NO328070B1 - ECL-analyse for deteksjon av helikaseaktivitet, fremgangsmate for a identifisere et middel som modulerer helikaseaktivitet samt kit for ECL-deteksjon av helikaseaktivitet. - Google Patents
ECL-analyse for deteksjon av helikaseaktivitet, fremgangsmate for a identifisere et middel som modulerer helikaseaktivitet samt kit for ECL-deteksjon av helikaseaktivitet. Download PDFInfo
- Publication number
- NO328070B1 NO328070B1 NO20021585A NO20021585A NO328070B1 NO 328070 B1 NO328070 B1 NO 328070B1 NO 20021585 A NO20021585 A NO 20021585A NO 20021585 A NO20021585 A NO 20021585A NO 328070 B1 NO328070 B1 NO 328070B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- helicase
- nucleic acid
- electrochemiluminescence
- receptor
- capping
- Prior art date
Links
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 53
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 106
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 106
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 106
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 28
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 24
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 24
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 12
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 12
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical group [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 claims description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 3
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 23
- 108010006296 DnaB Helicases Proteins 0.000 description 20
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 5
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 4
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010046914 Exodeoxyribonuclease V Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 2
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000606660 Bartonella Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241001445332 Coxiella <snail> Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000224431 Entamoeba Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 101150104425 T4 gene Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 241000224526 Trichomonas Species 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000005401 electroluminescence Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001776 time-resolved fluorescence quenching Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Battery Electrode And Active Subsutance (AREA)
- Polyurethanes Or Polyureas (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
OPPFINNELSENS FELT
Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg til analyser som bruker elektrokjemiluminescens for å påvise helikaseaktivitet. Derfor bidrar oppfinnelsen med en helikaseanalyse som er rask, sensitiv og passende for høy kapasitet screening for helikaseaktivitet generelt, og spesielt for potensielle helikasehemmere. Helikasehemmere representerer en klasse med farmakologiske virkemidler som er nyttige for behandlingen av sykdom.
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
DNA- helikaser
DNA-helikaser er enzymer som er involvert i alle aspekter av nukleinsyremetabolismen (Lohman og Bjørnson, Annu. Rev. Biochem., 1996, 65, 169-214; Matson, S. W., Progress in NuclearAcid research and Molecular Biology, 1991, 40, 289-326). Den stabile formen av de fleste DNA in vivo er dobbelttrådet heliks-DNA. Enkelttrådete DNA er nødvendige for DNA replikering, reparasjon, rekombinasjon og konjugasjon. For å danne enkelttrådet DNA fra en dobbelttråd, må DNA-dupleksen være minst delvis opptvunnet og separert. Opptvinning av stabile dupleks-DNA er katalysert av DNA-helikaser ved å bruke energien som er derivert fra hydrolysen av nukleosid 5' trifosfater (NTP). Helikaseenzymene translokerer langs DNA for å opptvinne (få trådene til ikke å hybridisere) dupleksen med en hastighet som kan være så rask som 500-1000 basepar pr. sekund.
DNA-helikaser er blitt identifisert i forskjellige prokaryoter, eukaryoter, bakteriofager og virus. De fleste organismer koder for flere helikaser. For eksempel koder E. coli for minst 12 forskjellige helikaser (Matson, et al., BioEssays, 1994, 16,13-22 og S. cerevisiae koder for minst seks helikaseformer (Li, et al., Chromosoma, 1992, 102, s. 93-99). Selv om disse DNA-helikaser har mange forskjellige funksjoner i DNA-metabolisme er det nå klart at helikaseaktiviteten er funksjonen som tilskrives opptvinningen av DNA-dupleksen. På grunn av den essensielle funksjonen helikasene har i den cellulære metabolisme, representerer disse enzymene viktige mål for å utvikle terapeutiske virkemidler.
Helikaseanalyser
Flere typer analyser er utviklet for å måle opptvinningen av duplekse nukleinsyrer ved helikaser. En slik analyse måler sensitiviseringen av merket dupleks-DNA til enkelttrådet-spesifikke nukleaser, slik som Sl eller eksonnuklease I, som resulterer i produksjon av ssDNA under opptvinningen (Palas et al., J. Biol. Chem., 1990, 265:3447). Elektronmikroskopi har også blitt anvendt for å visualisere direkte regioner i DNA som opptvinnes av proteiner, slik som recBCD-enzym, rep protein, E. coli helikaser I og II, og SV40-T-antigen (Runyon et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 1990, 87:6383).
Den mest vanlige analysen for å bestemme helikaseaktiviteten in vitro
bruker elektroforese (Venkatesanet al., J. Biol. Chem., 1982, 257, 12426; Matson, et al., J. Biol. Chem., 1983, 258, 14017). Helikaseenzymet opptvinner dupleks DNA og enkelttrådete DNA. Produktene av denne reaksjonen blir separert på en polyakrylamid eller agarosegel. En radioaktiv merking innen DNAet tillater direkte visualisering og kvantifisering av resultatene.
En kontinuerlig spektrofotometrisk analyse som er utviklet for å studere recBCD-enzymhelikaseaktiviteten bruker et ssDNA bindende protein, enten E. coli SSB-protein (enkelttrådet DNA-bindende protein) eller fag T4-gen 32-protein, som rapportørmolekyl (Romane et al, Biochemistry, 1989,28:2863). Når dsDNA er opptvunnet, binder SSB-proteinet seg til ssDNA som dannes, og resulterer i quenching av dets indre fluorescens. Tilleggshelikaseanalyser er beskrevet i US patenter 4 568 649, 5 705 344 og 5 747 247.
Fremgangsmåte for påvisning av Hepatitt C virus helikase aktivitet ved anvendelse av "Scintillation Proximity Assay System" er kjent fra Anal Biochem.,
(1998), vol. 257(2), side 120-126.
Hver av disse analysene som er beskrevet over har visse begrensninger relatert til sensitivitet, antall trinn som kreves for å utføre analysen, og/eller begrenset antall av prøver som kan testes. Det er derfor klart at slike fremgangsmåter ikke er lett adapterbare for høyt sensitive, høy kapasitets medikament screeningsformater. Derfor er det nødvendig innen feltet å få en enkel, men sensitiv helikaseanalyse som kan utføres i høy kapasitets. Den foreliggende oppfinnelse overvinner disse hindringer og bidrar med en helikaseanalyse som er rask, sensitiv og passende for en høy kapasitets screening for potensielle helikasehemmere.
Elektroluminescensanalvser
Elektrokjemiluminescens er lys som lages når en lav volt brukes på en elektrode, og dermed trigger en syklisk oksidasjon- og reduksjonsreaksjon av rutheniummetallion bundet i en "chelate" av tris-(bipyridin). Denne teknologi har en vid anvendelighet for deteksjon av mikrobiologiske, biokjemiske og kjemiske analyser (Bruno et al., 1997, Ree. Res. Devel. In Micro. 1:25).
Elektrokjemiluminescensmerkinger for DNA er blitt utviklet (Kenten et al., 1991, Clin. Chem. 37:1626; Kenten et al., 1992, Clin. Chem. 38:873, "Origen" label, "Origen" Phosphoramidite og TAG Phosphoramidite tilgjengelige fra IGEN Inc., Rockville, MD), og brukt for deteksjon av polymerasekjedereaksjonsprodukter (Schutzbank et al., 1995, J. Clin. MicrobioL, 33:2023). Disse analyser er vist å være raske og effektive for deteksjon av amplifiserte PCR-produkter.
