JP2019504646A - 複製的トランスポゾン系 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)少なくとも1個のHelraiser末端配列に隣接する目的遺伝子をコードする核酸配列を含む第1コンストラクトを提供し;
b)前記の第1コンストラクトを細胞に導入し;
c)Helraiserトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む第2コンストラクトを提供し;
d)前記の第2コンストラクトをb)において得られた前記の細胞に導入し;
e)d)において得られた細胞をトランスポザーゼ活性に関する条件下で培養し;そして
f)多コピーの前記の目的遺伝子を検出する。
a)LTSおよびRTSに隣接する一般的なgRNA認識部位、好ましくはTia1L;
b)プロモーター配列であって、目的遺伝子が前記のプロモーターの制御下にあるように配置されたプロモーター配列;
c)前記の目的遺伝子に続くポリアデニル化カセット。
a)前記の対象における使用に適した細胞株を単離し;
b)本発明に従う単離された核酸または発現ベクターを前記の細胞株に導入し、ここで、前記の核酸または発現ベクターは、前記の目的のタンパク質に対応する目的遺伝子を含み;
c)本発明に従うアミノ酸配列、核酸配列または発現ベクターを、Helraiser転移事象が生じて前記の目的遺伝子を含む組み換え細胞株を生成するように導入し;
d)前記の組み換え細胞株を細胞培養において拡張して組み換え細胞の集団を提供し;そして
e)前記の組み換え細胞を前記の対象に導入する。
a)本発明に従う目的遺伝子を提供する単離された核酸を含む第1発現ベクターを提供し;
b)本発明に従うトランスポザーゼをコードする核酸を含む第2発現ベクターを提供し;
c)前記の第1および第2発現ベクターを前記の対象に導入する。
a)Helitron LTS配列を含むコンストラクトを提供し;そして
b)前記のコンストラクトを細胞株に導入する。
a)本発明に従うHelitron LTS配列を含む細胞株を選び;
b)Helitronトランスポザーゼをトランスポザーゼ活性のための条件下で導入し;
c)多コピーの前記のDNA配列を有するクローン細胞株を単離する。
表1.M.ブランデティにおけるTSS周辺の+/−1kbの領域におけるHelitron富化分析に関する偶然性(Contingency)計数表。
+ HelitronまたはTSS周辺の+/−1kbの領域のどちらとも重複しない(と推定される)領域の数
〇 左のp値は、HelitronがTSS周辺の+/−1kbの領域において枯渇している確率を示す。右のp値は、富化の確率を示し、Helitronの両側確率は、偶然により期待される確率と異なっている。
一態様において、Helitronトランスポザーゼをコードするプラスミドが、哺乳類細胞に導入されてトランスポザーゼタンパク質の発現をもたらす。RTSおよびLTS配列に隣接するDNAの領域(単一コピーまたは多コピーのそのDNAがゲノム内で所望される)をコードするDNA配列を含む供与体DNAも、添加されるか、または既に存在しているかのどちらでもよい。トランスポザーゼの導入後、供与体DNAは、複製され、ゲノム内の多数の部位に導入される。従って、一側面において、本発明は、単一コピーまたは多コピーが必要とされるDNAの領域を含む供与体DNAを提供し、ここで、前記の供与体DNAは、LTS配列に隣接している。一態様において、供与体DNAは、LTSおよびRTS配列に隣接している。
供与体DNAは、参照標準を生成するために用いられることができる細胞株を生成するために用いられることができる。従って、本発明は、多コピーの目的遺伝子を含む細胞株を生成するための方法を提供し、ここで、まず単一コピーの目的遺伝子を有する細胞株が、生成され、ここで、目的遺伝子は、少なくともLTS Helraiser末端配列に(そして場合によりRTSにも)隣接している。一態様において、目的遺伝子は、その中に隣接するLTSおよびRTSが遺伝子編集技法により導入されている内在性遺伝子であることができる。別の態様において、目的遺伝子は、導入された、または非内在性遺伝子であることができる。適切には、“目的遺伝子”は、それ自体を複製することが分かっている遺伝子またはその一部であることができる。従って、別の態様において、供与体DNAは、癌のような特定の疾患においてそれ自体を複製することが分かっており、その存在が疾患に関する診断を提供するのを助けるために用いられることができるDNAの領域を表す。参照標準として有用であり得る遺伝子の例は、ERBB2/Her2、MET、CDK4またはCD274/PD−L1を含む。
バイオ医薬(Biopharmaceutical drug)の開発は、哺乳類細胞ベースの製造プラットフォームにおける組み換えタンパク質の発現に頼っている。これらの安定して発現している宿主細胞の生成は、複雑であり、面倒なスクリーニング方法論を必要とする。以前の技術は、組み換え導入遺伝子カセットの標的哺乳類細胞のゲノム中へのランダム挿入に頼っている。構築された細胞は、広い範囲の発現、増殖および安定性特徴を有する。商業的に実現可能な生産宿主細胞を得るために、数百のクローンが、スクリーニングされる。加えて、関係する耐性遺伝子、例えばグルタミンシンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼの選択圧を増大させることによる導入遺伝子の増幅のプロセスが、用いられることができる。このプロセスは、導入遺伝子カセットの増幅の間に不正確さを生じやすく、導入遺伝子発現における不安定性を引き起こす。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、依然として療法用生物製剤の製造に関するデフォルトの発現宿主であるが、いくつかの他の適切な細胞株が、当業者に馴染みであると考えられ、それはNS0マウス骨髄腫細胞、PER.C6(登録商標)細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胎児性腎臓(HEK293)細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞、VERO細胞を含むであろう。
一態様において、本発明は、目的の核酸または遺伝子をその核酸を必要とする対象に導入する系を提供する。適切には、対象は、あらゆる真核細胞、例えば植物、哺乳類、ヒト細胞等であることができる。
本明細書で記載されるコピーアンドペーストトランスポゾンを含むトランスポゾン系または方法は、変異誘発技法のための手段として用いられることもできる。
1.コピー/ペーストトランスポザーゼおよび該トランスポザーゼにより認識される供与体DNAを含む単離された細胞または培養細胞において多コピーのDNA配列を生成するための系。
方法
コンストラクトおよびPCR
トランスポゾンの詳細なクローニング手順およびトランスポザーゼ発現ベクターならびにPCRに関するプライマー配列が、以下のように提供される:
トランスポザーゼベクター。Helraiserトランスポザーゼのコード領域が、ヒトコドン最適化の後GenScriptにより合成され、SpeI/XhoIにより発現ベクターFV4a(Liu ZJ, Moav B, Faras AJ, Guise KS, Kapuscinski AR, Hackett PB. Development of expression vectors for transgenic fish. Bio/technology 8, 1268-1272 (1990))中にクローニングされて、トランスポザーゼヘルパープラスミドpFHelRを生成した。N末端2XHAタグが、MYPYDVPDYAYPYDVPDYAをコードする合成二本鎖オリゴヌクレオチドとしてpFHelRのSpeI部位中に挿入されて、pF−HA−HelRを生成した。CMVプロモーターに駆動されるトランスポザーゼ発現プラスミドpCHelRが、pFHelRのSpeI/XhoI断片をpcDNA3.1(−)(Invitrogen)のNheI/XhoI部位中に挿入することにより生成された。pCHelRGFPプラスミドを作製するため、pMSCV20Ires−GFP(B.Schroeder,MDCからのもの)のXhoI/NotI断片が、pCHelRのXhoI/NotI部位中に挿入された。トランスポザーゼ触媒変異体発現プラスミドが、pCHelRを鋳型として用いる変異誘発PCRにより生成された。昆虫細胞におけるHelraiserタンパク質発現のために用いられたトランスポザーゼベクターは、GENEART(Invitrogen)により合成されたHelraiserトランスポザーゼコード配列をpFastBac HT−A(Invitrogen)中にNcoIおよびXhoI制限部位を用いてサブクローニングすることにより生成された。
