CN114441772B - 用于检测细胞内能够与rna结合的靶分子的方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法和试剂。本发明基于CRISPR‑Cas9技术进行RNA免疫沉淀检测与RAN结合的靶分子。与传统体外转录RNA进行pulldown的实验方法相比，本发明使用细胞来源的RNA和细胞表达的蛋白，可在更接近细胞生理条件下同时分析RNA‑RNA和/或RNA‑蛋白质等之间的相互作用。另外，与传统RNA免疫沉淀技术相比，本发明具有可双向检测RNA‑蛋白质等相互作用的优势，能够节约时间、降低成本。

Description

用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法和试剂

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体地涉及检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法和试剂。

背景技术

成簇的规律性间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly InterspersedShort Palindromic Repeats，CRISPR)和CRISPR关联基因(CRISPR associated，Cas)组成的CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫防御体系。自2012年被发展应用以来，快速发展成为第三代基因编辑技术，以其操作简单快捷、成本低和编辑效率高等优势成为当今主流的基因编辑系统。其中由Cas9核酸内切酶组成的Ⅱ型CRISPR-Cas系统即CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。

CRISPR-Cas9的作用原理为crRNA和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的RNA复合物结构，即sgRNAscaffold，可以被Cas9蛋白识别并结合。在向导RNA(guideRNA, gRNA)的指引下靶向与gRNA碱基互补配对的目的基因。Cas9蛋白的HNH和RuvC结构域在切割识别基序PAM(protospacer adjacent motifs)上游第3个碱基处能够切割靶位点DNA的正负链，从而发生双链断裂(double-strand break，DSB)。细胞在通过非同源末端连接(nonhomologousendjoining，NHEJ)修复DSBs往往发生一至多个碱基的随机插入或缺失(insertions and/ordeletions，indels)，使基因读码框(openreading frame, ORF)发生改变，提前出现终止密码子，从而导致基因失活。

近年来，基于CRISPR-Cas9系统，研究者开发了多种基因操纵工具包括CRISPR-Cas9转录抑制，命名为CRISPR interference(CRISPRi)，参见Larson, et al., NatProtoc, 2013。CRISPR-Cas9转录激活，命名为CRISPRactivation(CRISPRa)。参见Bikard,et al., Nucleic Acids Res, 2013。CRISPR-Cas9表观基因组工程(CRISPR-Cas9epigenome engineering)。参见Kearns, et al., Nat Methods, 2015。

以上技术主要通过融合表达Cas9蛋白及其他影响基因转录调控的因子、DNA甲基化或组蛋白乙酰化酶，从而利用CRISPR特异识别靶序列特征影响特定基因的转录或表达，但目前把CRISPR-Cas9作用原理应用于RNA-RNA和/或RNA-蛋白质相互作用研究的新技术或方法仍鲜有报道。

传统分析RNA-RNA或RNA-蛋白质相互作用的方法是RNApull down技术。其具体原理是体外转录生物素标记的RNA作为探针，然后与细胞裂解液混合孵育，通过能与生物素特异结合的链霉亲和素磁珠富集生物素标记的RNA探针和与之结合的目标RNA或蛋白质。RNApull down技术的不足之处在于使用体外转录合成的RNA作为探针，所以RNA的生化特性可能与细胞生理状态下有所不同，检测结果可能存在假阳性。另一种分析蛋白质-RNA相互作用的方法为RNA免疫沉淀技术(RNA immunoprecipitation, RIP)。参见Gilbert et al.,CurrProtocMolBiol, 2006。该方法与分析蛋白质-染色质相互作用的方法染色质免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitation, ChIP）技术类似，通过抗体抗原的免疫反应，富集靶蛋白然后纯化检测与靶蛋白结合的RNA。但该技术只能单向分析与已知蛋白质结合的RNA，不能反向筛选与已知RNA结合的蛋白质或RNA。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明基于CRISPR-Cas9系统中crRNA和tracrRNA组成的RNA复合物特异序列和结构可以被Cas9识别结合的原理，提出并开发了基于CRISPR-Cas9的RNA免疫沉淀技术和方法。本发明的方法可以更接近细胞生理条件，用于检测RNA-RNA和/或RNA-蛋白质相互作用。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其为基于CRISPR-Cas9体系的RNA免疫沉淀方法，其包括：