Anvendelse av elektrokjemiluminescens (ECL) merking i immunoassay og DNA-probe assay i klinisk diagnostikk er kjent fra Clin Chem., (1991), Vol.37(9), side 1534-1539.
Metode for eksponensiell anrikning av nukleinsyre ved en enkel "uparret" primer er kjent fra W09312245. ECL merkede primere anvendes for å kvantifisere anriking av PCR produktene.
WO9508644 vedrører metode for å detektere og kvantifisere nukleinsyremolekyler. Det ønskede nukleinsyremolekyl fremstilles ved å anvende ECL-merkede enkelt nukleotider. Det ECL-merkede nukleinsyremolekyl kan så kvantifiseres ved måling av ECL-inkorporering.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelse bidrar til en helikaseanalyse som er rask, sensitiv og passende for høy kapasitets screening for potensielle helikaseinhibitorer. Helikaseinhibitorere representerer en klasse med farmakologiske midler som er nyttige for behandling av sykdom.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en elektrokjemiluminescensanalysefremgangsmåte for å detektere helikaseaktivitet i en prøve, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter
(a) å kombinere prøven med en første nukleinsyre som omfatter en elektrokjemiluminescensmarkør og hybridisert til en komplementær annen
nukleinsyre; (b) å inkubere prøven og hybriserte nukleinsyrer fra trinn (a) under betingelser hvor
helikase som er til stede i prøven kan dehybridisere første og andre nukleinsyrer; (c) å fange dehybridiserte første nukleinsyre; og
(d) å måle elektrokjemiluminescens fra den fangede første nukleinsyren.
Helikasen kan være en human eller patogen helikase. Helst er helikasen en fungal, viral, bakteriell eller parasittheleikase.
Enhver fremgangsmåte for å fange ikke-hybridisert første nukleinsyre eller nukleinsyremolekyl kan brukes. I en foretrukket serie med trinn, mellom trinnene (b) og (c) over, blir de ikke hybridiserte nukleinsyrene inkubert med en tredje nukleinsyre komplementær til den første nukleinsyren og som omfatter en kapringsligand, under betingelser hvor de første og tredje nukleinsyrene kan hybridisere. Deretter kan de hybridiserte første og tredje nukleinsyrene fanges med en kapringsreseptor som binder den fangede liganden. Kapringsreseptoren kan være på overflaten av magnetiske kuler. I en ønsket utførelseform, er kapringsliganden biotin og kapringsreptoren avidin. Den foretrukne elektrokjemiluminescensmerkingen er et rutheniumchelat.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å detektere i en prøve et middel som modulerer helikaseaktiviteten i en prøve, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter
(a) å kombinere prøven, en helikase og et første nukleinsyre som omfatter en elektrokjemiluminescensmarkør og hybridisert til en komplementær andre
nukleinsyre, og dermed danne en blanding;
(b) å inkubere blandingen fra trinn (a) under betingelser hvor helikasen kan
dehybridisere de første og andre nukleinsyrene i fravær av prøven;
(c) å fange dehybridiserte første nukleinsyre; og
(d) å måle elektrokjemiluminescens fra den fangede første nukleinsyren.
I en foretrukken utførelsesform, er middelet en hemmer av helikaseaktiviteten. Helikasen kan være en human eller patogen helikase. Helst er helikasen fungal, viral, bakteriell eller parasitthelikase
Enhver metode for å fange dehybridiserte første nukleinsyre kan brukes. I en foretrukket serie med trinn, mellom trinnene (b) og (c) over, blir de dehybridiserte nukeleinsyrene inkubert med en tredje nukleinsyre komplementært til den første nukleinsyre og som omfatter en kapringsligand, under betingelser hvor de første og tredje nukleinsyrene kan hybridisere. Deretter kan de hybridiserte første og tredje nukleinsyrene fanges med en kapringsreseptor som binder kapringsliganden. Kapringsreseptoren kan være på overflaten av magnetiske kuler. I en foretrukket utførelsesform, er kapringsliganden bitotin og kapringsreseptoren avidin. Den foretrukne kjemoluminescensmerkingen er et rutheniumchelat.
Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et kitt for elektrokjemiluminescensdeteksjon av helikaseaktivitet, kjennetegnet ved at den omfatter (a) en første nukleinsyre som omfatter en elektrokjemiluminescensmarkør; (b) en andre nukleinsyre komplementær til første nukleinsyre;
(c) en helikase.
I et aspekt, er første nukleinsyren allerede hybridisert til andre nukleinsyre. Kittene ifølge oppfinnelsen, kan videre omfatte en tredje nukleinsyre komplementær til første nukleinsyre og som omfatter en kapringsligand. Under slike omstendigheter, vil kittet generelt, inkludere en kapringsreseptor som er i stand til å binde kapringsliganden. I en foretrukket utførelsesform, er kapringsreseptoren på overflaten av magnetiske kuler. I den mest foretrukne utførelsesform, er kapringsliganden biotin og kapringsreseptoren avidin.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1: Radiometrisk kvantitering av E. coli. DnaB-helikaseaktivitet. Et 60 basepar oligonukleotid ble merket med <32>P i en 3' enden. Deretter ble et komplementær 60 basepar oligonukleotid hybridisert med det merkede nukleotidet. Forskjellige mengder DnaB-helikase som indikert ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. EDTA ble tilsatt for å stoppe reaksjonen, og prøvene ble separert på en PAGE-gel og detektert med autoradiografi. Spor 8 inneholder en kokt prøve for å vise separasjoen av ssDNA og dsDNA. Spor 9 inneholder bare merket ssDNA. Figur 2: Skjema av scintillasjonen proksimitetsanalyse (SPA) for kvantitering av helikaseaktivitet ved å bruke <3>H-radioaktivt merkede oligonukleotider og Ml 3 ssDNA. Figur 3: Opptvinning av <3>H-substrater ve å bruke forskjellige mengder av DnaB-helikase. Tellinger per minutt(cpm) er plottet som funksjon av mengde DnaB-helikase i hver reaksjon.
Figur 4: Stolpediagram av Dnab-helikaseaktivitet ved å bruke SPA-analyse.
Figur 5: Skjema av "Time Resolved Fluorescence Quenching" analyse for kvantitering av helikaseaktivitet ved å bruke Eu-radiomerkede oligonukleotider og rodahim-merkede komplementære oligonukleotider. Figur 6: Opptvinning av hybridiserte substrater ved å bruke forskjellige mengder av DnaB-helikase. Mengde fluorescens frigjort fra opptvinning av dsDNA er plottet som funksjon av mengde DnaB-helikase tilsatt i hver reaksjon. Figur 7: Skjema for elektrokjemiluminescenc (ECL)-analyse for kvantitering av helikaseaktiviteten ved å bruke ruthenium-merkede oligonukleotider og Ml3 ssDNA. Figur 8: Elektrokjemiluminescenssignal generert ved å opptvinne dobbelttrådete substrater ve å bruke forskjellige mengder DnaB-helikase. ECL-signalet er plottet som funksjon helikase tilsatt til reaksjonen.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fordelaktig en elektrokjemiluminescensanalysefremgangsmåte for å detektere helikaseaktivitet, og en fremgangsmåte for å identifisere modulatorer av helikaseaktiviteten. Derfor tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en rask og sensitiv analyse for potensielle helikasehemmere som er passende for høy kapasitets screening. Oppfinnelsen tilveiebringer også kitt for bruk til å identifisere helikasekativitet, og screeing for potensielle modulatorer av helikaseaktiviteten. Slike kitt inkluderer forhåndsmålte mengder av komponentene som brukes i de utarbeidede fremgangsmåtene.
