘ）における前記増幅は、前記第１および第２のプローブのユニバーサル部分に結合するプライマーを使用したＰＣＲによって行われる、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１４：遺伝子標的列挙が、標的あたりの、および試料あたりの分子バーコードの数を数えることによって可能になる、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１５：ヌクレオチド分子を第１のプライマーおよび第２のプライマーで増幅して増幅産物を得る、実施形態９～１４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１６：複数の容器を含むパーツのキットであって、
少なくとも１つの容器は、第１のプローブおよび第２のプローブの１以上のセットを含み、および少なくとも１つの容器が、１以上の架橋オリゴ、または架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列と、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端の第１の標的特異性部分とを含み；
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分と、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端の第２の架橋オリゴ特異性配列とを含み；
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、各前記第１および第２のプローブ中のそれぞれの前記第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および選択的に第３のバーコードを含み；
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中にそれぞれ存在し；及び、
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、固体支持体に連結された第２の捕捉部分と連結することが可能である第１の捕捉部分を含む、キット。

（方法）
一実施例では、出発物質は５ｍｌの尿であった。プロセスは、試料を＋９５°Ｃに１５分間加熱することによって試料材料中のタンパク質を変性させることによって開始した。その後、試料材料を１８０００×ｇで１０分間遠心分離して沈殿したタンパク質および他の残屑を除去し、その後の工程のために上清を回収した。

以下を含む３部分構成のプローブ複合体を形成した（図２に示す。）：
（ａ）分子の５’末端から出発して、第１の架橋オリゴ特異性配列、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を有する第１のプローブ；
（ｂ）分子の５’末端から出発して、第２の標的特異性部分、第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を有する第２のプローブ；
（ｃ）第１のプローブおよび第２のプローブのそれぞれにおける第１の架橋オリゴ特異性配列および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および５’ビオチンを有する架橋オリゴ。

３部分構成のプローブ複合体をフェムトモル濃度で試料上清に添加し、アニーリングした（図１に示す、工程１）。

その後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１磁性粒子を反応物に添加し、室温で１時間インキュベートしてビオチンとストレプトアビジンを相互作用させ、ハイブリダイゼーション複合体を粒子に結合させた。その後、磁石を用いて粒子を回収し、ＴＥ緩衝液を含むＴｗｅｅｎ ２０を用いて粒子を洗浄し、試料の不純物を除去した。

洗浄工程後、ビーズ結合プローブ複合体を伸長させ（間隙充填）（図２Ｂ）、ＤｒｅａｍＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとＡｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡリガーゼの組み合わせを添加し、＋４５°Ｃで１時間インキュベートすることによってライゲーションさせた。得られた伸長され、ライゲーションされた産物を、ウラシル特異性酵素混合物を添加することによって切断し、左側プローブ中のウラシル部分を標的化した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、製造業者の指示に従って使用）。

伸長、ライゲーションおよび切断の後、ビーズ結合分子をＴ７反応緩衝液で洗浄し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤の組み合わせを添加し、＋３７°Ｃで１時間インキュベートすることによるＲＮＡ合成に供した。その後、磁石、およびその後の処理のために保持された上清を使用して磁性粒子を除去した。

相補的オリゴヌクレオチドを添加し、＋７５°Ｃで５分間インキュベートすることによって、上清中のＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために準備した。その後、ＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤およびＭ－ＭＬＶ逆転写酵素を反応物に添加し、＋３７°Ｃで１時間インキュベートした。

続いて、インデックス付きＰＣＲプライマーおよびＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合性ＤＮＡシーケンシングライブラリーにｃＤＮＡを調製した。

最後に、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはｉＳｅｑを使用してシーケンシングし、シーケンシングデータを、ＵｎｉｘコマンドラインツールおよびＰｙｔｈｏｎプログラミング言語およびＲプログラミング言語の組み合わせを使用して処理した。簡潔に述べると、シーケンシング処理の理論的根拠は、各リード内のプローブ配列を同定し、それらの間のゲノム領域をシーケンシングし、各遺伝子標的に関連する分子バーコードの数を数えることである。