(1) 使载体进入细胞内得到转染细胞，孵育所述转染细胞，其中，所述载体能够在细胞内产生过量融合转录本和Cas9蛋白，且所述融合转录本和所述Cas9蛋白能够在细胞内形成复合体，所述融合转录本包含目标RNA序列和sgRNAscaffold序列；

(2) 裂解孵育后的转染细胞，通过免疫沉淀分离所述复合物；和

(3)分析所述复合物中与目标RNA结合的靶分子。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述Cas9蛋白包含突变从而使其缺失核酸酶活性。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述Cas9蛋白进一步包含融合标签蛋白序列。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述靶分子选自RNA和/或蛋白。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述目标RNA的长度为18-550个碱基。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述载体不包含核定位信号序列。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，通过裂解液裂解孵育后的转染细胞，且所述裂解液包含蛋白酶抑制剂和RNA酶抑制剂。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述靶分子为RNA，且通过RT-qPCR、半定量PCR或RNA-seq检测与目标RNA结合的靶分子RNA。

根据本发明所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，优选地，所述靶分子为蛋白，且通过蛋白印迹（WesternBlot）或蛋白质谱高通量扫描分析靶蛋白的蛋白谱。

本发明的第二方面，提供一种用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的试剂，其包括：

(1) 载体，其用于进入细胞后在细胞内产生过量融合转录本和Cas9蛋白，从而使所述融合转录本和所述Cas9蛋白在细胞内形成复合体，所述融合转录本包含目标RNA序列和sgRNAscaffold序列；

(2) 细胞裂解试剂，其用于从细胞裂解液中分离纯化复合体；和

(3) 免疫沉淀试剂，其用于从复合体中分离纯化靶分子。

本发明的第三方面，提供一种分离的复合物，其包括相互结合的复合体和靶分子，其中所述复合体由融合转录本和Cas9蛋白组成，所述融合转录本包含目标RNA序列和sgRNAscaffold序列，所述Cas9蛋白包含标签序列且缺失核酸酶活性。

根据本发明所述的分离的复合物，优选地，所述靶分子选自lncBACE1、lncCDCA3L、BACE1和CDCA3 mRNA组成的组。

本发明提出并开发了基于CRISPR-Cas9技术进行RNA免疫沉淀检测RAN与靶分子相互作用的方案。与传统体外转录RNA进行pulldown的实验方法相比，本发明使用细胞来源的RNA和细胞表达的蛋白，可在更接近细胞生理条件下同时用于RNA-RNA和/或RNA-蛋白质等RNA相互作用分子之间的分析。与传统RNA免疫沉淀技术(RIP)相比，本发明具有可双向检测RNA-蛋白质等相互作用的优势，能够节约时间、降低成本。

附图说明

图1本发明实施例1所示流程及结果图，其中图1的A示出了使用转染试剂将空载环状质粒和lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒分别转染到对数生长期的293T细胞中，转染了lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒的实验组能产生lncBACE1-AS-sgRNA scaffold融合转录本和表达融合了3×Flag标签的dCas9蛋白，而转染空载环状质粒pX330A_dCas9的对照组产生的融合转录本为无义RNA-sgRNA scaffold；图1的B图上半部分示出了通过抗Flag抗体的免疫印迹，确认对照组与实验组dCas9蛋白表达量相近，继而使用逆转录试剂盒对提取的RNA进行逆转录；图1的B图下半部分示出了通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定捕获的RNA中存在lncBACE1-AS-tracrRNA融合转录本和靶基因BACE1mRNA。

图2本发明实施例2所示流程及结果图，其中图2的A是在Huh7细胞中使用CRIP技术；图2的B示出了以lncCDCA3L为钓饵，验证了lncCDCA3L与CDCA3 mRNA的结合；图2的C反向验证了CDCA3mRNA可以富集lncCDCA3。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。