Fordi helikaser er nødvendig for en rekke forskjellige cellulære funksjoner inkludert vekst, er målsykdommer begrenset bare i at sykdom eller sykdomsprogresjon er utsatt for hemming ved modulering av aktiviteten av en eller flere spesifikke helikaser. Målsykdommer inkluderer virale, bakterielle eller fungale infeksjoner, metabolsk sykdom, genetisk sykdom, cellevekst og regulatoriske forstyrrelser, slik som neoplasmia, inflammasjon, hypersensitivitet osv. Målsykdommene kan være lidelser hos planter, spesielt jordbruksavlinger, eller dyr, spesielt budskap, husdyr og mennesker.
De forskjellige aspektene av oppfinnelsen vil bli forklart i mer detalj i de følgende seksjonene. Denne organiseringen i forskjellige seksjoner har til hensikt å lette forståelsen av oppfinnen.
Definisjoner
De følgende definerte uttrykkene er brukt gjennom den foreliggende spesifikasjon, og skulle være en hjelp i å forstå målet og anvendelsen av den foreliggende oppfinnelsen.
I en spesifikk utførelsesform, betyr uttrykket "ca." eller "tilnærmet" innen 20%, helst innen 10%, og mer ønskelig innen 5% av en gitt verdi eller område.
Som brukt her, betyr artiklene "en" og "ett" en eller flere; følgelig er "en helikase" ment å inkludere analyser som involverer en eller flere helikaser, slik som samtidig screeninger for nemmere av flere helikaser.
En "nukleinsyre" er en polymer forbindelse som omfatter kovalente koblede subenheter som kalles nukleotider. Nukeleinsyre inkluderer polyribolykleinsyre (RNA) og polydeoksyribonukleinsyre (DNA), som begge kan være enkelttrådete eller dobbelttrådete. DNA inkluderer cDNA, genomisk DNA, syntetisk DNA, og halvsyntetisk DNA.
Et "nukleinsyremolekyl" referer seg til fosfatester polymerformen til ribonukleosider (adenosin, guanosin, uridin eller cytidin; "RNA-molekyler") eller deoksyribonukeosider (deoksyadenosin, deoskyguanosin, deoksytymindin eller deoksycytidin; "DNA-molekyler"), eller enhver fosforester analoger derav, slik som fosforotioater og tioestere, i enten enkelttrådig form eller en dobbelttrådet heliks. Dobbelttrådet DNA-DNA, DNA-RNA og RNA-RNA helikser er mulige. Utrykket nukleinsyremolekyl, og spesielt DNA- eller RNA-molekyl, refererer seg bare til primær- og sekundærstrukturen av molekylet, og begrenser det ikke til noen spesielle tertiære former. Således inkluderer dette uttrykket dobbelttrådet DNA funnet, inter alia, i lineære eller sirkulære DNA-molekyler (for eksempel restriksjonsfragmenter), plasmider, og kromosomer. Når strukturen av spesielle dobbelttrådete DNA-molekyler diskuteres, kan sekvenser bli beskrevet heri ifølge normale konvensjoner ved å gi sekvensen bare i 5' til 3' retning langs den ikke transkriberte tråden av DNA (for eksempel tråden som har en sekvens homolog til mRNA). Et "rekombinant DNA-molekyl" er et DNA-molekyl som har gjennomgått en molekylær biologisk manipulering.
Et nukleinsyremolekyl er "i stand til å hybridisere" til et annet nukleinsyremolekyl, slik som et oligonukleotid, et cDNA, genomisk DNA, eller RNA, når en enkelttrådet form av nukleotinsyremolekylet kan middelet til det andre nukleinsyremolekylet under passende betingelser med hensyn til temperatur og ionestyrken i løsningen. Betingelsene for temperatur og ionestyrke bestemmer "stringensen" til hybridiseringen. Lave stringenshybridiseringsbetingelser korresponderer til en Tm på 55°, for eksempel, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,25% melk, og ingen formamid; eller 30% formaid, 5x SSC, 0,5% SDA). Moderate stringente hybridiseringsbetingelser korresponderer til en høyere Tm, for eksempel, 40% formamid, med 5x eller 6x SCC. Høy stringenshybridiseringsbetingelser responderer til den høyeste Tm, for eksempel, 50% formamid, 5x eller 6x SCC. Hybridisering krever at de to nukleinsyrene inneholder komplementære sekvenser, selv om, avhengig av stringensen på hybridiseringen, det er mulig med mismatcher mellom basene. Den passende stringensen for hybridisering av nukleinsyrer avhenger av lengden av nukelinsyrene og graden av komplementering, variabler som er velkjent i fagfeltet. Jo større graden av likhet eller homologi mellom to nukleotidsekvenser, jo større er Tm-verdien for nukleinsyrehybridene som har de sekvensene. Den relative stabilitet (som korresponderer til høyere Tm) til nukleinsyrehybridiseringer minker i følgende rekkefølge: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. For hybrider som har mer enn 100 nukleotider i lengde, er det utledet likninger for å kalkulere Tm (se Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, annen utgave (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 9.50-0.51). For hybridiseringer med kortere nukleinsyrer, for eksempel, oligonukleotider, blir posisjonene for mismatchene mer viktig, og oligonukleotidets lengde bestemmer dets spesifisitet (se Sambrook et al., 11.7-11.8). Helst er minimumslengden for en nukleinsyre som er i stand til å hybridisere minst ca. 10 nukleotider; helst er den minst ca. 15 nukleotider; og mest ønskelig er lengden minst ca. 20 nukleotider.
Som brukt her refererer uttrykket "oligonukleotid" seg til en nukleinsyre, generelt med minst 18 nukleotider, som er i stand til å hybridisere til en komplementær nukleinsyre. Oligonukleotider kan merkes, for eksempel med P-nukleotider eller nukleotider som en merking, slik som biotin eller rutheiumchelat, er blitt kovalent konjugert til. Generelt lages oligonukleotider syntetisk, mest ønskelig på en nukleinsyres syntesemaskin. følgelig kan oligonukleotider lages med ikke naturlig forekommende fosfoester analogbindinger, slik som tioesterbindinger osv.
"Avidin" er men å inkludere ethvert protein eller polypeptid som er i stand til med høy affinitet å bindes til biotin. Streptavidin er et eksempel på avidin.
En "helikase" er ethvert protein eller polypeptid som har evnen til å opptvinne (dehybridisere) en dupleks med komplementære nukleinsyrer eller nukleinsyremolekyler.