（実験）
第１の実験では、尿試料に、ＡＫＴ１、ＣＤ７４－ＲＯＳ１、ＣＨＥＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＴＰ５３などの遺伝子における典型的な発癌性変異に類似する、フェムトモル濃度の合成オリゴヌクレオチドをスパイクした。ビオチン含有三部分構成プローブを加えて、これらの遺伝子を標的とした。第１、第２および架橋プローブは、それぞれ６１、８５および５０ｎｔの長さであった。

スパイクされた試料を上記の方法に従って処理した。結果物をゲル電気泳動によって分析した。典型的な結果の例を図３に示す。

各リード内のプローブ配列をマッチングし、プローブ配列間のゲノム配列領域を同定し、分子バーコードを計数することによって、配列データ内で標的遺伝子を検出した。計数データはスパイクイン鋳型分子の数を正確に反映し、応答は４桁にわたって線形であった（図４）。検出されたシグナルは、標的分子の有無に非常に特異的であった（図５）。

別の実施例では、出発物質は１ｍｌの唾液であった。アッセイを行う前に試料を煮沸し、遠心分離したことを除いて、同様に処理を行った。これらの試料についても、検出されたシグナルは、標的分子の有無に非常に特異的であった。

（図１および図２の詳細な説明）
図１は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが増幅に使用される、記載された本発明の一実施形態のワークフローを示す。上述のように、他の増幅方法も可能である。工程１では、試料（１０２）内の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をライゲーション複合体のセット（１０４）と接触させる。ライゲーション複合体は、標的核酸（１０６）上にアニーリングする。工程２では、標的結合ライゲーション複合体を試料材料から試料不純物（１０３）を残して捕捉した。工程３では、アニーリングしたライゲーション複合体をライゲーションし、ライゲーションされたライゲーション複合体を得る。工程４では、複数の試料（１１０）からのライゲーションされたライゲーション複合体を一緒にプールする（１１２）。工程５では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ライゲーションされたライゲーション複合体からＲＮＡを合成する。プローブおよび試料ＤＮＡは、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとの混合物を使用して除去されてもよい。増幅されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し（１１６）、ＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲを使用して増幅してもよい。工程６では、増幅されたＤＮＡは、次世代ＤＮＡシーケンシングを使用してシーケンシングされる。工程７では、ＤＮＡシーケンシング結果は、生物情報学パイプラインを使用して標的計数に変換される。

図２Ａは、本明細書の一実施形態による、複数のプローブエンティティを有するプローブトリプレットの原理構造を示す。複数のプローブエンティティは、試料アニーリングの前に組み立てられた左プローブ、右プローブおよび架橋オリゴを含む。左プローブの最初の塩基は、場合により、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾１（２０２）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。左プローブの１５～２５塩基は、架橋結合配列１（２０４）を含み、これは、架橋部位１と呼ばれる効率的な架橋オリゴ結合のための化学修飾塩基をさらに含み得る。前述のセグメントはまた、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの逆相補配列を場合により含む。前述のように、このプロモーター配列は、架橋オリゴではなく、第１のプローブまたは第２のプローブ中に存在し得るが、但し、オリゴおよびプローブは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが異なる試料中の標的配列の列挙に必要なすべての情報を転写することができるように設計される。左プローブの後に続く１５～３０塩基は、場合により、本明細書でユニバーサル部位１（２０６）と呼ばれるＰＣＲプライマーのためのユニバーサル結合部位を含む。左プローブは、場合により、バーコード１（２０８）と呼ばれる分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む、５’末端から続く１０～２０塩基をさらに含む。左プローブは、５’末端から続く１５～３０塩基をさらに含み、遺伝子標的（２１０）に結合する。２０４または２１０のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴ（２２６）への親和性を増加させる化学修飾を含み得る。左プローブの最後の塩基は、場合により、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾１（２１０）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。