本文中，术语“CRISPR-Cas9体系”是源自原核生物的一种天然免疫防御体系，目前主要用于DNA的基因编辑。本发明在此基础上进行改造得到优化体系，从而使其用于检测在细胞内能够与RNA结合的靶分子。为了说明方便，本文有时使用“优化体系”表示本发明用于检测目的的体系，从而与用于DNA基因编辑目的的体系进行区分。本发明的优化体系中，Cas9蛋白只要具有结合sgRNAscaffold序列的功能即可，Cas9蛋白的核酸酶功能对于本发明的目的实现并非必要，当存在Cas9蛋白的核酸酶活性时反而会对本发明的目的有不利影响。因此，本发明优选的Cas9蛋白缺失核酸酶活性。为此可通过基因工程手段对Cas9蛋白进行突变等序列改变从而使其缺失核酸酶活性。优选地，对野生型Cas9蛋白的HNH结构域和/或RuvC结构进行H840A突变和D10A突变，如dCas9蛋白。优选地，Cas9蛋白进一步包含分离标签，从而方便其进一步分离和检测。分离标签一般通过融合表达添加于Cas9蛋白上。在示例性实施方案中，本发明的分离标签为特定的氨基酸序列(本文也称作“标签序列”)。标签序列的实例包括但不限于Flag、His、GFP、RFP、YFP、V5和biotin。本发明可以使用上述标签序列中的一种或多种，必要时同一标签序列可以串联重复使用。

本文中，术语“靶分子”是指能够与RNA结合的生物大分子，特别是指能够在细胞内环境下能够与RNA结合的生物大分子。本发明的靶分子优选RNA和/或蛋白，或者由此类RNA和/或蛋白衍生得到的分子。

本文中，“与RNA结合的……”中，RNA是指细胞存在的任何感兴趣的RNA，本文有时也可称作“目标RNA”、“感兴趣RNA”或“待分析RNA”，其包括mRNA、非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)，非编码RNA的实例包括但不限于长非编码RNA(lncRNA)、短非编码RNA(snRNA)、miRNA和环状RNA(circRNA)。RNA的长度不特别限定，一般为18-550个碱基，优选100-500个碱基，更优选150-500个碱基，还更优选200-500个碱基，进一步更优选300-500个碱基。

本文中，术语“载体”是指用于通过因工程重组DNA技术将目的基因片段转移至受体细胞内、能够产生待分析RNA的序列的核酸。本发明的载体的实例包括但不限于细菌质粒、噬菌体、动植物病毒和在此基础上改造得到的衍生物。本发明的载体优选细菌质粒，其包含能够在受体细胞内产生本发明的融合转录本和Cas9蛋白即可。为此，本发明的载体需包含用于在受体细胞内产生融合转录本和Cas9蛋白的基因序列。除此之外，本发明的载体还包含其他序列。其他序列的实例包括骨架性结构序列、控制序列等。本发明的载体可以在已知载体的基础上进行改造得到。已知载体的示例性实例包括pX330A_dCas9-1x2。在示例性实施方案中，本发明对基于CRISPR-Cas9体系的载体进行改造，以去除核定位信号序列。

本文中，术语“融合转录本”是由本发明的载体在受体细胞产生的RNA分子，其一般包括目标RNA序列和sgRNAscaffold序列。其中，目标RNA序列是根据所感兴趣的RNA而设计的序列，其可以感兴趣的RNA的全长序列或其部分序列。

本文中，术语“复合体”是指由融合转录本和Cas9蛋白所形成的结构。术语“复合物”是指靶分子通过与RNA结合而在复合体基础上进一步形成的结构。

本文中，术语“抗体”包括抗体或其修饰物。例如多抗、单抗、嵌合抗体、纳米抗体、人源化抗体或者完全人类抗体。本发明的抗体可以是单链抗体。本发明的抗体修饰物包括化学修饰物以及抗体和其他材料的偶联物。其中，化学修饰物的实例包括但不限于抗体的乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、交联环化、二硫键化、脱甲基化、共价交联、半胱氨酸化、焦谷氨酸化、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解和磷酸化等。其中，偶联物的实例包括但不限于与纳米高分子材料、磁珠等的偶联物。

本文中，术语“用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的试剂”有时简称为“检测试剂”，是指能够实施本发明方法的试剂，其通常可理解为多种不同功能的试剂或成分的组合。这些不同功能的试剂或成分可以混合状态存在，也可以单独存在。本发明的检测试剂一般包括载体、用于细胞裂解并从中分离纯化复合体的细胞裂解液和用于从复合体中分离纯化靶分子的免疫沉淀试剂。除了上述成分外，本发明的检测试剂还可选地包括缓冲体系，如PBS缓冲液、磷酸缓冲液，细胞裂解液等。