Helikaseanalvser
Fremgangsmåtene som er definert ved den foreliggende oppfinnelse involverer å danne en blanding av en første nukleinsyre som omfatter en
elektrokjemiluminescensmarkør og hybridisert til en komplementær annen nukleinsyre. De hybridiserte første og andre nukleinsyrene kan være RNA eller DNA, lineært eller sirkulært, avhengig av spesifisiteten til den gjeldende helikasen. I tillegg, kan andre nukleinsyrer eller nukleinsyremolekyler eller strukturelle analoger være substituert så lenge de tilveiebringer et aktivt substrat for den gjeldende helikaseaktiviteten. Nukleinsyrene eller nukleinsyremolekylene kan være av enhver lengde som er medgjørlig for analysebetingelsene og kravene. For eksempel, for å sikre
helikasesubstratspesifisitet og for å minimalisere ikke spesifikk renaturering trengs en minimal region med komplementaritet mellom den første og andre av nukleinsyrene, typisk minst ca. 12, mer typisk minst ca. 18 og helst minst ca. 24 kontinuerlige basepar. Størrelsene blir valgt for å fasilitere analysen og tilveiebringe statistisk signifikante analyseresesultater; ofte vil størrelsene være forskjellige med minst en eller to styrkeordner. Generelt er de optimale lengdene lette å bestemme empirisk.
Nukleinsyrene kan være av enhver sekvens som tilveiebringer et passende substrat for de gjeldende helikasene. Nukleinsyrene kan være komplementære over hele lengden av minst en av nukleinsyrene eller det kan være regioner av ikke-komplementaritet 5' og/eller 3' for den komplementære region. Å introdusere disse 5' og/eller 3' ikke-komplementære regionene tilveiebringer molekylære gafler om vil gi bedre substrater for noen helikaser. Generelt tilveiebringer passende replikerte vektorer for eksempel fag, eller restriksjonsfragmenter av dem, en billig kilde til nukleinsyrer. Analysene er generelt kompatible med nærværet av DNA-bindende protein, slik som histoner. Det er ofte en fordel å inkludere en rekke potensielle substrater, for eksempel dobbelttrådete nukleinsyrer av forskjellig størrelse, sekvens, proteinkompleksitet, osv. for å øke sannsynligheten for å detektere substratsensitive helikaser.
Den første nukleinsyren omfatter en detekterbar
elektrokjemiluniescensmerking. Elektrokjemiluniescens er lys som lages når lav volt brukes på en elektrode, dermed trigges en syklisk oksidasjon og reduksjonsreaksjon av merkingen. Enhver elektroschemiluniescensmerking som er i stand til en slik syklisk oksidasjon/reduksjon og lysgenerering kan brukes ifølge den foreliggende oppfinnelse. Den foretrukne merkingen er rutheniummetallion bundet i en "chelat" av tris-(bipyridin). Spesifikke elektrokjemiluminescensmerkinger for DNA er blitt utviklet (Kenten et al., 1991, Clin. Chem. 37:1626; Kenten et al., 1992, Clin. Chem. 38:873; "Origen" label, "Origen" fosforamidit og TAG-fosforamidit, IGEN Inc., Rockville, MD) og er de mest foretrukne for den foreliggende oppfinnelse.
Enhver patogen helikase (for eksempel enhver helikase som er i stand til å opptre skadelig til en vertscelle eller organisme) kan analyseres ifølge den foreliggende oppfinnelse. Hurtigvoksende celler (for eksempel i neoplasia) kan være mål for nemmere av humane helikaser, spesielt replikative helikaser. I tillegg blir patogene selektive eller spesifikke helikaser brukt for å identifisere farmakologiske terapeutika for behandling av infeksiøs sykdom. Fungale, virale, bakterielle og parasitthelikaser spesielt, tilveiebringer medisinske preserende mål for å identifisere hemmere med foreliggende fremgangsmåter. Alternativt, kan et flertall av helikaser eller panel som omfatter et preselektert område av forskjellige helikaser brukes for å maksimere målet av analysen.
Foretrukne patogene helikaser er derivert fra medisinske signifikante infeksiøse fungi, slik som aspergillus-, candiaarter; bakterier slik som staphyloococci (for eksempel aureus). streptococci (for eksempel pneumoniae), clostridia (for eksempel perfringens), neisseria (for eksempel gonorrhoeae), enterobacteriaceae (for eksempel coli), heliobacter (for eksempel pylori), vibrio (f.eks cholerae), capylobacter (for eksempel jejuni), pseudomonas (for eksempel aeruginosa), haemophilus (for eksempel influenzae), bordetella (for eksempel pertussis), mycoplasma (for eksempel penumonia), ureaplasma (for eksempel urealyticum), legionella (for eksempel pneumophila), spirochetes (for eksempel treponema, leptospira og borrelia), mukcobacteria (for eksempel tuberculosis, smegmatis), actinomycies (for eksempel (israelii), nocardia (for eksempel asteroider), chlamydia (for eksempel trachomatis), rickettsia, coxiella, ehrilichia, rochalimaea, brucella, yersinia, fracisella, og pasteurella; protozoa slik som sporozola (for eksempel plasmodia), rhizopods (for eksempel entamoeba) og flagellater (trypanosoma, leishmania, trichomonas giardia, etc); og virus slik som (+) RNA-virus (eksemplerer inkluderer picornavirus, for eksempel polio; togaviruses, for eksempel rubella; flavivimses, for eksempel HCV; og coronavirus), (-)nRNA-virus (eksempler inkuderer rabdovirus, for eksempel VSV; paramyxovimer, for eksempel RSV; ortomyxovimser, for eksempel influensa; bunyavirus og arenavirus). dsNDA-virus (reovirus, for eksempel), RNA- til DNA-virus, for eksempel retrovirus, for eksempel HIV, og visse DNA- til RNA-virus slik som hepatitt-B-virus.
Helikasen kan renses fra en naturlig kilde eller kan være rekombinant, helikasen er vanligvis tilveiebrakt i minst en delvis renset form. Bare den del av helikasen som er tilstrekkelig for helikaseaktivitet kan brukes i den foreliggende analysen. Deler som er i stand til å gi den nødvendige bindingsspesifisiteten og affiniteten er lette å identifisere og produsere av fagfolk ved å bruke generelle molekylære og biokjemiske metoder, se for eksempel Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. utgave red., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor), Current Protocols in Molecular Biology (red. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY, N.Y., 1992) eller det som ellers er kjent i fagfeltet. Fremgangsmetodene i den foreliggende oppfinnelse krever å få tak i dehybridiserte første nukleinsyre som produseres av helikaseaktiviteten som er til stede i analysen. Enhver metode for å få fatt i dehybridiserte første nukleinsyre kan brukes. I en foretrukket serie av trinn blir dehybridisert første og andre nukleinsyrer inkubert med en tredje nukleinsyre, komplementær til første nukleinsyre og omfatter en kapringsligand, under betingelser hvor første og tredje nukleinsyre kan hybridisere. Deretter kan de hybridiserte første og tredje nukleinsyrene fanges med en kapringsreseptor som bindes til kapringsliganden. Kapringsreseptoren kan være på overflaten av magnetiske kuler for å direkte fasilitere elektrokjemiluminescensdeteksjon.