右プローブの最初の塩基は、場合により、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾２（２１４）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。右プローブの５’末端からの１５～３０塩基は、遺伝子標的（２１６）に結合する右プローブの一部を含む。右プローブの５’末端から続く１０～２０塩基は、場合により、バーコード２（２１８）と呼ばれる分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む。右プローブの５’末端から続く１５～３０塩基は、場合により、ユニバーサル部位２（２２０）と呼ばれるＰＣＲプライマーのためのユニバーサル結合部位を含む。右プローブの最後の１５～２５塩基は、架橋配列２（２２２）と呼ばれる、効率的な架橋オリゴ結合のための配列を含む。前述のセグメントはまた、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの逆相補配列を場合により含む。前述のように、このプロモーター配列は、架橋オリゴではなく、第１のプローブまたは第２のプローブ中に存在し得るが、但し、オリゴおよびプローブは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが異なる試料中の標的配列の列挙に必要なすべての情報を転写することができるように設計される。２１６または２２２のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴ（２２４）への親和性を増加させる化学修飾を含み得る。右プローブの最後の塩基は、場合により、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾２と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。

架橋配列３（２２６）と呼ばれる架橋オリゴの５’末端からの最初の１５～２５塩基は、右プローブの架橋配列１（２０４）と逆相補的であり、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列４（２２４）と呼ばれる架橋の後に続く１５～２５塩基は、左プローブの架橋配列２配列（２２２）と逆相補的であり、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列３（２２６）または架橋配列４（２２４）は、場合によりＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を含む。架橋オリゴの５’末端は、ライゲーション複合体を捕捉するために使用される第１の捕捉部分（２２８）を含む。

図２Ｂは、本明細書の一実施形態による、第１のプローブと第２のプローブとの間の間隙充填を示す。ここで、架橋オリゴは、架橋配列３（２２６）と架橋配列４（２２４）との間に間隙配列１（２３０）を含む。間隙配列（２３０）は、場合により、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を含み得る。左プローブと右プローブとの間の間隙は、ポリメラーゼおよび１以上のヌクレオチドを導入することによって充填される。この処理のために、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用することができる。ポリメラーゼは、（ａ）ユニバーサル架橋オリゴ配列に相補的であり、かつ（ｂ）標的配列に相補的であるヌクレオチドを付加し、それによって２つの間隙、すなわち第１のプローブと第２のプローブとの間の間隙１および間隙２を埋め、架橋オリゴに相補的な左プローブおよび右のプローブのライゲーションをもたらす。このようにして、バーコードは、位置２３０の架橋オリゴに存在する場合、相補配列に組み込まれる。選択的に、架橋オリゴプローブ２２４は、バーコード（プローブ１またはプローブ２に存在する場合）、ならびに／または標的配列２１０および２１６が架橋オリゴに組み込まれ、それによってライゲーションされたライゲーション複合体を形成するように、ライゲーションされたプローブと相補的な５’部位または３’部位から伸長する。しかしながら、ポリメラーゼの作用が標的配列の部位でのプローブのライゲーションを妨害しないように注意すべきである。例えば、二本鎖ＤＮＡ部分に到達した場合、例えば、標的配列にハイブリダイズしている第１のプローブおよび第２のプローブの部分に存在するときには、その作用を停止するポリメラーゼを使用することが可能である。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、架橋オリゴの位置２２６，２３０または２２４内のライゲーション複合体に埋め込むことができる。デオキシウリジン部分は、左プローブの位置２０４と２０６との間、または２０６内に埋め込むことができる。

図２Ｃは、本明細書の一実施形態による、複数のプローブエンティティを有するプローブクインテットの原理構造を示す。複数のプローブエンティティは、左プローブ、右プローブ、および３つのオリゴからなる架橋を含む。ここで、プローブ複合体は、左プローブと第２の架橋との間（２２８および２３６）、第２の架橋と右プローブとの間（２４０および２２２）、第１の架橋オリゴと第３の架橋オリゴとの間（２３８および２４２）、および左プローブと右プローブとの間（２０８および２１６）の間隙を含む。これらの間隙は、ポリメラーゼおよび１以上のヌクレオチドを導入することによって満たされる。この処理のために、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、およびＡｍｐｌｉｇａｓｅなどのＤＮＡリガーゼの混合物を使用することができる。ポリメラーゼがこれらの間隙を埋め、その後のＤＮＡリガーゼの作用により、プローブおよび架橋オリゴが環状複合体へとライゲーションされる。

左プローブの１５～２５塩基は、架橋結合配列１（２２８）を含み、これは、架橋配列１と呼ばれる効率的な架橋オリゴ結合のための化学修飾塩基を含んでもよい。左プローブは、場合により、ライブラリーのインデックス付けに使用されるユニバーサル配列（２０４）を含む、５’末端から続く１０～２０塩基をさらに含む。左プローブは、場合により、バーコード１（２０６）と呼ばれる分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む、５’末端から続く１０～２０塩基をさらに含む。左プローブは、５’末端から続く１５～３０塩基をさらに含み、遺伝子標的（２０８）に結合する。２２８のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴへの親和性を増加させる化学修飾（２２６）を含み得る。左プローブの最後の塩基は、場合により、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾１（２１０）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。

右プローブの最初の塩基は、選択的に、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾２（２１４）としての、隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。右プローブの５’末端からの１５～３０塩基は、遺伝子標的（２１６）に結合する右プローブの一部を含む。右プローブの５’末端から続く１０～２０塩基は、場合により、バーコード２（２１８）としての分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む。右プローブの５’末端から続く１０～２０塩基は、選択的にユニバーサル配列（２２０）を含む。架橋配列８（２２２）と呼ばれる右プローブの最後の１５～２５塩基は、第３の架橋オリゴ（２２４）の架橋配列７と逆相補的である。２０８、２１６、２２２または２２８のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴへの親和性を増加させる化学修飾を含み得る。

架橋配列３（２２６）と呼ばれる第１の架橋オリゴの５’末端からの最初の１５～２５塩基は、右プローブの架橋配列１（２２８）と逆相補的であり、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列２（２３８）と呼ばれる第１の架橋オリゴの最後の１５～２５塩基は、第２の架橋オリゴの架橋配列４配列（２３６）と逆相補的であり、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。第１の架橋オリゴの５’末端は、場合により、ライゲーション複合体を捕捉するために使用される捕捉部分（２３０）を含む。

架橋配列５（２４０）と呼ばれる第２の架橋オリゴの５’末端からの最初の１５～２５塩基は、第３の架橋オリゴの架橋配列６（２４２）と逆相補的であり、選択的に結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列４（２３６）と呼ばれる第２の架橋オリゴの最後の１５～２５塩基は、第１の架橋オリゴの架橋配列２配列（２３８）と逆相補的であり、選択的に結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。

架橋配列６（２４２）と呼ばれる５’末端からの第３の架橋オリゴの最初の１５～２５塩基は、第２の架橋オリゴの架橋配列５配列（２４０）と逆相補的であり、選択的に結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列７（２２４）と呼ばれる第１の架橋オリゴの最後の１５～２５塩基は、右プローブの架橋配列８配列（２２２）と逆相補的であり、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。第３の架橋オリゴの３’末端は、間隙充填中の伸長を防止するために、リン酸（または他の切断可能な）部分（２３４）を含んでいてもよい。

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、架橋オリゴの位置２２６、２３８または２４２または２２４内のライゲーション複合体に埋め込むことができる。デオキシウリジン部分は、左プローブの位置２０４と２２８との間、または２０６内に埋め込むことができる。

Claims (20)

1. 複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
   （ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、
   第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
   前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み；
   前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み；
   前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、及び、選択的に第３のバーコードを有し；
   前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し；
   前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、第１の捕捉部分を含む、工程と、
   （ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成できる複数のオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする工程と、
   （ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる工程と、
   （ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
   （ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
   （ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
   （ｖｉｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
   （ｖｉｉｉ）選択的に、前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
   （ｉｘ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
   （ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
   （ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／または前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
   前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法。
2. 前記複数の試料が、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料、他の体液の試料または身体物質からの抽出物を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の捕捉部分がビオチン部分であり、前記第２の捕捉部分がストレプトアビジン部分またはアビジン部分である、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程（ｖｉ）と（ｖｉｉ）との間に洗浄工程が行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記シーケンシングが次世代ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンシングによって行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１のプローブの３’末端または前記第２のプローブの５’末端、またはその両方が、前記第１のプローブが前記第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１のプローブまたは前記第２のプローブ、またはその両方の架橋部分が、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の標的特異性部分、前記第２の標的特異性部分、前記第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または前記第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が、前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体に存在し、
   工程（ｉｘ）における前記増幅が、前記ライゲーションされたライゲーション複合体に組み込まれた前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体からのＲＮＡ合成を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、または前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体が、ウラシル特異的切除試薬を用いた切断による線状化を可能にするデオキシウリジン部分を含む、請求項９に記載の方法。
11. 工程（ｘ）に先立ち、前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体に存在するユニバーサル部位に逆相補的なＤＮＡ－オリゴヌクレオチド分子を用いて、前記ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製する、請求項９に記載の方法。
12. 前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含み、
    （ａ）工程（ｉｘ）における前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体からの核酸の増幅は、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して行われ、続いて、
    （ｂ）選択的に、得られた前記増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、前記認識配列を含有する特定のオリゴヌクレオチドとのアニーリングに供し、前記特定のオリゴヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼに対する認識部位が得られるように前記認識配列とアニーリングし、および、
    （ｃ）選択的に、エンドヌクレアーゼで、前記得られた前記増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列または得られたアニーリングされた複合体を切断する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記工程（ｉｘ）における前記増幅は、前記第１および第２のプローブのユニバーサル部分に結合するプライマーを使用したＰＣＲによって行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
14. 遺伝子標的列挙が、標的あたりの、および試料あたりの分子バーコードの数を数えることによって可能になる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ヌクレオチド分子を前記第１のプライマーおよび第２のプライマーで増幅して増幅産物を供給する、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 複数の容器を含むパーツのキットであって、
    少なくとも１つの容器は、第１のプローブおよび第２のプローブの１以上のセットを含み、および少なくとも１つの容器が、１以上の架橋オリゴ、または架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含み、
    前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列と、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端の第１の標的特異性部分とを含み；
    前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分と、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端の第２の架橋オリゴ特異性配列とを含み；
    前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、各前記第１および第２のプローブ中のそれぞれの前記第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および選択的に第３のバーコードを含み；
    前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中にそれぞれ存在し；及び、
    前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、固体支持体に連結された第２の捕捉部分と連結することが可能である第１の捕捉部分を含む、キット。
17. 複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
    （ｉ）前記各試料の各標的ヌクレオチド配列を提供し、
    単一プローブは、分子の５’末端から出発し、第１の標的特異性部分、バーコードを含むスペーサー部分、および第２のプローブの３’末端における第２の標的特異性部分を含み、
    架橋オリゴは、前記単一プローブの前記スペーサー部分または前記スペーサー部分の一部と相補的な配列を有する架橋オリゴ、であって、
    前記単一プローブまたは前記架橋オリゴが第１の捕捉部分を含む、工程と、
    （ｉｉ）前記１以上の標的ヌクレオチド配列の各々について、前記単一プローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴと接触させ、自己アニーリングさせる工程と、
    （ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記複数の試料に存在する核酸を、前記架橋オリゴにアニーリングされた前記単一プローブと接触させる工程と、
    （ｉｖ）前記単一プローブの前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
    （ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
    （ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
    （ｖｉｉ）前記単一プローブの５’末端および３’末端をライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
    （ｖｉｉｉ）選択的に、前記複数の試料からの前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
    （ｉｘ）前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
    （ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
    （ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／もしくは前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／もしくは前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
    前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る、方法。
18. 前記単一プローブが、化学的に連結された２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 請求項２～１５のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 複数の容器を含むパーツのキットであって、
    少なくとも１つの容器は１以上の単一プローブを含み、少なくとも１つの容器は１以上の架橋オリゴを含み、
    前記単一プローブは、分子の５’末端から出発して、第１の標的特異性部分、バーコードを含むスペーサー部分、および第２のプローブの３’末端の第２の標的特異性部分を含み、
    前記架橋オリゴは、前記単一プローブの前記スペーサー部分または前記スペーサー部分の一部に相補的な配列を有し、及び、
    前記単一プローブまたは前記架橋オリゴは、固体支持体に連結された第２の捕捉部分と連結されることができる第１の捕捉部分を含む、キット。
    
    
    

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