本文中，术语“细胞裂解液”是指用于细胞裂解并从中分离纯化复合体的试剂。在示例性实施方案中，细胞裂解液包括抗体或其修饰物，其实例包括但不限于抗Cas9蛋白、抗分离标签抗体。在另外的示例性实施方案中，本发明的细胞裂解液包括与标签特异性结合的配基/配体。例如在标签为生物素的情况下，配基/配体可以选择链霉素。细胞裂解液中的抗体或配基/配体可选地进一步与基体如磁珠结合，从而有利于进行磁性分离或富集。除了上述成分外，本发明的细胞裂解液还中包括缓冲体系，如PBS缓冲液、磷酸缓冲液等。

本文中，术语“免疫沉淀试剂”用于从复合物中分离纯化靶分子。免疫沉淀试剂包括使RNA/RNA分离的试剂，或使RNA/蛋白分离的试剂。此类试剂可以使用本领域已知的那些试剂。除了上述成分外，本发明的免疫沉淀试剂还中包括缓冲体系，如PBS缓冲液、磷酸缓冲液等。

本文中，术语“受体细胞”是包括真核细胞、原核细胞或人工得到的类细胞体，如脂质体和外泌体等。示例性实施方案中，本发明的受体细胞为真核细胞，如人源细胞、永生化细胞。受体细胞的具体实例包括但不限于例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、酵母细胞和昆虫细胞。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类的细胞。受体细胞可以来源于多种组织类型，并且包含原代细胞和细胞系。具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。

本发明的检测试剂、细胞裂解液和免疫沉淀试剂可选地进一步包括RNA降解抑制试剂，如RNA酶抑制剂等。

实施例1

本实施例使用CRIP技术验证lncBACE1-AS与其已知靶基因BACE1的相互作用

1、构建lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒

(1) 制备线性化质粒载体

①使用限制性内切酶BbsI(NEB，Ipswich，MA)切割pX330A_dCas9-1x2质粒

配制以下体系：

BbsI 2μL

Buffer2.1 2μL

pX330A_dCas9-1x2 2μg

加蒸馏水至 20μL

37℃孵育5小时，加入4μL 6×DNA上样缓冲液(北京全式金生物技术股份有限公司)。

②通过琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化载体

将0.48 g琼脂糖粉末(北京普利莱基因技术有限公司)加入40 mL 1×TAE溶液(北京普利莱基因技术有限公司)，摇晃均匀，使用微波加热3分钟。加入4μL核酸染料(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，摇晃混匀，倒入制胶托盘中，插入水平电泳梳，制备1.2%(w/v)的琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，拔出电泳梳，将凝胶转移至浸满1×TAE溶液的水平电泳槽(Bio-rad，Hercules，CA)中，向胶孔中分别加入DNA marker(北京全式金生物技术股份有限公司)、环状空载质粒和上一步骤中的酶切产物，设置电泳仪(Bio-rad，Hercules，CA)参数为150V 200 mA，电泳约20分钟。在紫外凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)下确认载体已线性化，条带位置高于环状质粒。将线性化载体条带切出，置于1.5 mL离心管内并称重。

③从琼脂糖凝胶中回收纯化线性化载体

使用凝胶回收试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)提取线性化载体，并使用Nanodrop 2000分光光度计(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)测定DNA浓度。

(2) 合成lncBACE1插入片段

①在上海捷瑞生物工程有限公司合成CRISPR-lncBACE1-AS-top和CRISPR-lncBACE1-AS-botom上下游两条引物(具体序列见附录)

②配制以下的退火体系：

上游引物(100 μM) 5μL

下游引物(100 μM) 5μL

T4 DNA连接缓冲液 2μL

加蒸馏水至 20μL

在沸水中加热10分钟，接着自然冷却到室温。在这一过程中，两条引物以碱基互补配对的方式退火结合，主体部分形成双链线性片段，为lncBACE1的转录模板。两条引物5’端游离的前4个碱基CACC和AAAC分别为T4 DNA连接酶所需的粘性末端。

(3) 连接线性化质粒载体和lncBACE1插入片段

线性化质粒载体 1μL

lncBACE1插入片段 3μL

T4 DNA连接酶 1μL

T4 DNA连接酶缓冲液 1μL

加蒸馏水至 10μL

16℃过夜孵育。

(4) 转化

根据制造商的说明，将上一步的连接产物通过热激的方式转化到stbl3大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)中。经过细胞复苏、抗生素平板筛选、菌液PCR、质粒提取和测序鉴定，最终得到lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒。

2、细胞转染

如图1A所示，使用转染试剂lipo 2000(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)，将空载环状质粒和lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒分别转染到对数生长期的293T细胞(ATCC，USA)中，在后文中分别简称对照组和实验组。转染了lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒的实验组能产生lncBACE1-AS-sgRNA scaffold融合转录本和融合了3×Flag标签的dCas9蛋白。而转染空载环状质粒pX330A_dCas9-1x2的对照组产生的融合转录本为无义RNA-sgRNAscaffold。

3、效果验证

转染48小时后，使用Ploysome裂解液裂解细胞。

Ploysome裂解液配方

成分	工作浓度
		KCl	100 mM
MgCl2	5 mM
		HEPES (pH=7.0)	10 mM
NP40	0.5%
		DTT	1 mM
RNase Out	100 units/mL
		VRC	400 uM
Protease inhibitor cocktail	1:1000 dilution

向裂解液中加入抗Flag标签蛋白抗体(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany)和Protein A/G磁珠(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)，在4℃旋转摇床上孵育过夜。lncBACE1-AS可以通过与其融合的sgRNA scaffold-3×FlagdCas9-抗Flag抗体之间的结合作用富集在磁珠表面，而与lncBACE1-AS相互作用的细胞内RNA和蛋白质也一同富集在磁珠表面。次日，使用1×PBST溶液(北京普利莱基因技术有限公司)，在4℃旋转摇床上洗涤磁珠，一共5次，每次5min，洗去非特异结合的细胞组分。每次洗涤换液时使用磁力架吸附磁珠，弃去废液。待洗涤完毕，按所需用量分装磁珠悬液，再在磁力架上弃去洗液。若用于RT-PCR或RT-qPCR检测，则加入Trizol(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，提取全细胞RNA；若用于蛋白质检测，则加入5×蛋白上样缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司)，在沸水中加热10分钟，进行后续的Western blot检测。

4、结果

如图1B上半部分所示，通过抗Flag抗体的免疫印迹，确认对照组与实验组dCas9蛋白表达量相近。继而使用逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对提取的RNA进行逆转录。如图B下半部分所示，使用CRIP-lncBACE1-AS-PCR-F/R引物和2×Taq酶(北京康润诚业生物科技有限公司)，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定捕获的RNA中的lncBACE1-AS-tracrRNA。同理，使用BACE1-mRNA-qF/R引物鉴定捕获的RNA中是否含有BACE1-mRNA。CRIP实验中，转染lncBACE1-CRISPR-dCas9质粒捕获的BACE1-mRNA显著多于空载质粒组，而内参基因ActinmRNA水平均低于检测下限，能够验证BACE1-mRNA与lncBACE1-AS的结合，体现了CRIP方法的可靠性与特异性。

表1实施例1所用引物列表

CRISPR-lncBACE1-AS-top	CACCGGAGGAGGCTGCCTTGATGGATTTGACTACAGCTTCAAACACTTTCTTGGGCAAACGAAGGTTGGTGGTGCCACTGTCCACAATGCTCTTGTCATAGTTGTACT
		CRISPR-lncBACE1-AS-botom	AAACAGTACAACTATGACAAGAGCATTGTGGACAGTGGCACCACCAACCTTCGTTTGCCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGTAGTCAAATCCATCAAGGCAGCCTCCTCC
CRIP-lncBACE1-AS-PCR-F	GAGGCTGCCTTGATGGATT
		CRIP-sgRNA-scaffold-R	ACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
BACE1-mRNA-qF	CCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGC
		BACE1-mRNA-qR	CCTGCTTGCCAGCACAC
Actin-qPCR-F	TCGTGCGTGACATTAAGGAG
		Actin-qPCR-R	CTCATTGCCAATGGTGATGACC

实施例2

本实施例使用CRIP技术验证lncCDCA3L与CDCA3 mRNA的相互作用。

与实施例一的步骤相似，在Huh7细胞(ATCC，USA)中使用CRIP技术(参见图2A)。如图2B所示，以lncCDCA3L为钓饵，验证了CDCA3 mRNA与lncCDCA3L的结合。如图2C所示，反向验证了CDCA3 mRNA可以富集lncCDCA3。综上所述，CRIP技术可以用于RNA-RNA相互作用研究。

表2实施例2所用引物列表

CRIP-vec-CDCA3-top	CACCCCAGAGCTCCGACAAGCCCTCAAGGGACCCTGAGACTCCCAGATCTTCAGGTTCTATGCGCAATAGATGGAAACCAAACAGCA
		CRIP-vec-CDCA3-bottom	AAACTGCTGTTTGGTTTCCATCTATTGCGCATAGAACCTGAAGATCTGGGAGTCTCAGGGTCCCTTGAGGGCTTGTCGGAGCTCTGG
CRIP-vec-lncCDCA3L-F	GAAACACCGGGTCTTCGATGGAACCAGATTGAGTTTCA
		CRIP-vec-lncCDCA3L-R	CTAAAACAGGTCTTCTCCCCAATAAAGCTCTTAGTC
CRIP-CDCA3-PCR-F	CAGAGCTCCGACAAGCCCTCA
		CRIP-sgRNA-scaffold-R	ACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
lncCDCA3L-qPCR-F	CAAGCCCTTGAGAGACCCTG
		lncCDCA3L-qPCR-R	TGAAGACTGCTTACCCTTCTCTT
CDCA3-qPCR-F	GGACCCTGAGACTCCCAGAT
		CDCA3-qPCR-R	CCAGGGGAGTTGTCATCCTG
Actin-qPCR-F	TCGTGCGTGACATTAAGGAG
		Actin-qPCR-R	CTCATTGCCAATGGTGATGACC

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (8)

1.一种用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，其为基于CRISPR-Cas9体系的RNA免疫沉淀方法，其包括：

(1) 通过转染使载体进入受体细胞内，孵育转染了目的基因的受体细胞，其中，所述载体能够在受体细胞内表达过量融合转录本和含突变从而使其缺失核酸酶活性的Cas9蛋白，但不含核定位信号序列，且所述融合转录本和所述Cas9蛋白能够在受体细胞内形成复合体，靶分子通过与所述RNA结合而在复合体的基础上进一步形成复合物，所述融合转录本包含目标RNA序列和sgRNAscaffold序列；

(2) 裂解孵育后的转染细胞，通过免疫沉淀分离所述复合物；和

(3)分析所述复合物中与目标RNA结合的靶分子，所述靶分子为RNA或蛋白。

2.根据权利要求1所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白进一步包含融合标签蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，插入载体中用于目标RNA转录的DNA模版的长度介于18-550个碱基。

4. 根据权利要求1或2所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，所述RNA可以是蛋白编码基因、microRNA、lncRNA、snRNA、snoRNA、short ncRNA和pseudogene。

5.根据权利要求1或2所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，通过裂解液裂解孵育后的转染细胞，且所述裂解液包含蛋白酶抑制剂和RNA酶抑制剂。

6.根据权利要求1或2所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，所述靶分子为RNA，且通过RT-qPCR、半定量PCR或RNA-seq检测与目标RNA结合的靶分子RNA。

7.根据权利要求1或2所述的用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的方法，其特征在于，所述靶分子为蛋白，且通过蛋白印迹或蛋白质谱高通量扫描分析靶蛋白的蛋白谱。

8.一种用于检测细胞内能够与RNA结合的靶分子的试剂，其特征在于，包括：

(1) 载体，其用于进入细胞后在细胞内表达过量融合转录本和含突变从而使其缺失核酸酶活性的Cas9蛋白，但不含核定位信号序列，所述融合转录本和所述Cas9蛋白能够在细胞内形成复合体，且靶分子通过RNA-RNA或RNA-蛋白相互作用与所述RNA结合而在复合体的基础上能够进一步形成复合物，所述融合转录本包含目标RNA序列和sgRNAscaffold序列；

(2) 细胞裂解试剂，其用于细胞裂解，并从中分离纯化复合体；和

(3) 免疫沉淀试剂，其用于从复合物中分离纯化RNA或蛋白靶分子。

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