Analyseprosessen i den foreliggende oppfinnelse kan brukes sammen med enhver fangen ligandreseptorkombinasjon eller system som spesifikt fanger den første nukleinsyre uten å affisere elektrokjemiluminescensdeteksjonen. Eksempler på passende ligandreseptorkombinasjoner inkluderer antistoffer og deres korresponderende antigener. Et annet ligandreseptorsystem kan komponeres av protein A og immunoglobuliner, eller en Fc-del av de. Tilleggsfangingssystemer med som den foreliggende oppfinnelse kan brukes med inkluderer: (1) lektineroligosakkarider eller glykoproteiner; (2) biotinavidin; (3) hormonreseptorhormon; (4) enzymsubstrat eller kofaktor; (5) RNA-DNA; og (6) DNA-DNA. Det må forstås at i den foreliggende oppfinnelse kan det ene eller andre element tjene som ligand eller reseptor. I en foretrukket utførelsesform, er fangingsliganden biotin og fangingsreseptoren avidin. Tillagingen av biotinylerte oligonukleotider og av avidinbelagte magnetiske kuler er beskrevet i Kenten el al., 1991 ( Clin. Chem. 37:1626 og Kenten et al., 1992 ( Clin. Chem. 38:873).
Den foreliggende oppfinnelse er spesielt passende for å screene kandidatmidler for evnen de har til å modulere helikaseaktiviteten, spesielt hemmende aktivitet. Oppfinnelsen er passende for høy-"throughput" medikamenscreening av et bibliotek med kandidatmidler. Bibliotekderiverte kandidatmidler omfatter flere kjemiske klasser, selv om de typisk er organiske forbindelser. Bibliotekene kan omfatte syntetiske og/eller naturlig deriverte forbindelser. For eksempel er flere måter tilgjengelige for tilfeldig og direkte syntese av en rekke forskjellige organiske forbindelser og biomolekyler, inkludert ekspresjon av randomiserte oligonukleotider. Alternativt er biblioteker av naturlige forbindelser i form av bakterielle-, fungale-, plante- og dyreekstrakter tilgjengelige eller kan lett produseres. I tillegg kan naturlige og syntetisk produserte biblioteker og forbindelser lett modifiseres gjennom konvensjonelle kjemiske, fysikalske og biokjemiske måter. I tillegg, kan kjente farmakologiske midler utsettes for direkte eller tilfeldige modifikasjoner, slik som acylering, alkylering, esterifisering, amidifisering, osv., for å produsere strukturelle analoger. Middelet blir tilveiebrakt i standard seriefortynninger eller i en mengde som er bestemt ved analogi til kjente modulatorer.
Typisk inkluderer de foreliggende analyser vanligvis tilleggsreagenser, slik som salter, buffere, osv., for å fasilitere eller maksimere helikaseaktivitet. Reagenser som reduserer ikke spesifikk eller bakgrunnsdenaturering eller på annen måte øker effektiviteten av analysen, slik som proteaseinhibitorer, nukleaseinhibitorer, antimikrobiellemidler, enkelttrådet DNA-bindende protein, osv. kan også brukes.
Den foreliggende oppfinnelse kan bedre forstås ved referanse til de følgende eksemplene, som er tilveiebrakt for å eksemplifisere oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Generelle molekylære biologiske teknikker
Fremgangsmetoder som tradisjonelt brukes i molekylærbiologi, slik som preparative ekstraksjoner av plasmid DNA, sentrifugering av plasmid DNA i cesiumkloridgradient, agarose- eller acrylamidgeelektroforeser, rensing av DNA-fragmenter ved elektroeluering, proteinekstraksjon med fenol eller fenol/kloroform, etanol eller isopropanolpresipitering av DNA i et saltmedium, transformering i Escherichia coli og liknende, er velkjente for en person som er trenet i fagfeltet og som er utførlig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor., 1982 (2<nd> utgave 1989); Ausubel F.M. et al. (red), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Konvensjonelle kloningsverktøy inkluderer pBR322 og pUC type plasmider og fag i serien M13. Disse kan skaffes til veie kommersielt (Bethesda Research Laboratories eller New England Biolabs).
For ligering, kan DNA-fragmentene separeres ifølge deres størrelse ved agarose-eller acrylamidegelelektroforese, ekstrahert med fenol eller med en fenol/kloroformblanding, presipitert med etanol og så inkubert i nærvær av fag T4 DNA-ligase (Biolabs) ifølge produsentens anbefalinger.
Innfylling av de 5' utstikkende enene kan utføres med Klenow-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase I (Biolabs) ifølge produsentens speifikasjoner. Ødeleggelse av 3<* >utsikkende ender blir utført i nærvær av fag T4 DNA-polymerase (Biolabs) brukt ifølge produsentens anbefalinger. Ødeleggelse av 5' utstikkende ender utføres med en kontrollert behandling med Sl-nuklease. ;Mutagenese utført in vitro ved syntetiske oligodeoksynukleotider kan utføres ifølge fremgangsmåten utviklet av Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] ved å bruket kittet som distribueres av Amersham. ;Den enzymatiske amplifikasjonen av DNA-fragmentene ved PCR [Polymerasecatalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth Enzym 155 (1987) 335-350 teknikken kan utføres ved å bruke en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) ifølge produsentens spesifikasjoner. ;Verifisering av nukleotidsekvensene kan utføres etter fremgangsmåten utviklet av Sanger et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467] ved å bruke kittet som distribueres av Amersham. ;Plasmid-DNA kan renses med qiagen plasmidrensingssystem utført ifølge produsentens instruksjoner. ;Eksempel 1: tradisjonell helikaseanalyse ;Et 60 basepar oligonukleotid (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT ;TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3'; SEQ ID NO:l) blir ;merket med <32>P ved å bruke T4-polynukleotidkinase og så hybridisert til et komplimentært umerket 60 basepar oligonukleotid. Det hybridiserte substrat og forskjellige mengder av DnaB-helikase [Reha-Krantz et al. J. Biol. Chem. 253 (1978) 4043-4050: LeBowitz et al. J. Biol Chem. 261 (1986) 4738-4748] ble blandet i analysebuffer (400 mM Hepes pH 7,4, 5mM DTT, 2 mg/ml BSA, 12,5 mM MgCl2 og 6,25 mM ATP) og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å sette til 0,5M EDTA, og så ble 2,5 mg med proteinase K tilsatt til hver reaksjon for å frigjøre ethvert gjenværende oligonukleotid som er bundet til DnaB helikase. Prøvene ble så kjørt på en 15% TBE-gel. De enkle og doble trådene av DNA ble skilt ved autoradiografi. ;Ved å bruke den tradisjonelle helikaseanalysen, ble E. coli DnaB i stand til å dehybridisere duplekssubstratene for å gi enkle tråder av DNA (figur 1). For å observere enkelttrådet DNA frigjort fra dupleks DNA etter denne fremgangsmåten, trengs imidlertid minst 0,75 ug av DnaB for å fullstendig opptvinne 175 fmol av dupleks DNA-substratene. Derfor er denne tilnærmingsmåten tidskrevenede og sensitiviteten er lav. ;Eksempel 2; helikase T<3>H1 skintillasionsproksimitetsanalvse') enzvmanalvse ;Skintallasjonsproksimitetsanalye /SPA) er beskrevet i figur 2. Denne analysen gjør bruk av et <3>H-oligonukleotid som er annealt til et enkeltrådet Ml 3 DNA (M13ssDNA). Som