SV40−puroまたはSV40−neo選択カセットが、GeneScriptにより合成されたHelibat1(pHelR)、HelibatN1、HelibatN2およびHelibatN3のコンセンサスLTSおよびRTS配列の間にクローニングされた(図8)。トランスポゾン供与体ベクターpHelRΔHP、pHelRMut、pHelRATH、pHelRStemXおよびpHelRLoopXが、トランスポゾンの3’末端における回文構造配列の削除または置換により生成された。pHelRMutおよびpHelRΔHPベクターが、それぞれ以下のプライマー対を用いた削除PCRにより作製された:Hel−Mut fwd/Hel−Mut rev、ならびにHelRDelH fwdおよびHelRDelH rev。pHelRATHおよびpHelRLoopX供与体プラスミドを生成するため、それぞれ4種類のオリゴヌクレオチドATH1、ATH2、ATH3、ATH4およびLX1、LX2、LX3、LX4が、等モル比でアニーリングされた(0.8μMのそれぞれのオリゴ、0.2mM dNTP混合物および1μl PfuUltra II融合ホットスタートDNAポリメラーゼ(Agilent technologies)/50μlの反応)。オリゴアニーリング反応に関する温度プロフィールは、95℃で20秒、72℃で10秒を10サイクルであった。アニーリング反応の1μlが、それぞれATH5/ATH6およびLX5/LX6プライマー対を用いたATHまたはLX断片のPCR増幅のために用いられた。最終工程において、ATHおよびLX PCR断片が、SpeIおよびBamHIにより消化され、pHelRのSpeI/BamHI部位中にクローニングされた。pHelRStemXトランスポゾン供与体プラスミドを生成するため、pHelRATHが、変異誘発PCRにおいて鋳型としてプライマーSX fwdおよびSX revと一緒に用いられた。PCR反応後、線状断片の末端が、一緒にライゲーションされ、それによりpHelRStemXを生成した。pHelRΔRTSを作製するため、pHelRが、SpeI/BamHI制限酵素で消化された。制限部位は、Klenow(Fermentas)により平滑化され、再度ライゲーションされた。pHelRΔLTS供与体プラスミドが、Hel1C骨格(backbone)のNdeIおよびEcoRI消化、続いて制限部位のKlenow処理ならびにベクター骨格の再ライゲーションにより生成された。pHelRPNおよびpHelRΔHPN供与体プラスミドが、pUC19SBneo(Grabundzija I、et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Mol Ther 18、1200-1209 (2010))ベクターからのSpeI断片をそれぞれpHelRおよびpHelRΔHPベクターのSpeI部位中に挿入することにより生成された。Helitron環供与体プラスミドpHelRCDを生成するため、まずpIRES−EGFP−N1ベクターが、pWAS−EGFPのNotI/BamHI断片をpGFP−N1プラスミド(Clontech)のNotI/BamHI部位中にクローニングすることにより構築された。次いで、pIRES−EGFP−N1プラスミドのEcoRI/BamHI断片が、pHelRプラスミドのEcoRI/BamHI部位中にクローニングされ、それによりpHelRCDを作製した。pHelRCneoベクターは、pHCプラスミド(HeLa細胞におけるpHelRCD供与体プラスミドからのHelraiser転移により生成された)からのBamHI/EcoRI断片をpcDNA3.1(−)のBamHI/MfeI部位中に挿入することにより作製された。次の工程において、pHelRCneo中のneoコード配列が、pHel1Cプラスミドからのpuroコード配列と、AvrII/BamHI制限部位を用いて交換され、それによりpHelRCpuroベクターを生成した。トランスポゾンの3’末端における回文構造配列の欠失を有するHelitron環ベクターであるpHelRCΔHPpuroが、鋳型としてのpHelRCpuroおよびHel−Mut fwd/Hel−Mut revプライマー対を用いる部位特異的変異誘発PCRにより生成された。PCRにより生成された全てのコード配列およびトランスポゾンコンストラクトの完全性が、DNA配列決定により検証された。
2×105個のHeLa細胞が、トランスフェクションの1日前に6ウェルプレート上に蒔かれた。2μlのjetPRIMEトランスフェクション試薬(Polyplus Transfection)および200μlのjetPRIME緩衝液が、1μgのDNAをトランスフェクションするために用いられた(それぞれのトランスフェクション反応は、500ngのトランスポゾン供与体および500ngのトランスポザーゼヘルパーまたはpBluescriptベクター(Stratagene)を含有していた)。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクションされた細胞のある割合(10または20%)が、100mmディッシュ上に再度蒔かれ、トランスポゾンの組み込みに関して選択された(2μg/ml puroまたは2μg/ml puroおよび1.4mg/ml G418)。2〜3週間の選択の後、コロニーが、選び取られ、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で固定され、コロニーの計数および分析のためにPBS中でメチレンブルーにより染色された。
トランスポゾンのコピー数が、以下のようにスプリンケレットPCRにより決定された:
HeLa細胞のクローンが、6ウェルプレート上でコンフルエントまで増殖させられ、PBSで洗浄され、溶解緩衝液(100mMトリスpH8.0、5mM EDTA、0.2% SDS、200mM NaClおよび100μg/μlプロテイナーゼK)中で振盪しながら55℃で一夜培養された。HeLaのゲノムDNA(gDNA)が、溶解した細胞から標準的なフェノール/クロロホルム抽出により単離された。5μgのgDNAが、FspBIで4時間消化された後、エタノール沈殿が行われた。次の工程において、試料は、20μlの反応中でBfaIスプリンケレットアダプター(100pmol)にライゲーションされた(300ng)。3マイクロリットルのライゲーション反応が、プライマー(リンカープライマーおよびHel1)を用いた第1PCRに関して用いられた。第1PCRラウンドに関する温度プロフィールは、以下の通りであった:94℃で3分間を1サイクル、続いて94℃で30秒間、70℃で30秒間および72℃で30秒間を15サイクル;94℃で30秒間、63℃で30秒間および72℃で2秒間(サイクルごとに2秒間の増加)を5サイクル;94℃で30秒間、62℃で30秒間および72℃で12秒間(サイクルごとに2秒間の増加)を5サイクル;94℃で30秒間、61℃で30秒間および72℃で22秒間(サイクルごとに2秒間の増加)を5サイクル;ならびに94℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で30秒間を5サイクル。ネステッドPCRが、プライマーNestedおよびHel2を用いて実施され、50μlの反応あたり1μlの第1PCRの1:100希釈物が、用いられた。ネステッドPCRに関する温度プロフィールは、94℃で3分間を1サイクルで開始し、続いて94℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で30秒間を10サイクル、そして94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で2分間を20サイクルであった。最後の伸長は、72℃で5分間実施された。
低分子量DNAが、トランスフェクションされたHeLa細胞から単離され、Helitron環を検出するために改変された逆PCRプロトコルにおいて用いられた。
Helraiserトランスポザーゼを発現している細胞が、4個のマッピングされたHelraiser挿入を含有するHeLa由来トランスポゾン供与体H1細胞株にpCHelRGFPヘルパープラスミドを繰り返しトランスフェクションしてGFP+の細胞を選別することにより富化された。次いで、我々は、富化された細胞集団のプールされたDNAに対してトランスポゾン挿入部位の高スループット配列決定を行った。
HeLa細胞が、前に記載されたようにpCHelRおよびpHelRをトランスフェクションされた。トランスフェクションの3週間後、ピューロマイシン耐性コロニーがプールされ、gDNAが単離された。トランスポゾン末端に隣接するDNA配列が、Bowtie(Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology 10, R25 (2009))により1個までのミスマッチを許容してヒトゲノム(hg19)に対してマッピングされた。エラーなしでゲノムにマッチしている独特にマッピングされた読みのみが、維持された。同じゲノムの位置に対する冗長な読みのマッピングは、一緒に統合された。我々は、トランスポゾン末端の最後の4塩基にマッチするゲノムの位置への全ての組み込みを、これらの部位はミスプライムによる人為産物である可能性もあるため、破棄した。さらなる詳細が、下記で提供されている。
挿入部位および融合転写産物ライブラリーの生成は、コンピューター支援半特異的PCRスキームに基づいていた。PCRアッセイは、それらの3’末端において4個のみの特異的ヌクレオチド(4塩基長)、続いてランダム配列および特異的オーバーハングを有する半特異的プライマー(Ewing AD, Kazazian HH, Jr. High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes. Genome research 20, 1262-1270 (2010))の使用に頼った。これらのプライマーは、ネステッドPCR増幅のためにこれらの座位にタグ付けするために、鋳型ゲノムDNAまたはcDNAのそれぞれトランスポゾン−ゲノムまたはトランスポゾン−ゲノム転写産物の接合部の近隣にアニーリングするはずである。半特異的プライマーの4塩基長は、コンピューターで設計された。可能性のある4塩基長は、ヒトゲノムまたはトランスクリプトーム中のそれらの提示(representation)によりランク付けされ、トランスポゾン配列上またはプライマーオーバーハング上で望ましくない増幅産物を生じ得る4塩基長は、除外した。同様に、アルゴリズムが、それらの6つの4塩基長の組み合わせを予測するために実施され、それは、結果としてヒトゲノムまたはトランスクリプトームに関する最も包括的なライブラリーおよび用いられるトランスポゾンベクターをもたらす。次に、多工程PCRスキームが、指標付きのIlluminaフローセル適合性融合トランスクリプトームまたはインテグローム(integrome)ライブラリーを得るために実施された。
ピューロマイシン耐性HeLaコロニーのプールから単離された300ngのgDNAが、6種類の異なる半特異的プライマーを含有する以下の条件:5’Helitronトランスポゾン末端に関して:95℃で1分間、40サイクルの(94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で30秒間)、2サイクルの(94℃で30秒間、25℃で1分間、0.2℃/秒で72℃までランプ(ramp)、72℃で1分間)での最初の6つの並行したPCR反応のための鋳型として、5’−Helitron配列に特異的な5pmolのHel_Lft_1または3’−トランスポゾン末端に特異的な5pmolのHel_3P_1(62℃のアニーリング温度を使用する以外は同じプログラムを使用)と共に使用された。第1PCR反応は、それぞれ5’−トランスポゾン末端に関する15pmolのHel_Lft_2および3’−トランスポゾン末端に関する15pmolのHel_3P_2を含有する25μlのPCRマスター混合物を補われた。5’末端に関するPCRプログラムは、以下の通りであった:15上位サイクル(super−cycles)の[3サイクルの(94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で40秒間)、1サイクルの(94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で40秒間)]。3’末端に関して、62℃のアニーリング温度が、3サイクルに関して用いられた。PCR産物は、カラム精製され、30μlの溶離物の内の2μlが、プライマーPE_firstならびに5’トランスポゾン末端に関してHel_L_bcおよび3’トランスポゾン末端に関してHel_3P_bcをそれぞれ用いる、以下のサイクル条件を用いる第1指数関数的PCRのために用いられた:95℃で30秒間、20サイクルの94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で1分間。3’トランスポゾン末端に関して、アニーリング温度は、58℃であった。1μlの10倍希釈された第1指数関数的PCR産物が、Illuminaアダプターを増幅産物に付加するために用いられ、Pfxポリメラーゼ(Life Technologies)を、これらのサイクル条件で用いた:95℃で30秒間、20サイクルの94℃で15秒間、68℃で1分間。最終的なPCR産物が、アガロースゲル上で泳動され、200〜500bpの増幅産物が、切り出され、カラム精製された(ZymocleanゲルDNA回収キット、Zymo Research)。結果として得られたライブラリーの配列決定は、Beckman Coulter Genomicsの米国マサチューセッツ州ダンバースの配列決定施設においてIllumina HiSeq 2500機器上で実施された。
点変異が、QuikChange部位特異的変異誘発法(Agilent)を用いて作られた。バキュロウイルスの産生およびタンパク質発現は、国立癌研究所のタンパク質発現研究所により以下のように実施された:
細胞のペレットが、ニッケル親和性カラム結合緩衝液(20mM NaH2PO4 pH7.4、500mM NaCl、50mMイミダゾール、1mM TCEP)中で再懸濁された。全てのその後の工程は、4℃で実施された。溶解は、細胞を氷上で30分間インキュベートし、次いでMisonix Sonicator 3000で超音波処理(3分間の休止を伴う5×20秒間の82ワットのパルス)することにより行われた。可溶性画分が、20,000×gでの遠心分離により分離され、ニッケル親和性カラム結合緩衝液中で平衡化されたHiTrap CHeLatingカラム(GE Healthcare)上に装填され、溶離緩衝液(20mM NaH2PO4 pH7.4、500mM NaCl、250mMイミダゾール、1mM TCEP)による線形勾配を用いて溶離された。溶離されたタンパク質は、20mM NaH2PO4 pH7.0、250mM NaCl、1mM DTT中で一夜透析され、1mg/ml TEVプロテアーゼが、1:100 プロテアーゼ:タンパク質の体積比で添加された。生成物は、ヘパリンカラム結合緩衝液(20mM NaH2PO4 pH7.0、250mM NaCl、1mM TCEP)で予め平衡化されたHiTrap Heparin HPカラム(GE Healthcare)上に装填され、溶離緩衝液(20mM NaH2PO4 pH7.0、2M NaCl、1mM TCEP)による線形勾配を用いて溶離された。Helraiserトランスポザーゼが、50mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM TCEPで平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200サイズ排除カラム(GE Healthcare)上に装填され、精製されたタンパク質を含有する画分が、10mg/mlまで濃縮された。全ての点変異体が、同じ方式で精製され、発現または精製挙動(>90%の均質性)のどちらにおいても、野生型トランスポザーゼの発現または精製挙動からの変化を示さなかった。同じ手順が、トランスポザーゼの切断されたバージョンを精製するためにも用いられた。
DNA切断が、6−FAM標識オリゴヌクレオチド(BioTeZ Berlin−Buch GMBH)を用いて測定された。反応は、一般に5mM MnCl2を含むかまたは含まない緩衝液(50mMトリスpH7.5、100mM NaCl、0.5mM ETDA、1mM TCEP)中500nMのDNA基質および500nMのタンパク質で構成されていた。さらなる詳細は、以下のように提供される:
切断は、37℃で1時間行われ、2μlのプロテイナーゼK(New England BioLabs)および2μlの0.5M EDTAの添加により停止された。5mM MgCl2を含む反応に関して、反応は、37℃で一夜行われた。プロテイナーゼK消化は、45℃で30分間であり、その後、同体積の装填色素(80%ホルムアミド、1mg/mlキシレンシアノール、1mg/mlブロモフェノールブルー、10mM EDTA)が添加され、反応は、22℃で15分間、次いで95℃で5分間インキュベートされた後、15%トリス/ボレート/EDTA/尿素ゲル(Invitrogen)上にゲル装填された。結果は、Typhoon Trio(GE Healthcare)を用いて可視化された。
5’/5rApp/CAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTAAGCTTCCAGCG/3SpC3/−3’。次いで、PCRならびに5’末端の配列の既知の部分に関して設計されたプライマーおよび上記のオリゴヌクレオチドに対する逆方向プライマーを用いて、断片が増幅された。結果として得られたdsDNAが、pUC19中にEcoRIおよびHindIII制限部位を用いてクローニングされ、FDA−FBR施設において配列決定された。
Helraiserトランスポザーゼが、20mlの消化緩衝液(50mM Hepes pH7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP)中において1mg/mlで希釈され、一連のトリプシン希釈物が、0.1〜1mg/mlの範囲の最終濃度まで添加された。試料は、37℃で1時間インキュベートされ、反応は、NuPAGE装填色素(Novex)および95℃で5分間の煮沸により停止された。次いで、試料は、すぐに4〜12% NuPAGEビストリスゲル(Novex)上に装填された。バンドは、InvitrogenのiBlotキットを用いてブロット用紙に転写され、それぞれのN末端配列の配列が、FDA−FBR施設により決定された。
HelraiserトランスポザーゼのそれぞれのDNAオリゴヌクレオチドへの結合が、6% TBEゲル(Invitrogen)を用いるEMSAにより測定された。15nM〜150nMの精製されたタンパク質が、室温で結合緩衝液(50mMトリスpH7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2、0.5mM ETDA、1mM TCEP)中で50nMの6−FAM標識されたオリゴヌクレオチドと共に30分間インキュベートされた。DNAゲル装填溶液(Quality Biological,INC)の添加後、試料は、6% TBEゲル上で泳動され、可視化された。
復活したHelraiserトランスポゾンの構造的特徴
自律性Helibat要素のモデルを構築するため、M.ルシフガスのゲノムに対して生物情報学的分析が行われた(下記参照)。結果として得られた5296bpのHelraiserコンセンサス配列(図8)は、配列分析により同定された自律性Helitronの既知の特徴(Kapitonov et al. (2007)およびThomas et al. (2015)において総説されている)の全てを含有する。Helraiserトランスポザーゼの1496アミノ酸(aa)長のコード配列は、それぞれLTSおよびRTSと名付けられたトランスポゾンの左および右末端配列に隣接しており(図1Aおよび図8)、それは、Helibat1ファミリーに特徴的な保存された5’−TC/CTAG−3’モチーフで終結している(Pritham et al. (2007))。一本鎖の際にヘアピン構造を形成する可能性を有する19塩基対長の回文構造配列が、RTS末端の11ヌクレオチド上流に位置している(図1Aおよび図8)。
植物および後生動物における多様な既知のHelitronによりコードされているRepHelタンパク質中に存在する保存されたローリングサークル複製開始因子ドメイン(Rep)に対応する約300アミノ酸タンパク質配列のセットを用いて、我々は、このドメインをコードする全てのコウモリ配列を、それらをGenBankミオティス・ルシフガス(Myotis lucifugus)アセンブリに対するCensor(Jurka J、Klonowski P、Dagman V、Pelton P. CENSOR--a program for identificationおよびelimination of repetitive elements from DNA sequences. Computers & chemistry 20、119-121 (1996))検索におけるクエリーとして用いることにより同定した。同定されたDNA配列が異なるファミリーから構成されている可能性があるかどうかを調べるため、我々は、BLASTCLUST(スタンドアローンのBlast、NCBI)によるそれらのクラスタリングを実施した。クラスタリングの結果に基づいて、我々は、コウモリゲノムが1個のみの主な自律様Helitronのファミリーを含有していると結論付けた。全てのこれらの配列は、未成熟停止コドンおよび短い挿入欠失が混入している配列でさえも、触媒ドメインをコードする約900bpのRepコンセンサス配列を得るために用いられた。次の工程において、Repコンセンサスの200bpの5’および3’末端部分に90%を超えて同一なゲノム配列が、末端のそれぞれ2kb上流および下流まで拡張された。拡張された配列の2セットの多重アラインメントに関して、2つのコンセンサス配列が、得られた。これらの2つの末端コンセンサスおよびRepコンセンサスが、一緒に1つの長い拡張されたコンセンサスへと組み立てられた。この手順は、コウモリの自律様Helitronの両方の末端が同定されるまで反復して繰り返され、自律性コウモリコンセンサス配列の第1バージョン(Helitron−1_ML)が、構築された。
我々は、トランスポゾンの機能的構成要素(すなわちトランスポザーゼならびにLTSおよびRTS配列)を合成し、ピューロマイシン遺伝子(puro)でタグ付けされたトランスポゾン(pHelRと名付けられた)およびトランスポザーゼ発現ヘルパープラスミド(pFHelRと名付けられた、図1B)からなる2構成要素転移系を生成した。図1Bにおいて示されているように、Helraiser系のヒトHeLa細胞へのトランスフェクションは、トランスポザーゼの非存在下でのプレートあたり約100個のコロニーと対比して、平均でプレートあたり約3400個のピューロマイシン耐性コロニーを生成した。従って、Helraiserトランスポゾン系は、ヒト細胞における転移活性に必要とされる決定因子の全てを含有しているようである。
Helraiserトランスポザーゼの保存されたアミノ酸の一部の機能的重要性を決定するため、我々は、HUHヌクレアーゼドメイン中のH593およびH595の両方ならびに推定上の触媒性Y727およびY731残基(両方を個々に、および一緒に)、ならびにWalker AモチーフのK1068およびヘリカーゼドメインのモチーフVI中に位置するアルギニンフィンガーR1457残基を変異させた(図2A)。これらの変異のそれぞれが、結果としてHeLa細胞における転移活性の喪失をもたらし(図2A)、これは、ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性の両方が転移に必要であることを示唆している。
ATPの加水分解が、Baykov et al. (Baykov AA, Evtushenko OA, Avaeva SM. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal Biochem 171, 266-270 (1988))から適合された手順を用いて時間の関数としての遊離ホスフェート(Pi)の形成を測定することにより分析された。Helraiserトランスポザーゼまたは変異体タンパク質が、50mM HEPES pH7.5、100mM NaCl、1mM DTTおよび2mM MgCl2を含有する緩衝液中で0.3〜1μMの終濃度に希釈され、次いで37℃に10分間加熱された。反応は、180μlの総体積中1mMの終濃度または0.0078〜1mMの濃度範囲のどちらかまでのATP(Jena biosciences)の添加により開始された。試料(20μl)が、様々な時点において取り出され、すぐにそれぞれが5μlの0.5M EDTAを含有する96ウェルプレートのウェル中で停止された。1mMマラカイトグリーンストック溶液の分割量(150μl)が、それぞれのウェルに添加され、650nmにおける吸光度が、Molecular Devices Spectramax M5マイクロプレートリーダーを用いて測定された。放出されたホスフェートの量が、KH2PO4を用いて生成された標準曲線に対する比較により計算された。ATP加水分解のDNA刺激が、同じ緩衝液およびタンパク質濃度範囲(0.3、0.08、0.02?M)およびATP(1mM)を用いて、しかしATPの添加の前に1μMの50塩基長ssDNAまたは50bp長dsDNAのどちらかを添加して測定された。Kmおよびkcatの計算は、EXCEL(Microsoft)およびKaleidaGraph 4.0において行われた。
転移におけるHelraiserの末端配列の重要性を調べるため、我々は、トランスポゾンベクターpHelRΔLTSおよびpHelRΔRTSの変異体を、LTSまたはRTS配列のどちらかを削除することにより作製した。LTSの存在は、その欠失がHelraiser転移を消失させる(HeLa細胞におけるトランスポザーゼの存在および非存在下での区別不能なコロニー数により判断された)ため、必須であった。驚くべきことに、RTSの存在は、必須ではなかったが、その除去は、結果としてコロニー形成活性の完全なトランスポゾンの約24%までの低下をもたらした(図3A)。
逆PCRを用いたHelraiserの挿入部位の分析の間に、我々は、しばしば顕著な約150bpのPCR産物を観察した(データは示されていない)。これらのPCR増幅産物のDNA配列決定は、Helraiserトランスポゾン末端の正確なヘッドトゥーテール接合(LTSの5’−TCジヌクレオチドが、RTSのCTAG−3’テトラヌクレオチドに直接かつ正確に接合されている)を明らかにした(図4A)。これらのデータは、Helraiser転移における環状中間体の形成を示唆した。
Helitron挿入のパターンは、多くの真核生物種のゲノムにおいて広く分析されてきた(Pritham et al. (2007); Thomas et al. (2014); Coates et al. (2012); Du et al. (2009); Morgante et al. (2005); Dong Y, et al. Structural characterization of helitrons and their stepwise capturing of gene fragments in the maize genome. BMC genomics 12, 609 (2011); Han MJ, Shen YH, Xu MS, Liang HY, Zhang HH, Zhang Z. Identification and evolution of the silkworm helitrons and their contribution to transcripts. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 20, 471-484 (2013); Yang L, Bennetzen JL. Structure-based discovery and description of plant and animal Helitrons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 12832-12837 (2009) and Yang L, Bennetzen JL. Distribution, diversity, evolution, and survival of Helitrons in the maize genome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 19922-19927 (2009))が、これらのパターンは、少なくとも部分的に宿主の種のレベルでの自然選択および遺伝的浮動により形作られている。対照的に、培養細胞において回収された新規の転移事象は、ほとんど一切の選択または浮動を受けず、従ってトランスポゾンの組み込みの選好性をより直接的に反映する。ヒトゲノム中での新規のHelraiser転移事象を特性付けるため、我々は、HeLa細胞において回収された1751のHelraiser挿入を生成し、マッピングし、生物情報学的に注釈を付けた。標的部位の配列ロゴ分析は、以前にコウモリおよび他の真核生物ゲノムにおける内在性Helitronトランスポゾンに関して観察されたように(Kapitonov et al. (2007); Thomas et al. (2015); Kapitonov et al. (2001)およびPritham et al. (2007))、組み込みに関する高度に好まれる部位としてのAT標的ジヌクレオチド(図5A)を確証した。しかし、挿入に関するATジヌクレオチドの標的化は、絶対ではなかった:46の挿入は、他の配列中に起こっており、TT、ACおよびAAは、最も顕著な代替のジヌクレオチドであった(図5A)。中心的なATジヌクレオチドに加えて、我々は、実際の組み込み部位の周囲の約20bp以内のATに富むDNA配列に関する強い選好性を観察しており;この選好性は、組み込まれたトランスポゾンの3’末端に隣接する配列に対して最も顕著であった(図5A)。
我々は、1751の独立した組み込み事象を同定した。統計分析に関して、我々は、2つの異なる背景モデルに従ってランダムに選択されたゲノム部位のセットを作製した。モデル(‘ランダム’)は、HeLa細胞の異常な核型と比較して正常化されている。第2モデル(‘対照’)は、配列決定の読みのマッピング可能性(mappability)も説明しており、組み込み部位における塩基組成を模倣している。HeLa細胞の核型を決定するため、我々は、Broad/MGH ENCODE群により生成されたChIP−Seq入力データセットを用いた。これらのデータセットは、特異的に結合する抗体の適用なしで生成されたため、読みの密度は、基礎となるゲノム領域の相対的コピー数に関する推定値として用いられることができる。HeLa細胞に関する、ならびに正常な核型を有する12の他の細胞型に関する2つの生物学的複製のマッピングされた配列決定の読みは、UCSC Genome Bioinformaticsのウェブサイト(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db=hg19&g=wgEncodeBroadHistone)からダウンロードされた。我々は、HeLa細胞および正常細胞のそれぞれのデータセット対に関して、それぞれが正常細胞のデータセットからの1000の連続する読みをカバーするスライディングウィンドウ中の読みの計数の倍率変化を計算した。結果として得られた倍率変化は、HeLa細胞の仮定された平均倍数性(すなわち3)を掛けられ、正常細胞の倍数性(すなわち、非性染色体に関して2、ならびに対照細胞データセットの性別に応じてX染色体およびY染色体)で割られ、次いで窓サイズ30000の移動メジアンフィルターで均され(smoothed)、最後に最も近い整数値へと丸められた。次いで、HeLa細胞および正常細胞のデータセットの全ての対からの結果は、中央値を計算することにより結び付けられた。正常細胞由来のデータに対して試験され、その方法は、正常な核型を正確に予測した(データは示されていない)。‘ランダムな’バックグラウンドモデルに関して、我々は、ゲノム中の500000のランダムな位置を、ゲノム位置を選択する確率がその染色体断片の倍数性に比例する方式で標本抽出した。‘対照の’バックグラウンドモデルは、以下のように生成された。まず、我々は、1億のランダムなゲノム位置を、ゲノム位置を選択する確率がその染色体断片の倍数性に比例する方式で標本抽出した。これらの位置から、我々は、トランスポゾン組み込み部位にマッピングされた実際の配列決定の読みと同じ長さの分布を有するモックの配列決定の読みを標本抽出した。次いで、そのモックの読みが、前記の配列決定の読みのように処理された。結果として得られたモックの部位が、組み込み部位における塩基組成に由来する位置特異的重み行列(PWM)を用いて採点された(図5A)。モックの部位から、我々は、100,000の対照部位を、それらのPWMスコア分布が実際の組み込み部位のPWMスコア分布に似るような方式で標本抽出した。遺伝子発現レベル、ヒストン修飾およびクロマチン接近可能性、ならびにCpG島のゲノム位置およびラミナ会合ドメインに関する情報は、UCSC(http://genome.ucsc.edu)からダウンロードされた。オープンクロマチン領域は、DNアーゼI HSデータ、FAIREデータおよびChIPデータから得られ、検証された領域は、UCSC Open Chrom Synth track、リリース2(2012年2月)から得られた。
図3Aにおいて示されている我々の結果は、たとえRTS全体が失われていても一部の転移が起こり得ることを実証した。これは、何の配列決定因子が可動化されたDNA分節の3’末端を定めるのかという疑問を提起する。
上記の実験は、回文構造またはRTSの欠失により生じた未成熟な切り詰めおよび読み過ごし事象が、新規の3’末端の生成をもたらすことを実証した。そのような事象がインビボでも起っていたかどうかを調べるため、我々は、最近活性なHelibatN541、HelibatN542およびHelibatN580サブファミリーの395コピー(それぞれ26、339および30コピー)を分析し、新規の3’末端を有する(コンセンサスの最後の30bpと比較して20%を超えて逸脱していた)39の標本を見付けた(表1)。これらの標本は、おそらく1)予め存在している5’を切断されたHelitronに隣接する挿入(図11A)、2)1つのHelitronの5’末端が他のHelitronの3’末端に隣接する、別のHelitronのすぐ隣りへの挿入(図11B)、および3)3’末端の最後の30bp以内での欠失または変異(図11C)により生成された。空の部位の証拠は、これらが実際に本物の挿入事象であることを示唆している(図11D)。最も興味深いことには、pHelRΔHPトランスポゾンの挿入#2(図6A)に類似して、我々は、新規の3’末端が回文構造を欠くRTS中のCTAG−3’配列の迂回を通して生成された1つの標本を同定した(図11E)。従って、Helraiser転移における3’末端の迂回および結果としてもたらされる新規のトランスポゾン末端の出現(図6A、B)は、天然のプロセスを忠実に再現している。
配列決定されたゲノム中のHelitronによる新規の末端の獲得のパターンを理解するため、我々は、ミオティス系列における3つのHelibat標本のコピー(HelibatN541、HelibatN542およびHelibatN580)を分析した。そのコピーは、最近活性であり(コンセンサスに対して98〜99%同一)、それは、どのように配列のサイン(signature)が解釈されるかに対する選択の影響を最小限にする。HelibatN541コピーは、M.ルシフガス系列に特有であり(Thomas et al. (2014))、HelibatN580コピーは、M.ブランデティ系列に特有であり、HelibatN542コピーは、両方の系列において見られる。コンセンサスに対して98〜99%同一であるHelibat標本のコピー(HelibatN541およびHelibatN580)が、それらのそれぞれのゲノムから抽出された。コンセンサスに対して95%を超えて同一であり、完全な5’末端を有するHelibatN542のコピーが、M.ルシフガスのゲノムから抽出された。HelibatN542のコピーは、比較的古いため、我々は、異なるカットオフを用いた。それぞれのコピーの最後の30bpが、それらのそれぞれのコンセンサスに対してMUSCLE(Edgar RC. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res 32, 1792-1797 (2004))を用いてアラインメントされた。コンセンサスから20%を超えて逸脱した末端または整列しない(新規の)末端を有するコピーは、3’末端の起源および進化への洞察を得るために、相同性ベースのツール(BLASTツール(Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410 (1990))を用いて注意深く分析された。我々は、偽陽性を排除するために他のコウモリの全ゲノム配列を用いる比較ゲノム解析アプローチも用いた。例えば、あるコウモリゲノム中のコピーが新規の3’末端を有し、かつオルソロガスなコピーがコンセンサスに相同な末端を有する場合、それらの変化は、挿入後に起こったと推定された。加えて、空の部位(挿入のない部位)が、要素の境界を確証するために用いられた。
M.ルシフガスゲノムにおいて、15の異なる遺伝子からのプロモーター配列が、Helitronにより捕捉され、4690コピーまで増幅された(Thomas et al. (2014))。例えば、HelibatN3サブファミリーは、ゲノム捕捉事象から進化し、ここで、転移する要素は、プロモーター、NUBPLのN末端の6アミノ酸に関するコード配列およびスプライス供与(SD)配列を含有するNUBPL(ヌクレオチド結合タンパク質様)遺伝子の断片を拾い上げた[図6C(i)](Pritham et al. (2007))。従って、HelibatN3要素が遺伝子のイントロン中に正しい方向で飛び込んだ場合、それは、トランスポゾン中のSD配列および最も近い下流のスプライス受容配列(SA)の間でのスプライシングによりその遺伝子のN末端を切断された派生物を異所性に発現する能力を有するであろう(図6C)。
上記のデータは、HelibatN3要素がHeLa細胞において実験的に可動化された際に強力なエキソントラップとして作用することを示唆している。内在性Helitron転移のインビボで新規の転写産物を生成する能力を実証するため、我々は、コウモリ(ミオティス・ブランデティ)におけるHelitronに捕捉されたNUBPLプロモーターに駆動される転写産物に注釈を付けた。我々は、Helitronに捕捉されたNUBPLプロモーターの挿入は、23の注釈を付けられた遺伝子に関して少なくとも1個の注釈を付けられた転写開始部位(TSS)の1kb上流の範囲内に存在することを見出し;これらの挿入は、合計46の転写産物を駆動すると予想され[FPKM(マッピングされた100万の断片あたりのエキソン1キロ塩基あたりの断片)>0.5]、その内の3つは、挿入により供給されたTSSを有する(表2)。46の転写産物の内の4は、コードしていると予測され、それらの親遺伝子とは対照的に、46の転写産物の内の35は、試験された組織においていくらかの組織特異性を示している(その組織においてのみFPKM>0.5)(表2)。
ピューロマイシン耐性HeLaコロニーから精製された500ngの総RNAが、Maxima逆転写酵素(Thermo Scientific)およびオリゴdTプライマーを50℃で30分間用いて逆転写された。熱不活性化後、逆転写反応が、繰り返された。RNAは、5分の1の体積の1N NaOHおよび0.5M EDTAを65℃で15分間用いて加水分解された。cDNAは、DNA Clean & Concentratorキット(Zymo Research)を用いて精製され、2μlの溶離物が、以下の条件:95℃で1分、40サイクルの(94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で30秒間)、2サイクルの(94℃で30秒間、25℃で1分間、72℃まで0.2℃/秒でランプ、72℃で1分間)でのHelitronベクター配列に特異的なプライマーPuro1およびヒトトランスクリプトーム全体における高提示に関してコンピューターで予測された4塩基長の半特異的プライマーを用いる6つの独立したPCR増幅に関して用いられた。第1PCR反応は、以下の条件:10回の上位サイクルの[3サイクルの(94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で40秒間)、1サイクルの(94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で40秒間)]でのその後の非対称PCR反応を実施するためにベクター特異的オリゴPuro2を含有する25μlのPCRマスター混合物を補われた。PCR産物は、カラム精製され、30μlの溶離物の内の2μlが、トランスポゾン特異的オリゴT2a_SD_bcおよび半特異的プライマーのオーバーハングに特異的なPE_firstを用いる第1指数関数的PCRのために用いられた。PCR産物は、精製され、pGEM−Tベクターシステム(Promega)を用いてTA−クローニングされ、配列決定された。融合転写産物は、Helitronトランスポゾン内のスプライス供与部位に続く配列をUCSCゲノムブラウザのBLATツールを用いてアラインメントすることにより決定された。
Helitronの挿入が、M.ブランデティのゲノムアセンブリ(KE161034−KE332376、国立生物工学情報センター(NCBI)におけるGenBankからの171343スキャフォールド(Seim I, et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt's bat Myotis brandtii. Nature communications 4, 2212 (2013)))において以前に記載された5ミオティス特異的Helitronリピートライブラリーを用いて同定された(RepeatMasker v.4.0.5 http://www.repeatmasker.org)。Helitron挿入の保存は、Helitron DNA配列+200bpの隣接する配列を得て、NCBI wgsデータベースのblastnクエリーを実施してその挿入が他の配列決定されたヒナコウモリ科(Vespertilionidae)のコウモリ(E.フスクス、M.ルシフガスおよびM.ブランデティ)中に存在するかどうかを決定することにより決定された。所与の種においてクエリー配列の全長に対するヒットが存在した場合、それは、その種に存在する(保存されている)と考えられた。Helitronに対するヒットのみが存在した、またはヒットしなかった場合、それは、存在しないと考えられた。この情報をそのコウモリの既知の分岐時間と組み合わせることにより、我々は、それぞれの挿入に関するおおよその年齢を得た。遺伝子モデル中に挿入しているHelitronの方向において偏りが存在するかどうかを決定するため、我々は、以前に記載されたパイプライン(Kapusta A, et al. Transposable elements are major contributors to the origin, diversification, and regulation of vertebrate long noncoding RNAs. PLoS genetics 9, e1003470 (2013))を用いて、イントロン、エキソンと重複しているか、または注釈を付けられた遺伝子モデルの1kb上流もしくは下流の領域中にあるかのいずれかであるHelitronを同定した。それらの標的遺伝子と同じ方向および逆方向で挿入されているHelitronの両方が、定量化され、両側2標本T検定を用いて比較された(α=0.05)。
高いカバー度を有する数多くの高品質な方向性RNA−seqが、公的に利用可能であり、ゲノムが、約2000のHelitronに捕捉されたNUBPLの挿入を含有するため、M.ブランデティが、これらの分析のために用いられた。M.ブランデティの腎臓、肝臓および脳組織からのIlumina RNA−seqの読み(200bp、対)(SRA061140)(Seim et al. (2013))が、プールされ、Trimmomatic(Lohse M, et al. RobiNA: a user-friendly, integrated software solution for RNA-Seq-based transcriptomics. Nucleic Acids Res 40, W622-627 (2012))を用いて品質でトリミングされ、Trinity(r20140413(Grabherr MG, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature biotechnology 29, 644-652 (2011)))を用いて(新規で、およびゲノムに導かれて)組み立てられ、Trinity(r20140413(Grabherr MG, et al. and Haas BJ, et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature protocols 8, 1494-1512 (2013))を用いて(新規で、およびゲノムに導かれて)組み立てられた。2つの分析からの結果として得られたアセンブリは、組み合わせられ、オルタナティブスプライシング分析が、スプライシングされたアラインメントを組み立てるためのプログラム(Program to Assemble Spliced Alignments)(PASA_r20140417)(Haas BJ, et al. Improving the Arabidopsis genome annotation using maximal transcript alignment assemblies. Nucleic Acids Res 31, 5654-5666 (2003) and Campbell MA, Haas BJ, Hamilton JP, Mount SM, Buell CR. Comprehensive analysis of alternative splicing in rice and comparative analyses with Arabidopsis. BMC genomics 7, 327 (2006))を用いて実施された。それぞれの転写産物の相対的存在度(FPKM)が、期待値最大化によるRNA−Seq(RNA−Seq by Expectation−Maximization)(RSEM;v.1.2.12)(Li B, Dewey CN. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics 12, 323 (2011))を用いて決定された。スプライシング情報(および従って方向性の情報)を欠いている、FPKM<0.5の存在度である、そして合計の長さが200bp未満である転写産物は、アセンブリから除外され、結果として最終的なM.ブランデティのトランスクリプトームアセンブリをもたらした。スプライシング情報(および従って方向性の情報)を欠いている、FPKM<0.5の存在度である、そして合計の長さが200bp未満である転写産物は、アセンブリから除外され、結果として最終的なM.ブランデティのトランスクリプトームアセンブリをもたらした。転写産物は、ゲノム座標を最新のゲノム注釈と交差させる(intersect)(Bedtools;v.2.22.1(Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (Oxford, England) 26, 841-842 (2010))ことにより、そしてBLASTを用いてその遺伝子の既知の転写産物に対する相同性を検証することにより遺伝子に割り当てられた。それぞれの転写産物に関するコードしている可能性が、100アミノ酸より大きい予測されるORFを有するものとして決定された(Haas et al. (2013))。それぞれの転写産物に関する組織特異性も、決定され、転写産物は、3つの調べられた組織の内の1つまたは2つにおいてのみFPKM値が0.5より大きい場合に、組織特異的であると考えられた。
捕捉されたNUBPLプロモーターを含有するHelitronのゲノム座標が、組み立てられた転写産物の座標と交差させられた。我々は、転写産物が検出可能であること(FPKM>0.5)、それが鎖特異性を有すること、そしてNUBPLプロモーター自体がTSS(Andersson et al. (2014))の上流1kb以内であることを確実にするために、ストリンジェントな基準を用いた。NUBPLプロモーターを含有するHelitronが位置する転写産物は、候補となるNUBPL−HCPに駆動される転写産物として分類された。TSSがNUBPLプロモーターを含有するHelitronにより提供される転写産物は、本物であることが証明されたNUBPL−HCPに駆動される転写産物であると考えられた。Helitronにより駆動されると推定される少なくとも1つの転写産物を有する遺伝子は、GOターム分析富化分析(GO Term Analysis Enrichment Analysis)中に含められ、タームは、それらのp値が0.05未満である場合、有意であると考えられた(Mi H, Muruganujan A, Thomas PD. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Res 41, D377-386 (2013)およびAshburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature genetics 25, 25-29 (2000))。FPKM>0.5を有する転写産物のTSSの1kb以内のそれぞれのNUBPLプロモーターは、プロモーターモチーフ、例えばTATA、CAAT、およびGCボックス、ならびに予測される転写因子(TF)結合部位に関してGPMiner(Lee TY, Chang WC, Hsu JB, Chang TH, Shien DM. GPMiner: an integrated system for mining combinatorial cis-regulatory elements in mammalian gene group. BMC genomics 13 Suppl 1, S3 (2012))を用いて分析された。
M.ブランデティ遺伝子のTSSを中心とした2kbの区間に対応する座標を得るために、我々は、我々のM.ブランデティ遺伝子アセンブリからTSSに関する−1kbおよび+1kbに関する座標を抽出した。次いで、我々は、これらの座標をBedtoolsを用いてM.ブランデティにおける既知のHelitron挿入の座標(RepeatMasker、上記参照)と交差させ、フィッシャーの正確確率検定(α=0.05)(Quinlan et al. (2010))により富化または枯渇を決定した。結果は、両側p値が0.05未満である場合に有意であると考えられ、有意性の方向(富化されたか枯渇したか)が、適切な片側検定のp値により決定された。
コウモリM.ルシフガスのゲノムからの活性なHelitronトランスポゾンが、復活させられ、この新規のトランスポゾンHelraiserが、Helitron転移の機序およびゲノム的影響を探求するために用いられてきた。
HelRaiserは、複製のためにコピーアンドペースト機序を使用し、真核細胞において作動する最初のトランスポゾンである。このトランスポゾンの分子生物学ツールとしての1つの魅力的な適用は、多コピーの目的遺伝子またはゲノム領域を含有する細胞株が作製されるようなゲノム内容物の増幅である。これを例示するため、HelRaiser末端配列(LTSおよびRTS)に隣接する“モデル遺伝子”(TurboGFP)の定められた単一コピーの組み込みを有する細胞株が、出発点として用いられた。次いで、これらの細胞は、HelRaiserトランスポザーゼを導入され、TurboGFPがコピーアンドペースト機序により置き換えられたかどうかに関して評価された。
5’接合部のPCRに関するプライマー対AAVS1−EF1A
順方向:TATATTCCCAGGGCCGGTTA、逆方向:TCTCCACCTCAGTGATGACG
3’接合部のPCRに関するプライマー対TurboGFP−AAVS1
順方向:AGGAGGATCACAGCAACACC、逆方向:ACAGGAGGTGGGGGTTAGAC
上記の遺伝子型決定PCRの両方が陽性であるいくつかのクローン細胞株が、得られた。AAVS1座位におけるタグ付けカセットの組み込みを疑いの余地なく確証するために、これらの内の選ばれたものが、サンガー配列決定によっても分析された(図13B)。
TurboGFPプライマー/プローブ配列
順方向プライマー 5’−CTGCACGTGAGCTTCAGCTA−3’
逆方向プライマー 5’−AAGCCGGTGCCCATCA−3’
プローブ FAM−CCGCGTGATCGGCGACTT−MGB
増幅産物の長さ 74bp
TurboGFPのコピー数を参照座位に関連付けることを可能にするため、ヒトRnaseP遺伝子に関するプローブセットが、含められた(ThermoFisherからのカタログ番号4403326)。このアッセイは、14番染色体上のリボヌクレアーゼP RNA構成要素H1(H1RNA)を検出する:
アッセイ座位:14番染色体:20811565
ビルド:NCBI ビルド37
遺伝子記号:RPPH1
プローブ修飾:VIC色素(5’)、TAMRAクエンチャー(3’)
増幅産物の長さ:87bp
液滴は、DG8カートリッジおよび70μlのオイルを用いて生成され、96ウェルPCRプレートに移された。次に、PCRが、以下の条件を用いて液滴に対して実施された:
Helraiserトランスポゾンの、細胞における遺伝子増幅のために用いられた場合の効率を測定するため、Hap1細胞が、目的の内在性遺伝子に隣接するトランスポザーゼ認識部位(LTSおよびRTS)を含有するように操作される。一度これらの細胞株が操作されると、トランスポザーゼは、これらの細胞で発現され、遺伝子座位がトランスポザーゼのコピー−ペースト活性によりコピー数において増加するかどうかが、観察される。2つの遺伝子が、この概念実証実験のために選択されている:サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)および表面抗原分類81(CD81)。
PuroRプライマー/プローブ配列
順方向プライマー 5’−CACCAGGGCAAGGGTCTG−3’
逆方向プライマー 5’−GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG−3’
プローブ VIC−GCCTTCCTGGAGACCT−MGB
増幅産物の長さ 118bp
PuroRのコピー数を参照座位に関連付けることを可能にするため、ヒトEGFR遺伝子に関するプローブセット(ThermoFisherからのカタログ番号4400291)が、含められた。このアッセイは、7番染色体上のEGF受容体を検出する。
本明細書で記載されたHelitronトランスポザーゼのバイオプロセス適用に関する適切性を評価するため、以下の実験的検証が、実施された。
対照GFPベクター−RTSおよびLTSに隣接するピューロマイシン耐性選択カセットを伴うeGFP(ベクター(1))。
Helraiserトランスポザーゼタンパク質および供与体対照GFPベクター(上記のベクター(1))が、Lonza Nucleofectorの標準化されたCHO手順を用いて電気穿孔法により細胞内に送達される。72時間後、細胞は、トランスフェクションの効率を決定するために、陽性GFP細胞の数に関してフローサイトメトリーにより分析される。細胞は、2個のE125エルレンマイヤーフラスコ中に蒔かれる(0.5×106細胞/mL)。第1フラスコ(a)中の細胞は、2週間ピューロマイシン選択下に置かれ、一方で第2フラスコ(b)中の細胞は、振盪しながら2週間継代される(最大細胞密度は4.0×106細胞/mL)。2週間後、選択圧は、フラスコ(a)から除去され、両方のフラスコ中の細胞が、GFPの安定組み込みを有する細胞の百分率を決定するためにフローサイトメトリーにより分析される。フラスコ(a)では100%の細胞がGFPを発現しており、これは、選択下でのGFP遺伝子の100%の細胞中への組み込みを示している。フラスコ(b)は、Helraiserトランスポザーゼがカセットを選択なしで組み込む効率の尺度を提供する。フラスコ(a)中のピューロマイシンで選択された細胞は、組み込みの数およびそれらの位置を決定するためのCergentisによる標的化された座位の増幅(Targeted Locus Amplification)(TLA)評価のために回収される。
1)選択されたプールが、組み換えタンパク質を2g/Lより大きい濃度で生成する。
遺伝子トラップは、対象の遺伝子の発現を破壊するために様々な種にわたって頻繁に用いられている合成的遺伝要素である(引用PMID 18370072; Floss T and Schnuetgen F; Chromosomal Mutagenesis, Humana Press, 編者 Davis GD and Kayser KJ (2008)における第9章)。それらは、レポーター遺伝子、例えばGFP、RFP、mCherry、PuroRまたはBlaRに融合した強いスプライス受容配列、続いて強い転写終結シグナルを含有する(引用PMID 19965467; Carette JE et al. (2009) Science Vol. 326, Issue 5957, pp. 1231-1235 DOI: 10.1126/science.1178955)。そのような遺伝子トラップカセットが遺伝子の発現される部分内に挿入された場合、それは、そのスプライス受容配列により転写産物を捕捉し、この遺伝子の転写を特異的に抑止するであろう融合転写産物を作り出すであろう。これは、様々な生物(例えばマウス、ゼブラフィッシュ;引用PMID 15167922; International Gene Trap Consortium, Skarnes WC et al. (2004). Nature Genetics, 36(6), 543-544. http://doi.org/10.1038/ng0604-543)において機能喪失(LOF)モデルを作り出すために利用されてきた。
Helraiserトランスポゾン挿入を含有する細胞からの5μgのゲノムDNAが、FspBIで4時間消化された後、エタノール沈殿が行われる。次の工程において、試料は、20μlの反応中でBfaIスプリンケレットアダプター(100pmol)にライゲーションされる(300ng)。3マイクロリットルのライゲーション反応が、プライマー(リンカープライマーおよびHel1)(表4参照)を用いる第1PCRのために用いられる。第1PCRラウンドに関する温度プロフィールは、以下の通りである:1サイクルの94℃で3分間、続いて94℃で30秒間、70℃で30秒間および72℃で30秒間を15サイクル;94℃で30秒間、63℃で30秒間および72℃で2秒間(サイクルごとに2秒間の増加)を5サイクル;94℃で30秒間、62℃で30秒間および72℃で12秒間(サイクルごとに2秒間の増加)を5サイクル;94℃で30秒間、61℃で30秒間および72℃で22秒間(サイクルごとに2秒間の増加)を5サイクル、そして94℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で30秒間を5サイクル。ネステッドPCRが、プライマーNestedおよびHel2(表4参照)を用いて実施され(表4参照)、50μlの反応あたり1μlの第1PCRの1:100希釈物が、用いられる。ネステッドPCRに関する温度プロフィールは、1サイクルの94℃で3分間で開始し、続いて94℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で30秒間を10サイクル、そして94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で2分間を20サイクルである。最終的な伸長は、72℃で5分間実施される。
Claims (59)
- 単一コピーまたは多コピーの目的遺伝子を細胞に導入するための方法であって、以下:
a)Helitronトランスポザーゼ;および
b)HelitronトランスポザーゼLTS配列を含むコンストラクト
を提供することを含む、上記方法。 - b)におけるコンストラクトが、HelitronトランスポザーゼLTS配列に隣接している目的遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 単一コピーまたは多コピーの目的遺伝子を真核細胞に導入するための方法であって、以下:
a)“コピーアンドペースト”トランスポザーゼ;および
b)“コピーアンドペースト”トランスポゾンLTS配列に隣接する目的遺伝子を含むコンストラクト;
を提供することを含む、上記方法。 - 真核細胞が、植物細胞、酵母細胞または哺乳類細胞である、請求項4に記載の方法。
- 細胞が、ヒト、ラットまたはマウスの細胞である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- “コピーアンドペースト”トランスポザーゼがHelitronトランスポザーゼであり、LTSがHelitronトランスポゾンに由来する、請求項4〜6に記載の方法。
- LTS配列が、NO:3において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 目的遺伝子が、RTS配列にも隣接している、請求項2〜8のいずれかに記載の方法。
- RTS配列が、SEQ ID NO:4において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項9に記載の方法。
- トランスポザーゼが、SEQ ID NO:1において示されているアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含むHelraiserトランスポザーゼである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
- トランスポザーゼおよび目的遺伝子を含むコンストラクトが、2つの別々の実体として提供される、請求項2〜11のいずれかに記載の方法。
- トランスポザーゼ、目的遺伝子およびLTSが、単一のコンストラクトとして提供される、請求項2〜11のいずれかに記載の方法。
- 目的遺伝子が内在性遺伝子であり、多コピーの該内在性遺伝子またはcDNA配列が導入される、請求項2〜13のいずれかに記載の方法。
- 目的遺伝子が、非内在性遺伝子またはcDNA配列である、請求項2〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記方法が、細胞株を生成するために用いられる、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
- 細胞株が、多コピーの目的遺伝子を含む、請求項16に記載の方法。
- 以下の工程:
a)少なくとも1個のHelraiser末端配列に隣接する目的遺伝子をコードする核酸配列を含む第1コンストラクトを提供し;
b)該第1コンストラクトを細胞に導入し;
c)Helraiserトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む第2コンストラクトを提供し;
d)該第2コンストラクトをb)において得られた細胞に導入し;
e)d)において得られた細胞をトランスポザーゼ活性に関する条件下で培養し;そして
f)多コピーの目的遺伝子を検出する;
を含む、請求項17に記載の方法。 - 第1コンストラクトが、Helraiser LTSおよびRTS配列を含む、請求項18に記載の方法。
- 第1コンストラクトが、好ましくはプログラム可能なヌクレアーゼ技術、例えばCRISPR/Cas9、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼを用いるゲノム工学により生成される、請求項18または請求項19に記載の方法。
- 既知のコピー数を有するクローンを選択することをさらに含む、請求項18〜20のいずれかに記載の方法。
- 目的遺伝子が、療法的タンパク質をコードしている、請求項2〜21のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜22のいずれかに記載の方法により生成された、細胞株。
- 参照標準として使用するための、請求項23に記載の細胞株。
- 目的のタンパク質の生成における使用のための、請求項23に記載の細胞株。
- 療法における使用のための、請求項23に記載の細胞株。
- 細胞株が、CHO細胞株である、請求項23〜26のいずれかに記載の細胞株。
- SEQ ID NO:1において示されている配列に対して80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたアミノ酸配列であって、該配列がHelraiserトランスポザーゼをコードしている、上記アミノ酸配列。
- SEQ ID NO:1において示されているアミノ酸配列を有する、請求項28に記載の単離されたアミノ酸配列。
- 請求項28または請求項29に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸配列。
- 配列が、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:6を含む、請求項30に記載の単離された核酸配列。
- 配列が、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:6において示されている核酸配列である、請求項31に記載の単離された核酸配列。
- SEQ ID NO:3において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
- SEQ ID NO:4において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
- SEQ ID NO:3において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:4において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
- SEQ ID NO:5において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
- 少なくともSEQ ID NO:3において示されている配列またはそれに対して80%の同一性を有する配列を含むLTS HelRaiser末端配列に隣接している目的遺伝子の核酸配列を含む、単離された核酸。
- SEQ ID NO:4において示されている配列またはそれに対して80%の同一性を有する配列を含むRTS HelRaiser末端配列をさらに含む、請求項37に記載の単離された核酸。
- 請求項30〜38のいずれかに記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
- 請求項37または請求項38に記載の核酸配列を含む発現ベクターであって、以下:
a)LTSおよびRTSに隣接する一般的なgRNA認識部位、好ましくはTia1L;
b)プロモーター配列であって、目的遺伝子が該プロモーターの制御下にあるように配置されたプロモーター配列;
c)該目的遺伝子に続くポリアデニル化カセット;
の少なくとも1つをさらに含む、上記発現ベクター。 - 請求項30〜38のいずれかに記載の核酸配列、または請求項39もしくは40に記載の発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
- 宿主細胞がCHO細胞である、請求項41に記載の組み換え宿主細胞。
- 目的のタンパク質を生成する方法であって、請求項25、請求項41または請求項42に記載の細胞を適切な培地で培養し、該目的タンパク質を該細胞または適切な培地から回収することを含む、上記方法。
- 目的遺伝子をそれを必要とする対象に提供することにより疾患を処置するための方法であって、以下の工程:
a)該対象における使用に適した細胞株を単離し;
b)請求項33、37もしくは38に記載の単離された核酸、または請求項39もしくは40に記載の発現ベクターを該細胞株に導入し、ここで、前記の核酸または発現ベクターは、目的のタンパク質に対応する目的遺伝子を含み;
c)請求項28もしくは請求項29に記載のアミノ酸配列、請求項30、31もしくは33に記載の核酸配列、または請求項39もしくは40に記載の発現ベクターを、Helraiser転移事象が生じて目的遺伝子を含む組み換え細胞株を生成するように導入し;
d)該組み換え細胞株を細胞培養において拡張して組み換え細胞の集団を提供し;そして
e)該組み換え細胞を該対象に導入する;
を含む、上記方法。 - 細胞株が、T細胞、マクロファージ細胞、B細胞、樹状細胞、NK細胞、造血幹細胞、骨髄性−赤血球系前駆(CMEP)細胞またはリンパ球共通前駆(CLP)細胞である、請求項44に記載の方法。
- それを必要とする対象において疾患を処置するための方法であって、以下の工程:
a)請求項33、37または38に記載の単離された核酸を含む第1発現ベクターを提供し;
b)請求項30、31または33に記載の核酸配列を含む第2発現ベクターを提供し;
c)該第1および第2発現ベクターを対象に導入する;
を含む、上記方法。 - 請求項33、37または38に記載の単離された核酸を含む第1発現ベクター、および請求項30、31または33に記載の核酸配列を含む第2発現ベクターを含む、医薬組成物。
- LTSおよび/またはRTSに隣接するレポーター遺伝子をコードする供与体と合わせてのHelitronトランスポザーゼの使用であって、該レポーターの複数のゲノム組み込み事象を含有する細胞株のライブラリーを生成するための、上記使用。
- Helitron転移法由来の細胞株を検出するための方法であって、請求項33または請求項34に記載のLTSおよび/またはRTS配列の存在に関して細胞株を分析することを含む、上記方法。
- 細胞株を生成するための方法であって、以下の工程:
a)Helitron LTS配列を含むコンストラクトを提供し;そして
b)該コンストラクトを細胞株に導入する;
を含む、上記方法。 - 部分a)におけるコンストラクトが、Helitron RTS配列をさらに含む、請求項50に記載の方法。
- LTSおよび/またはRTSが、目的のDNA配列に対して標的化されている、請求項50または51に記載の方法。
- 請求項50〜52に記載の方法により生成された、細胞株。
- 多コピーの目的DNA配列を含む細胞株を生成するための方法であって、以下の工程:
a)請求項53に記載の細胞株を準備し;
b)Helitronトランスポザーゼをトランスポザーゼ活性のための条件下で導入し;
c)多コピーの該DNA配列を有するクローン細胞株を単離する
を含む、上記方法。 - 請求項54に記載の方法により生成された、単離されたクローン細胞株。
- 参照標準として使用するための、請求項55に記載の単離されたクローン細胞株。
- 細胞株が、CHO細胞株またはHAP1もしくはeHAP細胞株である、請求項53、55または56のいずれかに記載の単離された細胞株。
- 単一コピーまたは多コピーのDNA配列を有する細胞を生成するための、真核細胞におけるコピーアンドペーストトランスポゾンの使用。
- 単一コピーまたは多コピーのDNA配列を有する細胞を生成するための、原核細胞または真核細胞におけるHelitronトランスポゾンの使用。
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