et resultat av helikaseaktivitet, blir 3H-oligonukleotidet dehybridisert fra M13ssDNA. Det frigjorte oligonukleotidet kan så anneale til et biotinylert annet oligonukleotid. Dette komplekset blir fanget av streptavidinbelagte SPA-kuler. På grunn av sin tette nærhet til SPA-kulene, er komplekset i stand til å stimulere frigjøring av lysglimt innen kulene kommer noe som resulterer i et øket signal. De merkede oligonukleotidene som forblir bundet til M13ssDNA frie løsning stimulerer ikke frigjøring av lysglimt. ;Et SPA-helikaseanalysekitt ble kjøpt fra Amersham Life Science. Analysen ble utført ifølge de tilveiebrakte instruksjonene med små modifikasjoner som beskrevet under. Et [<3>H]-merket oligonukleotid blir annealet med et M13 enkelttrådet DNA (M13ssDNA) templat for å danne partielle duplekssubstrater. DnaB-helikasen og duplekssubstratene ble blandet i analysebufferen og inkubert ved 37°C i 45 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette EDTA. Et biotinylert komplementært oligonukleotid blir så annealet til det radioaktivt merkede oligonukleotidet som frigjøres fra M13ssDNA. Komplekset fanges av streptavidinbelagte SPA-kuler ved å inkubere i romtemperatur i 15 minutter , og det radioaktive signalet blir talt. ;Titrering av DnaB-helikase (figur 3) indikerer at optimal aktivitet kan fås ved å bruke 0,16 ug av DnaB-helikase. Helikaseaktiviteten minker når mindre enn 0,16 ug med DnaB blir brukt, noe som tyder på at det ikke er nok helikase til å opptvinne de duplekse DNA. Når mer enn 0,16 fig av DnaB-helikase blir brukt blir hver reaksjon, minker imidlertid også helikaseaktiviteten. Dette kan være et resultat fra ikke-spesifikk binding av overskuddhelikase til enkelttrådete DNA som frigjøres fra dupleks DNA-substratene, og dermed hindres de komplementære, biotinylerte oligonukleotidene fra å binde disse enkelttrådete DNA-produktene. Under optimale analysebetingelser, er det beste signalet til støy i denne analysen ca. 10 ganger (se figur 4). DnaB-helikaseaktiviteten er 95% av den maksimalt mulige aktiviteten, bestemt ved signalet som lages fra produktene som frigjøres fra kokte, denaturerte dupleks DNA-substrater. Mens denne fremgangsmåten er rask og tilbyr muligheten for å måle et stort antall prøver, er den ikke fordelaktig på grunn av høye kostnader og at det lages signifikant radioaktivt avfall. ;Eksempel 3: fluorescerende guenchinghelikaseanalvse ;En fluorescerende guenchinganalyse er studert (figur 5). I denne analysen er europium- og rhodaminmerkede prober til stede som en fluorescerende guenchet dupleks. Ved å tilsette en helikase, dehybridiserer dupleks DNA-substratene for å gi to enkelttråder av DNA. Oligonukleotidene som er merket med Lance Europium frigjort fra dupleks substratene gir opphav til tidsoppløste fluorescerende signaler. ;Et 60 basepar oligonukleotid (5'-GT GAC GAT CCC GCA AAA GCG GCC ;TTT AAC TCC CTG CAA GCC TCA GCG ACC GAA TAT ATC G-3<1>: SEQ ID ;NO:2) ;ble merket med Lance-Europium ved sin 5' ende. Et oligonukleotid (5'-T TTT TTT TTT ;TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ;CA.-3'; SEQ ID NO: 3) som har en region komplementær med SEQ ID NO:2 ble merket med rhodamin ved sin 5' ende. Disse Eu-merkede og Rh-merkede probene ble blandet i et forhold på 1:2 og hybridisert for å danne Y-formede substrater. Forskjellige mengder DnaB-helikase og 50 gmol av de fluorescensmerkede substratene ble blandet i analysebuffer og inkubert ved 37°C i 45 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette EDTA. De fluorescerende signalene som ble laget av Eu-oligonukleotidene frigjort fra dupleks DNA-substratene ble så nedtegnet. ;Titrering av DnaB-helikase (figur 6) indikerer at maksimal aktivitet trenger minst 1,25 ug av DnaB-helikase, og signalet til støy er ca. 4 ganger. Sammen viser disse resultatene at sensitiviteten av denne tilnærmingsmåten er lav. ;Eksempel 4: Elektrokiemiluminescenshelikaseanalvse ;En elektrokjemiluminescens (ECL)-helikaseanalyse er vist i figur 7. Korte oligonukleotider blir merket med et rutheniummetallchelat og annealet med Ml3 enkelttrådete DNA. Når det tilsettes helikase, blir de merkede oligonukleotidene opptvinnet fra dupleks DNA, og tilgjengelige for å anneale til et annet kompelementært oligonukleotid merket med biotin. De resulterende kompleksene blir formet med streptavidinbelagte størrelseskuler. Kule/komplekset blir ført gjennom en flowcelle og fanget ved en elektrode av et magnetisk felt. Volt blir brukt på elektroden og ECL-signalene som kommer fra rutheniummerkingen blir målt ved å bruke en elektrokjemiluminescensdetektor, slik som en Origen Analyzer (IGEN Inc., Rockville, ;MD). ;Et 60 baseparoligonukeotid (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT ;TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3' SEQ ID NO: 4 eller et 30 baseparoligonukleotid (5'-GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3' SEQ ID NO:5) blir merket med ruthenium i den 5'-enden (Kenten et al., Clin. Chem. 38 ;(1992) 873-879) og resuspendert i TE-buffer (10 mM Tris HC1,1 mM EDTA, pH=7,4) til en sluttstokk-konsentrasjon på 25 pmol/uL. M13 mpl8ssDNA blir løst i TE ved en konsentrasjon på 0,183 pmol/mL. Like konsentrasjoner av M13mpl8ssDNA og oligonukleotider blir blandet i hybridiseirngsbuffer (10 mM Tris HC1, 0,3 M NaCl, 30mM Na sitrat, pH 8,5). Løsningen blir så inkubert ved 100°C i 2 minutter, og så nedkjølt til romtemperatur. Tjuefem frnol av duplekssubstratene (Ml3 ssDNA annealet med 30 eller 60 oligonukleotdis) ble blandet med 25ng av E. coli DnaB helikasebuffer (40 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA, 8 mM MgCl2, 5 mM ATP). Reaksjonsblandingen blir inkubert ved 37°C i 45 minutter. Til denne reaksjonen blir det tilsatt 125 frnol av et biotinylert oligonukleotid (5'-GGT GAC GAT CCC GCA AAA GCG GCC TTT AAC AGC-3<*>; SEQ ID NO:6) komplementært til SEQ ID NO:4 og 5 i 0,5M EDTA, og reaksjonen blir inkubert ved 37°C i 15 minutter. Biotynilering blir utført ved å bruke "Biotin-ON" fosforamidatkittet fra Clontech (PT1402-1) ved å bruke prosedyren tilveiebrakt med kittet. Adeninet i posisjon 31 innen SEQ ID NO:6 mottok biotinmerkingen. Til slutt blir 20 ug av streptavidinmagnetiske kuler i et totalvolum på 0,25 ml TE-buffer tilsatt, og løsningen blir inkubert i 15 minutter med vortexing. ECL-signalene blir nedtegnet ved å bruke en Origen Analyser (IGJEN In., Rockville, MD) ved å bruke betingelser som er foreslått av produsenten.
Dataene fra titreringen av DnaB helikase indikerer at bare 25ng av enzymet trengs for Dehybridisering av 22 frnol duplekssubstrater, og at signalet til støy er ca.. 30-ganger (se figur 8). Tileggseksperimenter viser at, generelt så er signalet til støy minst 30-ganger, og så høyt som 40-ganger. Denne fremgangsmåte for deteksjon viser signifikant sensitivitet og reproduktivitet sammenliknet til alle de tidligere beskrevne fremgangsmåtene (se tabell 1).
Tabell 1: Oppsummering av SPA, fluorescerende quenching og ECL-analyser
Sensitiviteten til elektrokjemiluminescensanalysen er minst 7-ganger større enn den fluorescerende quenchinganalysen og 3 ganger over SPA-analysen. Totalt er sensitiviteten ca. 18-ganger høyere enn SPA-analysen, og enda større når det sammenliknes med fluorescensanalysen. Mengdeenzym som trengs for elektrokjemiluniescensdeteksjon minker 6-ganger over WPA-analysen og 50-ganger over quenchinganalysen. Substratene som brukes i elektrokjemiluminescensanalysen er redusert 2-ganger sammenliknet med både SPA og quenchinganalysene. Elektrokjemiluniescensanalysen gir en hurtig og sensitiv deteksjon av helikaseaktiviteten, og kan lett formateres for høy kapasitets-screening. Tilnærmingsmåten er generisk, og er passende for ethvert enzym som har helikaseaktivitet.
Claims (23)
1.
EleklTokjemiluminescensanalysefremgangsmåte for å detektere helikaseaktivitet i en prøve, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter (a) å kombinere prøven med en første nukleinsyre som omfatter en elektrokjemiluminescensmarkør og hybridisert til en komplementær annen nukleinsyre; (b) å inkubere prøven og hybriserte nukleinsyrer fra trinn (a) under betingelser hvor helikase som er til stede i prøven kan dehybridisere første og andre nukleinsyrer; (c) å fange dehybridiserte første nukleinsyre; og (d) å måle elektrokjemiluminescens fra den fangede første nukleinsyren.
2.
Elektrokjemiluminescensanalysen ifølge krav 1, karakterisert ved at helikasen er en human eller patogen helikase.
3.
Elektrokjemiluminescensanalysen ifølge krav 2, karakterisert ved at den patogene helikasen er en fungal, viral, bakteriell eller parasitthelikase.
4.
Elektrokjemi luninescensanalysen ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter mellom trinnene (b) og (c),
(/') å inkubere de dehybridiserte nukleinsyrer med en tredje nukleinsyre komplementært til den første nukleinsyren og som omfatter en kapringsligand, under betingelser hvor de første og tredje nukleinsyrene kan hybridisere; og (h) å inkubere de hybridiserte første og tredje nukleinsyrene fra trinn ( i) med en kapringsreseptor som binder seg til kapringsliganden.
5.
Elektrokjemiluminescensanalysen ifølge krav 4, karakterisert ved at kapringsliganden er biotin og kapringsreseptoren er avidin.
6.
Elektrokjemiluminescensanalysen ifølge krav 4, karakterisert ved at kapringsreseptoren er på overflaten av magnetiske kuler.
7.
Elektrokjemiluminescensanalysen ifølge krav 6, karakterisert ved at kapringsliganden er biotin og karpringsreseptoren er avidin.
8.
Elektrokjemiluminescensanalysen ifølge krav 1, karakterisert ved at den elektrokjemiluminescensmarkøren er en rutheniumchelat.
9.
Fremgangsmåte for å detektere i en prøve et middel som modulerer helikaseaktiviteten i en prøve, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter (a) å kombinere prøven, en helikase og et første nukleinsyre som omfatter en elektrokjemiluminescensmarkør og hybridisert til en komplementær andre nukleinsyre, og dermed danne en blanding; (b) å inkubere blandingen fra trinn (a) under betingelser hvor helikasen kan dehybridisere de første og andre nukleinsyrene i fravær av prøven; (c) å fange dehybridiserte første nukleinsyre; og (d) å måle elektrokjemiluminescens fra den fangede første nukleinsyren.
10.
Fremgangsmåten ifølge krav 9, karakterisert ved at middelet er hemmer av helikaseaktivitet.
11.
Fremgangsmåten ifølge krav 9, karakterisert ved at helikasen er en human eller patogen helikase.
12.
Fremgangsmåten ifølge krav 11, karakterisert ved at den patogene helikasen er en fungal, viral, bakteriell eller parasitthelikase.
13.
Fremgangsmåten ifølge krav 9, karakterisert ved at den omfatter mellom trinnene (b) og (c), (i) å inkubere de dehybridiserte nukleinsyrer med en tredje nukleinsyre komplementært til den første nukleinsyren og som omfatter en kapringsligand, under betingelser hvor de første og tredje nukleinsyrene kan hybridisere; og
(») å inkubere de hybridiserte første og tredje nukleinsyrene fra trinn ( i) med en kapringsreseptor som bindes til kapringsliganden.
14.
Fremgangsmåten ifølge krav 13, karakterisert ved at kapringsliganden er biotin og kapringsresetoren er avidin.
15.
Fremgangsmåten ifølge krav 13, karakterisert ved at kapringsreseptoren er på overflaten av magnetiske kuler.
16.
Fremgangsmåten ifølge krav 15, karakterisert ved at kapringsliganden er biotin og kapringsreseptoren er avidin.
17.
Fremgangsmåten ifølge krav 9, karakterisert ved at elektrokjemiluminescensmarkøren er en rutheniumchelat.
18.
Kitt for elektrokjemiluminescensdeteksjon av helikaseaktivitet, karakterisert ved at den omfatter (a) en første nukleinsyre som omfatter en elektrokjemiluminescensmarkør; (b) en andre nukleinsyre komplementær til første nukleinsyre; (c) en helikase.
19.
Kittet ifølge krav 18, karakterisert ved at den første nukleinsyren er hybridisert til den andre nukleinsyren.
20.
Kittet ifølge krav 18, karakterisert ved at det videre omfatter en tredj e nukleinsyre komplementær til den første nukleinsyre og som omfatter en kapringsligand.
21.
Kittet ifølge krav 20, karakterisert ved at det videre omfatter en kapringsreseptor.
22.
Kittet ifølge krav 21, karakterisert ved at kapringsreseptoren er på overflaten av magnetiske kuler.
23.
Kittet ifølge krav 22, karakterisert ved at kapringsliganden er biotin og kapringsreseptoren er avidin.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/410,960 US6448004B1 (en) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Electrochemiluminescence helicase assay |
| PCT/US2000/027453 WO2001025487A2 (en) | 1999-10-05 | 2000-10-05 | Electrochemiluminescence helicase assay |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20021585D0 NO20021585D0 (no) | 2002-04-04 |
| NO20021585L NO20021585L (no) | 2002-06-04 |
| NO328070B1 true NO328070B1 (no) | 2009-11-23 |
Family
ID=23626978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20021585A NO328070B1 (no) | 1999-10-05 | 2002-04-04 | ECL-analyse for deteksjon av helikaseaktivitet, fremgangsmate for a identifisere et middel som modulerer helikaseaktivitet samt kit for ECL-deteksjon av helikaseaktivitet. |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6448004B1 (no) |
| EP (1) | EP1222311B1 (no) |
| JP (1) | JP2003511660A (no) |
| KR (1) | KR100729550B1 (no) |
| AT (1) | ATE334227T1 (no) |
| AU (1) | AU783653B2 (no) |
| BR (1) | BR0014507A (no) |
| CA (1) | CA2386642C (no) |
| DE (1) | DE60029607T2 (no) |
| DK (1) | DK1222311T3 (no) |
| ES (1) | ES2265989T3 (no) |
| HK (1) | HK1046934B (no) |
| IL (2) | IL148941A0 (no) |
| MX (1) | MXPA02003385A (no) |
| NO (1) | NO328070B1 (no) |
| NZ (1) | NZ518010A (no) |
| PT (1) | PT1222311E (no) |
| WO (1) | WO2001025487A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200202331B (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6448004B1 (en) * | 1999-10-05 | 2002-09-10 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Electrochemiluminescence helicase assay |
| US20050136439A1 (en) * | 2003-09-12 | 2005-06-23 | North Carolina State University | Novel methods of inorganic compound discovery and synthesis |
| EP2163653B1 (en) * | 2003-11-10 | 2013-03-27 | Geneohm Sciences, Inc. | Nucleic acid detection method having increased sensitivity |
| ES2371664T3 (es) * | 2005-06-03 | 2012-01-09 | Beacon Biotechnology Llc | Ensayo de ácidos nucleicos de proximidad de quimioluminiscencia. |
| US20100092960A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-04-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Helicase-assisted sequencing with molecular beacons |
| US8628914B2 (en) * | 2010-05-26 | 2014-01-14 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Quantitative helicase assay |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4568649A (en) | 1983-02-22 | 1986-02-04 | Immunex Corporation | Immediate ligand detection assay |
| ZA929319B (en) | 1991-12-11 | 1993-05-24 | Igen Inc | Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer. |
| AU700055B2 (en) | 1993-09-22 | 1998-12-17 | Bioveris Corporation | Rapid nucleic acid assay |
| US5747247A (en) | 1994-07-25 | 1998-05-05 | The Regents Of The University Of California | Spectroscopic helicase assay |
| US5705344A (en) | 1996-03-14 | 1998-01-06 | Tularik, Inc. | High-throughput screening assay for inhibitors of nucleic acid helicases |
| US6448004B1 (en) * | 1999-10-05 | 2002-09-10 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Electrochemiluminescence helicase assay |
-
1999
- 1999-10-05 US US09/410,960 patent/US6448004B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-10-05 IL IL14894100A patent/IL148941A0/xx active IP Right Grant
- 2000-10-05 ES ES00968716T patent/ES2265989T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 PT PT00968716T patent/PT1222311E/pt unknown
- 2000-10-05 WO PCT/US2000/027453 patent/WO2001025487A2/en active IP Right Grant
- 2000-10-05 CA CA002386642A patent/CA2386642C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-05 NZ NZ518010A patent/NZ518010A/en unknown
- 2000-10-05 BR BR0014507-6A patent/BR0014507A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-10-05 AU AU78589/00A patent/AU783653B2/en not_active Ceased
- 2000-10-05 MX MXPA02003385A patent/MXPA02003385A/es active IP Right Grant
- 2000-10-05 DK DK00968716T patent/DK1222311T3/da active
- 2000-10-05 DE DE60029607T patent/DE60029607T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 JP JP2001528637A patent/JP2003511660A/ja active Pending
- 2000-10-05 KR KR1020027004278A patent/KR100729550B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-10-05 EP EP00968716A patent/EP1222311B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 AT AT00968716T patent/ATE334227T1/de not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-03-22 ZA ZA200202331A patent/ZA200202331B/en unknown
- 2002-03-31 IL IL148941A patent/IL148941A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-04-04 NO NO20021585A patent/NO328070B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-06-28 US US10/187,212 patent/US7041451B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 HK HK02108268.6A patent/HK1046934B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1046934A1 (en) | 2003-01-30 |
| AU783653B2 (en) | 2005-11-17 |
| US6448004B1 (en) | 2002-09-10 |
| PT1222311E (pt) | 2006-10-31 |
| MXPA02003385A (es) | 2004-09-10 |
| WO2001025487A2 (en) | 2001-04-12 |
| DE60029607D1 (de) | 2006-09-07 |
| WO2001025487A3 (en) | 2001-12-13 |
| EP1222311A2 (en) | 2002-07-17 |
| HK1046934B (zh) | 2006-10-20 |
| NZ518010A (en) | 2003-05-30 |
| CA2386642A1 (en) | 2001-04-12 |
| JP2003511660A (ja) | 2003-03-25 |
| US7041451B2 (en) | 2006-05-09 |
| EP1222311B1 (en) | 2006-07-26 |
| BR0014507A (pt) | 2002-06-11 |
| KR100729550B1 (ko) | 2007-06-19 |
| IL148941A (en) | 2007-08-19 |
| ZA200202331B (en) | 2003-08-27 |
| US20020127549A1 (en) | 2002-09-12 |
| US20030032041A1 (en) | 2003-02-13 |
| CA2386642C (en) | 2007-05-29 |
| IL148941A0 (en) | 2002-09-12 |
| NO20021585L (no) | 2002-06-04 |
| ES2265989T3 (es) | 2007-03-01 |
| ATE334227T1 (de) | 2006-08-15 |
| DK1222311T3 (da) | 2006-11-06 |
| AU7858900A (en) | 2001-05-10 |
| KR20020059445A (ko) | 2002-07-12 |
| NO20021585D0 (no) | 2002-04-04 |
| DE60029607T2 (de) | 2007-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jiang et al. | Amplified detection of DNA ligase and polynucleotide kinase/phosphatase on the basis of enrichment of catalytic G-quadruplex DNAzyme by rolling circle amplification | |
| US9994894B2 (en) | Method and components for detecting nucleic acid chains | |
| EP2606148A1 (en) | Helicase dependent isothermal amplification using nicking enzymes | |
| KR20070011354A (ko) | 취약 ｘ염색체 증후군과 같은 ｓｔｒｐ의 검출 방법 | |
| US9845495B2 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
| US20080090238A1 (en) | Increased sensitivity of proximity ligation assays | |
| EP0763133A4 (en) | METHOD FOR DETECTION OF A TARGET NUCLEIC ACID | |
| JP2022145606A (ja) | 核酸の正確な並行定量のための高感度な方法 | |
| NO328070B1 (no) | ECL-analyse for deteksjon av helikaseaktivitet, fremgangsmate for a identifisere et middel som modulerer helikaseaktivitet samt kit for ECL-deteksjon av helikaseaktivitet. | |
| US20240011083A1 (en) | Looped primer and loop-de-loop method for detecting target nucleic acid | |
| US20210172009A1 (en) | Hooked probe, method for ligating nucleic acid and method for constructing sequencing library | |
| EP3601608A1 (en) | Quantification of ngs dna by adapter sequence | |
| WO2019053430A1 (en) | PHENOTYPING AND MONOMOLECULAR SEQUENCING OF NUCLEIC ACID MOLECULES | |
| US20230031670A1 (en) | Method and kit for detection of polynucleotide | |
| US20180245140A1 (en) | Kit and method for detecting single nucleotide polymorphism | |
| JP2017163920A (ja) | 核酸増幅法 | |
| WO2006051991A1 (ja) | 核酸の増幅および検出方法 | |
| Nikiforov et al. | Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores | |
| KR100318222B1 (ko) | 표적핵산의검출방법 | |
| JP2020096592A (ja) | 亜硝酸酸化細菌に結合する核酸分子並びに核酸分子を用いた亜硝酸酸化細菌の検出方法、検出キット及び検出試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |