ES2773313T3 - Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle - Google Patents

Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle Download PDF

Info

Publication number
ES2773313T3
ES2773313T3 ES14793265T ES14793265T ES2773313T3 ES 2773313 T3 ES2773313 T3 ES 2773313T3 ES 14793265 T ES14793265 T ES 14793265T ES 14793265 T ES14793265 T ES 14793265T ES 2773313 T3 ES2773313 T3 ES 2773313T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
probe
nucleic acid
sequence
interest
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14793265T
Other languages
English (en)
Inventor
Monika Iwona Suwara
Sajid Javed
Elizabeth Ann Gillies
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mast Group Ltd
Original Assignee
Mast Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mast Group Ltd filed Critical Mast Group Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2773313T3 publication Critical patent/ES2773313T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/101—Linear amplification, i.e. non exponential
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used
    • C12Q2533/10—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used the purpose being to increase the length of an oligonucleotide strand
    • C12Q2533/101—Primer extension
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/107—Alteration in the property of hybridised versus free label oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método para detectar una secuencia de un ácido nucleico de interés en una muestra que comprende: amplificar un ácido nucleico de interés en la muestra mediante amplificación isotérmica mediada por bucle; sondear el ácido nucleico amplificado con una sonda que comprende; una secuencia de una sonda oligonucleotídica complementaria a una región de una secuencia de un ácido nucleico de interés, donde dicha secuencia de una sonda oligonucleotídica tiene solamente un marcador fluoróforo y dicho marcador está unido a una base de citosina interna y donde dicha secuencia de una sonda oligonucleotídica no tiene un terminador en el extremo 3', donde la base de citosina está dispuesta sustancialmente de manera central a lo largo de la cadena oligonucleotídica a excepción de las posiciones 1-3 en el extremo 3' y la posición 1 en el extremo 5'; y detectar la presencia del ácido nucleico de interés, donde un incremento en la fluorescencia de la sonda indica la presencia del ácido nucleico de interés en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle
[0001] La presente invención se refiere a una sonda para la detección de un ácido nucleico, un método en el que se utiliza dicha sonda y un kit de partes. Preferentemente, la sonda de la invención es útil en un método para la detección de ácidos nucleicos obtenidos a partir de Chlamydia trachomatis y/o Neisseria gonorrhoeae, y se puede utilizar en el diagnóstico de infecciones por clamidia y/o gonorrea.
[0002] La amplificación de ácidos nucleicos es uno de los recursos más valiosos en el campo de las ciencias de la vida, con inclusión de los campos orientados a aplicaciones como la medicina clínica, donde resulta particularmente útil en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, trastornos genéticos y rasgos genéticos. Además de la detección mediante PCR ampliamente utilizada (Saiki R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. y Arnheim, N. (1985) Science, 230, 1350-1354), se han inventado varios métodos de amplificación. Algunos ejemplos son la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), la replicación de secuencias autosostenida (3SR) y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). En la PCR se utiliza la desnaturalización térmica de productos de ADN bicatenario para impulsar la siguiente ronda de síntesis de ADN. La 3SR y la NASBA eliminan la desnaturalización térmica mediante el uso de una serie de reacciones de transcripción y retrotranscripción para amplificar la secuencia de interés.
[0003] Con estos métodos se puede amplificar ácidos nucleicos de interés a una magnitud similar, todo con un límite de detección inferior a 10 copias y en aproximadamente una hora. Se requiere un instrumento de precisión para la amplificación o un método complejo para la detección de los productos de amplificación debido a la escasa especificidad de la selección de la secuencia de interés. A pesar de la simplicidad y la magnitud de la amplificación obtenible, el requerimiento de utilizar un termociclador de alta precisión para la PCR impide que este poderoso método se utilice ampliamente, como, por ejemplo, en clínicas privadas como herramienta de diagnóstico de rutina. Por el contrario, la LAMP es un método con el que se pueden amplificar unas pocas copias de ADN a más de 100 en menos de una hora en condiciones isotérmicas y con una mayor especificidad.
[0004] Como ocurre con otras tecnologías con sondas moleculares que se han indicado más arriba, los ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) se pueden utilizar para detectar la presencia de microorganismos específicos en una muestra. Sin embargo, los métodos de detección se basan en la detección visual directa, la turbidez, o en estos se utiliza un colorante intercalante del ADN no específico. La determinación visual directa constituye una determinación del punto final y no puede proporcionar un análisis en tiempo real. La turbidez y los colorantes intercalantes no específicos proporcionan análisis en tiempo real de la amplificación que tiene lugar. No obstante, estos no son específicos, es decir, se detecta toda la amplificación, tanto si es una amplificación positiva auténtica, como si se trata de una amplificación falsa debido a un cebado incorrecto, especificidad cruzada.
[0005] Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método, una sonda y un kit, como se define en las reivindicaciones.
[0006] En una realización preferida, la secuencia de la sonda oligonucleotídica es una secuencia de ADN y la secuencia del ácido nucleico de interés es una secuencia de ADN.
[0007] Preferentemente, la base de citosina está dispuesta sustancialmente de manera central a lo largo de la cadena oligonucleotídica. Existen beneficios particulares asociados al marcaje de la sonda en la parte interna en una base de citosina. La especificidad del producto de ADN amplificado en una reacción isotérmica se puede confirmar mediante un análisis de la curva de fusión. Sin embargo, debido al gran número de variantes del producto generadas en esta reacción y a la baja resolución del análisis de la curva de fusión, mediante el uso de colorantes intercalantes como el V13 es muy difícil distinguir entre los productos de ADN específicos y los no específicos que se generan en condiciones isotérmicas. Las sondas comúnmente utilizadas, como la sonda TaqMan®, no son compatibles con la tecnología LAMP debido a la actividad de desplazamiento de la hebra de la polimerasa Bst. La sonda de la invención se alarga y se incorpora a un producto de ADN durante la amplificación isotérmica, lo que permite realizar un análisis de la curva de fusión en el producto generado. En la sonda de la invención, el fluoróforo está conjugado a una citosina interna complementaria a una guanina en la hebra antisentido. La guanina afecta al estado de excitación de muchos fluoróforos, lo que da lugar a la formación de características singulares en las curvas de fusión, y permite distinguir entre los productos específicos y los no específicos generados en condiciones isotérmicas.
[0008] El oligonucleótido no contiene ddNTP en su extremo 3', lo que permite la incorporación del oligonucleótido marcado al amplicón. De esta manera, el extremo 3' de la sonda no está «bloqueado». El fluoróforo puede comprender uno o más seleccionados de entre los siguientes: FAM, JOE, TET, HEX, Ta MrA, ROX, ALXA y a Tt O.
[0009] La sonda puede comprender la siguiente secuencia:
5' Xn C* Xm 3' (SEC. N.° ID. 1)
Donde n es >1, m es >3, X es una base nucleotídica; y * es un fluoróforo. Preferentemente, la base nucleotídica se selecciona de entre A, T, C y G. Preferentemente, n es más de 1 a 20, y más preferentemente, más de 1 a 10. Preferentemente, m es más de 3 a 20, y más preferentemente, más de 3 a 10. Se prevé que se dan a conocer todas las combinaciones de cadenas de sonda abarcadas por el número posible de nucleótidos a los que n o m pueden dar lugar según los intervalos precedentes.
[0010] Preferentemente, la sonda puede comprender una secuencia seleccionada de cualquiera de las siguientes secuencias:
SEC. N.° ID. 3: TAAGATAAC[C-FAM]CCGCACGTG
SEC. N.° ID. 5: GCGAACATA [C-ALEXA546] CAGCTATGATCAA o
SEC. N.° ID. 6: ATGTTCA [C-JOE] CATGGCGGAG
[0011] La fluorescencia aumenta cuando el oligonucleótido se incorpora a la secuencia del ácido nucleico de interés, lo que da lugar a un cambio en la configuración del complejo amplicón-sonda, produciéndose una alteración en el estado de excitación del fluoróforo.
[0012] La citosina unida al ligando fluoróforo no está dispuesta en el extremo 5' o 3', ni en la proximidad del extremo 5' o 3'. Más preferentemente, no está dispuesta en las primeras 3 bases empezando desde el extremo 5' o 3'. Preferentemente, la citosina unida al fluoróforo está dispuesta en la base del punto medio de la sonda.
[0013] De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una sonda para amplificación isotérmica mediada por bucle como la descrita anteriormente.
[0014] En los métodos y composiciones para determinar al menos un ácido nucleico de interés en una mezcla de ácidos nucleicos por lo general se emplea una sonda, un reactivo de hibridación, y una o más enzimas formadoras de enlaces fosfato asociadas a cualquier trifosfato de nucleótido necesario para formar una cadena de ácido nucleico.
[0015] Estos métodos suelen suponer la amplificación, como la inclusión del uso de un promotor junto con una ARN polimerasa, un sitio de restricción donde solo se escinde una hebra y, a continuación, se desplaza mediante extensión con una ADN polimerasa, o un reactivo de hibridación circular, donde se producen repeticiones concatenadas. La detección del ácido nucleico amplificado puede tener lugar de muchas maneras, pero preferentemente se realiza por medio de un fluoróforo.
[0016] De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de LAMP para detectar un ácido nucleico de interés en una muestra, tal y como se define en la reivindicación 1.
[0017] El ácido nucleico de interés puede ser el de un microorganismo, un hongo, una levadura, un virus, una persona, un animal, una planta, etc. Se sabe que el ácido nucleico de interés para la LAMP permite la síntesis de sondas específicas apropiadas y cebadores para LAMP. De esta manera, se puede determinar la presencia o la ausencia de dicho microorganismo, hongo, levadura, virus, persona, animal o planta en una muestra. Preferentemente, el ácido nucleico de interés se obtiene a partir de Chlamydia trachomatis o Neisseria gonorrhoeae.
[0018] La fluorescencia aumenta para indicar la presencia del ácido nucleico de interés en una muestra.
[0019] El proceso es isotérmico, y permite la amplificación en una sola etapa o en etapas secuenciales en un solo recipiente, donde todos los reactivos son compatibles.
[0020] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para diagnosticar clamidia y/o gonorrea en un paciente, tal y como se define en la reivindicación 10.
[0021] La muestra se puede tratar mediante métodos de rutina para permitir que la sonda se una a cualquier nucleótido de interés presente en la muestra. Dicho tratamiento puede incluir el centrifugado y el lisado de la muestra para liberar cualquier ácido nucleico de interés a partir del microorganismo infeccioso.
[0022] En una realización, en el método se utiliza un único tipo de sonda específica para un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis o de Neisseria gonorrhoeae, de tal manera que en la muestra se detecta solo Chlamydia trachomatis o solo Neisseria gonorrhoeae.
[0023] En una realización preferida, a la muestra se añaden al menos dos sondas distintas, donde una primera sonda se marca con un primer marcador fluorescente y es específica para sondear el ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, y una segunda sonda se marca con un marcador fluorescente distinto al de la primera sonda y es específica para sondear el ácido nucleico de Neisseria gonorrhoeae. En esta realización, es posible detectar simultáneamente una infección por clamidia y una infección por gonorrea en una sola muestra obtenida de un paciente.
[0024] En un aspecto del método de la invención, la muestra del paciente puede ser una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de suero o una muestra de saliva.
[0025] Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit que comprende una sonda como la que se describe más arriba, una solución amortiguadora para la reacción de LAMP que contiene una enzima polimerasa, dNTP y cebadores para LAMP para la secuencia de interés.
[0026] En una realización, el kit puede incluir un control positivo y un control negativo. Los reactivos pueden presentarse como reactivos húmedos o en forma liofilizada.
[0027] La solución amortiguadora utilizada en el método o kit de la invención comprende dNTP a una concentración de 1-10 mM, una o más sales a una concentración de 2-20 mM, Tris pH 8,8 a una concentración de 10-100 mM, trehalosa a una concentración de 10-100 mM, polimerasa Bst en una cantidad de 1U-12 U y 1,2 propanodiol al 0,01%-1%.
Abreviaturas
[0028]
CT: Chlamydia trachomatis
GC: Neisseria gonorrhoeae
GlnA7: glutamina sintetasa
PorA7: proteína porina A7
LAMP: amplificación isotérmica mediada por bucle
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
[0029] A continuación, la presente invención se describirá, únicamente a título de ejemplo, con referencia a los siguientes ejemplos y figuras.
Reacción de LAMP
[0030] La detección con V13 del ADN de interés de CT y GT mediante LAMP se realizó con la solución amortiguadora de reacción V6.21 para LAMP desarrollada por el solicitante. La detección con sonda del ADN de interés se realizó en V6.21p (sin V13). Las concentraciones de cebadores para la LAMP fueron las siguientes: PB1 de CT: cebadores FIP y BIP, 0,8 pM; cebadores F3 y B3, 0,2 pM; y cebadores en bucle, 0,4 pM; porA7 de GC y glnA7 de GC: cebadores FIP y BIP, 2 pM; cebadores F3 y B3, 0,25 pM; y cebadores en bucle, 0,5 pM. Todas las sondas se utilizaron a una concentración final de 0,625 pM. Las reacciones de LAMP duraron 60 min a una temperatura constante de 63 °C y se llevaron a cabo en una máquina ABI7500 de PCR en tiempo real. Las lecturas de la señal fluorescente se obtuvieron en el canal SybrGreen/FAM, Joe o Cy3, según procediera.
Secuencias de sonda
[0031]
SEC. N.° ID. 2: GTGCACGC[C-FAM]CCAATAGAAT
SEC. N.° ID. 3: TAAGATAAC[C-FAM]CCGCACGTG
SEC. N.° ID. 4: TCGAGCAA[C-FAM]CGCTGTGAC[ddC]
SEC. N.° ID. 5: GCGAACATA [C-ALEXA546] CAGCTATGATCAA
SEC. N.° ID. 6: ATGTTCA [C-JOE] CATGGCGGAG o
SEC. N.° ID. 7: CCA GGG TAT CTA ATC CTG TTT G[C-FAM].
Secuencias de interés
[0032] Las secuencias de ADN de interés utilizadas en los ejemplos son
SEC. N.° ID. 8: Secuencia completa del plásmido pSotonG1 de Chlamydia trachomatis G/SotonG1 (GenBank: HE603235.1)
1 tttgcaactc Ltggtggtag actttgcaac tctt.ggtggt agactttgca actcttggtg 01 gtagazt tgg tcataatgga cttttgt taa aaaatttctt aaaatcttag ágetecgatt 121 ttgaatagct ttggttaaga aaatgggctc gatggctttc cataaaag!-a gñT-zgttctt 181 aaetttfcggg gacgcgtcgg flaatttggtt atuzaettta tctcatctaa cttga iuu £41 ttatqcqtct gqqattaact ttcttqt tte hhtagagatt ctggat ttat cggaaacctt 301 gataaaggct at"-ctcttg aecacagcga ñtct.etgtht aaaat.caagt ctct.agatgt 361 tt tt&atgga aaagtcgttt cagaggcctc taaacaggct agagcggcat getacatate 421 tttzaeaaag tttttgtata gattgaecaa ggqatatatt aaacccgcta ttccattgaa 481 agattttgga aacactacat tttttaaaat ccgagacaaa atcaaaacag aazegatttc 541 taagcaggaa tggacagttt tttttgaagc gctccggata gtgaattata gagactattt 601 aatcggtaaa thgattgtac aaggga tecg taagttagac gaaat t1tgt etttgcgcac 001 agacgat^ta ttttttgcat ccaatcagat t.tcctr.tcgc attaaaaaaa gacagaataa 721 agaaaccaaa attctaatca catttcctat cagcttaatg gaagagttgc aaaaatacae 781 ttqtgqgaga aatgggsgag tat ttgttLe taaaataggg attcctgtaa caacaagtca 841 ggttgcgcat aazzf.taggc ttgeagagtt ■ccataghgct atgaaaataa aaat.z.actcc 901 cagagt-actt cgtgcaagcg ctttgattca t-ttaaagcaa ataggatt-aa aagatgagga 361 aatcatgcgt atttcctgtc tctcategag acaaagtgtg tgttet tatt gttetqqqqa 1021 agaqgtaagt cczctagtac aaaeaeeeac aazattgtga tataattaaa atza7.a11ca 1031 tattctgtt-g ccagaaaaaa cacctttagg ctatattaga gccatcttct ttgaagcgtt 1141 gtcttctcga gaggattta L cgLacgcaaa tatcatett L gcggt tgcgt gteecgtgae 1201 cttcathahg zcggagtctg aqcaacctag gcgtztgtac tccgtcacag eggtzgctcg 1261 aagcacgtgc ggggttatct taaaagggat. tgcagcttgt agtcctgctt gagagaaegt 1321 qtgggcgat t tgctttaacc ttacciLLLt ttcggagtga gtti.iegaa.ga Caaaatetet 1381 tcqttqaccg atgtactctt gtagaaagtg cataaacttc tqaggataaq ttazaataat 1441 cctcttttct. gtctgacggt tettaagetg ggagaaagaa atggtagctt gttggaaaca 1301 aatetgacta ateteeaagt Ltaagaette agaggagtgt LtacetccLt ggagcattgt 1561 ctqqqeqatc aaccaatccc gggcgttgah tz.777t.tagc tcttttagga aggatgctgt 1621 ttgeaaactg t.tcatcgcat. ccgtttttac tazztccctg gttttaaaaa atgttcgact 1081 attttetegt ttagaaggtt gegetatage gactatttct tgagteatee tgttta-ggáá 1741 tcttgttaag gaaatatagc ttgctgrt zg aaczzgttta gtaccttzgq tccaagaagt 1801 cttggcagag gaaacttttr. taategeate taggattaga ttatgarr i-a aaagggaaaa 1861 ctetLgcaga ttcatatcca aagacaatag accaatcttt tetaaagaca aaaaagatce 1921 tcgatatqat cLacaagtat gtttgt tgag tqatqcgqtc caatgcataa taaettegaa 1981 haaggagaag cttítcatgc gtttecaatñ ggattcttgg cgaattttta aaacttcctg 2041 ataagacttt tcgctatatt ctaacgacat ttcttgctgc aaagataaaa tccctttacc 21ü1 catqaaatcc cLcgtgatat aacctatccg caaaatgtcc tgattaqtga aataateagg hhgttaacag gatagcacge tcggtatttt tttatataaa catgaaaact egzzccgaaa 2221 tagaaaatcg catgcaagat atcgagtatg cgttgttagg taaagctctg atatttgaag 2281 áctctactga ghatattctg aggcagct Lg ctaattatga gtttaaqtgt tcecatcata 2341 aaaacahatt catagtattt aaatacttaa aagacaatgg attaceta ta actgtagact 2401 c.ggcttggga agagcttttg cggcgtcgta tcaaagatat ggacaaatcg tatctcgggt 2461 taatgttgca tgatgcttta tcaaatgaca agcttagatc cgtttetcat acggttttct 2521 tcgatgattt gagcgtgtgt agcgctgaag aaaat ttgag caatttea11 tt££gctcgt 2581 ttaatgagta caatgaaaat ccattgcgta gatrtccgtt trtattgctt gagcgtataa 2641 agggaaggct -qacagtgct atagcaaaga ctttttctat tcgcagcgct agaggccgqt 2701 ctatttatga -atatt-ctca cagtcagaaa ttggagtgct ggctcgtata aaaaaaagac 2761 gagcagcgtt ctctgagaat caaaattctt. tctttgatgg cttcccaaca ggatacaagg 2821 atattgatga taaaggagtt. atcttagcta aaggtaattt ggtgat tata gcagctaggt-£881 catctatagg gaaaacagct ttagctatag acatggcgal aaatcttgtg gttiíctcaac £941 agcgtagagt cggtttccta tctctagaaa tgagcqragg tcaaattqtt gagcggattg 3001 ttgctaataa aacaggaata tactggtgaaa aattacaaag aggggatctc tctaaagaag 3061 aatta"-ccg agtggaagaa. gctggagaaa cagttagaga atcacatttt tatatetgea 3121 gtgatagtca gtataagctt aatttaatcg cgaatcagat ccggttgctg agaaaagaag 3181 atcgagtaga cgtaatattt atcgattact tgcagt Lgat caactcatcg gttggagaaa 3241 atcgtcaaaa tgaaatagca gatatatcta gaaccL taag aggtLLagcc Leagagetaa 3301 acattcctat agtttgttta tcccaactat ctagaaaagt tgaggataga gcaaataaag 3361 ttcccatgct aacagatttg cgagacag-cg gtcaaataga qcaaqacgca gatgtgattt 3421 tgtttatcaa taggaaggaa. tcgtcttcta attgtgagat aactgttggg aaaaatagac 3481 atggatcggt tttctcttcg gtattacatt t.cgatccaaa aattagtaaa ttctccgcta 3541 ttaaaaaagt atggtaaatt atagtaactg ceacttcatc aaaagtccta tccaccttga 3601 aaatcagaag tttggaagaa gacctggtca atetattaag atatCtCCca aattggetca 3661 aaatgggatg gtagaagtta taggtct tqa ttttctttca tctcattacc atgeattage 37£1 agctatccaa agattactga ccgcaa-cgaa ttacaaqqqg aacacaaaag gggttgtttt 3781 atccagagaa tcaaatagtt ttcaatttga aggatggata ceaagaatcc gttttacaaa 3841 aactgaattc ttagaggctt atggagttaa gcggtataaa acatccagaa ataagtatga 3901 gtttagtgga aaagaagctg aaactgcttt agaagccttg taccat 11ag gacatcaacc 3961 gtttttaata gtggcaacta gaactcgatg gaetaatgga a.cacaaatag tagacCgtta 4021 ccaaactctt tctccgatca ttaggat Cta cgaaggatgg qaaggtttaa ctgacgaaga 4081 aaatatagat atagacttaa caccttttaa ttcaccat-rt acacggaaac ataaaggatt 4141 cgttgtagag ccatgt-ccta. tcttggtaga tcaaatagaa tcctactttg taatcaagcc 4201 tgcaaatgta taccaagaaa taaaaatgcg tttcccaaac gcatcaaagt atgcttacac 4261 atttatcgac tgggtgatta cagcagctgc gaaaaagaga cgaaaat taa ctaaggataa 4321 ttcttggcca gaaaacttgt tattaaacgt taacgttaaa agtcttgcat atattttaag 4381 gatgaatcgg tacatctgta caaggaactg gaaaaaaatc qagttagcta tcgataaatg 4441 tatagaaatc: gccattcagc ttggctqqtt atetagaaga aaacgcattg aatttctgga 4501 ttcttcta.aa ctctctaaaa. aagaaattct atatetaaat aaagagcgct ttgaagaaat 4561 aactaagaaa tctaaagaac aaatggaaca agaatetatt aattaatage aggcttgaaa 4621 ctaaaaacct aatttattta aagctcaaaa taaaaaagag 1111aaaatg ggaaattctg 4681 gtttttattt gtataacact gaaaaCtgcg tetttgctga taatatcaaa gttgggcaaa 4741 tgacagagcc gctcaaggac cagcaaataa tccttgggac aaaatcaaca cctgtcgcag 4801 ccaaaaCgac agcttctgat ggaatat-ctt taacaqtrte caataattea tcaaccaatg 4861 cttctattac aattggtttg gatgcggaaa aagcttacca gettatteta gaaaagttgg 4921 gaaatcaaat tcttgatgga attgctgata ctattgttga tagtacagtc caagatattt 4981 tagacaaaat cacaacagac ccttctctag gtttgt tgaa aget 11taac aactttccaa 5041 teaetaataa aattcaatge aacggg LLal teactcccag tascaLLgaa aetttattag 5101 gaggaactqa aat.agq.aaaa 11eracaqtia cacecaaaag ctctqggaqc atgLtcttag
5161 tctcagcaga tattattgca tcaagnHtgg eaggcggcgt tgttctagct ttggtacgag
5221 aaggtgattc taagccctgc gcgattaglt atggatactc atcaggcgtt. cctaatttat
5281 gtagtctaaq aaccagcatt actaatacaq qattgactcc aacaacqta t tcaLtacgtg
5341 taggr.ggttt agaaageggr. gtggtatggg ttaatgccct ttetaatggc aetgatattt
54 01 taggaataac aaatacttct aatgtatctt ttttggaagt aatacctcaa acaaacgctt
5461 aaaeaatttt tattggattt ttcttataqg ttttatattt agagaaaaca gttegaatta
5521 cggggtttqt Latqcaaaat aaaagaaaaq tgagggacga ttttattaaa dttqttaaaq
5581 atgtgaaaaa agatttcccc gaattagacc t.aaaaatacg agtaaacaag gaaaaagtaa
5641 cttLcLLaaa LLctccetta gaaetctsce aLaaaagtgt ctcacLaaLL ctaggactgc
5701 ttcadcaaat aqaaaanct ttaqgattat tcccaqactc tcctqttrtC gaa aaattaq
5761 aggataacay rrtaañgcta aaaaaggctt tgattatget tatcttgtct agaaaagaca
5821 tgttttceaa ggctgaatag acaecí tac! etaacgttgg aglL galL Lg eacacettag
5861 ttttttqctc 11 ttaaqgga ggaactqqaa aaacaacact ttctctaaac qtgggatgca
5541 acttggccca atttttaggg aaaaaagtgt tacttgctga cetagacccg caatccaatt
6001 fcatettctgg attgggggct agtgtcagaa ataaccaaaa aggct tgcac gacatagtat
6061 acaaatcaaa ■aqatttaaaa tcaatcat 11 qcqaaacaaa aaaagataqt qtqgacctaa
6121 11.cctqcate atttf-tatqq gaacaqttta gagaa 7.7gga t.amataga ggacct-agta
6181 ac-aacttaaa gttatttctg aatgagtact gcgctccttt ttatgacatc tgcata&tag
6241 atstlccacc tsgcctagga gggtLaacga aagaagcttt LgL Lgcaqga qacaaattaa
6301 ttgcttqttt aa ctciaqaa cctttttcta ttctagggtt acaaaaqata cgtgaattct
6361 taagttcggt CggññññCCt gaagaagaac acattcttgg aatagctttg t.ctt.cttggg
6421 atgategtaa ctcgactssc esaatgLata taqacattat egagtetstt tacasasaca
6481 agcttttttc a-acaaaaatt cgtcgagata tttc7czcag ccqttitctC ■cttaaagaag
6541 attctgtagc Laatgtctat ecaaatteta gggccgcaga agatattetg aagttaacgc
6601 atgañfltagc aaatattttg catatcgaat atgaacgaga ttectcteag aggacaacgt
6661 gaacaaacta aaaaaagaag cggatqtrt t ttttaaaaaa aatcaaaitq ccgc7tctct
6721 agattrrtaag aagacacttc cttccattga acta7tctca gqaactttga attctgagga
6781 aagtcagagt ttggatcgat tatttttatc agagtcccaa aactattcgg atgaagaatt
6841 ttatcaaqaa qacatcctag cggtaaaa-rt qcttactggt cagataaaat ccatacagaa
6901 gcaaczacqta cttcr.777.a-g gagaaaaaat cL.aLaatgct aqaaaaat77 Lgagtaagga
6961 tcacttctcc tcaacaactt tttcatcttg gatagagtta gtttttagaa etaagtette
7021 tgc LLacaa L qCtcttgcat □LLaCgageL ttttaLaaSt dccccaaCc saactctsca
7081 aaaaqaqttt caa tcgatcc cctataaatc egea aatatt ttggccqeta gaaaaggcga
7141 tttaaaaacc aaggtcgatg tgat&gggaa agt.atgtgga atgtcgaact catcggcgat
7201 aaggg Lgt Lg gateaatttc ttccLLcate tagaaacaaa gacg Ltagag aaacgatsgs
7261 taaqtctqat tEaqaqaaga atcrgccaatt atctgatttc ttaatagaqa tacttcgcat
7321 catatgttcc ggagttcctt tgtcctccta taacgaaaat cttctacaac agctttttga
7381 actttttaag caaaagagct gatcctccgt eagctcatat atatat ttat tatatatata
7441 tttatttagg gatt.tgat.tt tacgagagag a
SEC. N.° ID. 9: gen porA parcial de Neisseria gonorrhoeae para la proteína de membrana externa de clase 1, cepa GC3 (GenBank: HE681886.1)
1 gccggcggcg gcgtgaeceg ttggggcaat agggaatoet ttgtcggctt ggcaggegaa 61 ttcggeacgc tgcqcqccgg ccgcgttgcg aatcagtttg acgatgeeag ceaaqccatt
121 gBtccttggg acagcaacaa tgatgtggct tcgcaattgg gtatrttcaa acqccacgac
181 gatatgccgg ttlocgtacg ctacgactcc ccgyactttt ccggtttcag cggcagcgtc
£41 caattcqttc cggctcaaaa cagcaagtcc gcctatacgc cggctcattq gactactgtg
801 tataacacta acqqtactac tactaetttc gttccggct-g ttgtcggcaa gcccqqatcg
361 gatgtgtatt atgccggtct gaattacaaa aatggcggtt ttgccgggaa etatgeettt
421 aaatatgcga gacacgccaa tgtcggacgt aatgcttttg agttgttett gctcggcagt
481 gggagtgatg aagccaaagg taC'-'-gat-occ ttg a a a a a c c atcaggtaca ccg cc tga cg
841 ggcggctatg gggaaggcgg cttgaatctc gccttggcgg ctcagttgga tttgtctgaa
6UL aatgccgaca aaaccaaaaa cagtaegacc gaaattgccg ccactqrttc ctaccgcttc
661 ggtaatacag tcccqcgcat. cagctatgcc catgqtttcg actttgtcga acqcagtcag
721 aaacgcgaac ataccagcta tga
SEC. N.° ID. 10: secuencias codificantes parciales del alelo glnA-14 del gen de la glutamina sintetasa (glnA) de Neisseña gonorrhoeae, (GenBank: AF520262.1)
1 eecgetttgt cgatLtgcgo tteaecgata ccaaaggcaa g-eagcaccac tiLaccgtge
61 ctgcgcgcat cgtqttggaa gaccccgaag agtggtttga aaacggaccg gcgtttgacg
121 gctcgtccat cggcggctgg aaaggca rtg aggcCCccga tatgeagetg cgtcccgatg
131 cgtccacag-c ett-cgtegat C'jLLLLLatg atgatgttac cgtcgtaatt a-cctgcgacg
£41 tcateqaccc tgccgacggt cagggttacg accqcgaccc gcgctccatc gcacqccgcg
301 <>‘-gaag<;cta t"tgaaatci-. tccggtâ cg gcqacacc-gc ctatntcggc c-ccg-aacccg
361 aatCcLtegt ctt-ogacggc gtagaatttg aaaccgacat gcacaaaaec cgttacgááá
421 tcacgtccga aagcqgcgcg tqggcaagcg gcctgcatst ggacggtcaa a.acaccggcc
481 accgccccgc cgt.caaaggc ggctdcgcgc ccgtcgcgcc gattgactgc ggtc-aagatt
841 tgcgctccgc catggtgaac attt Lggaag gactcggcat cgaagtcgaa gtucaccaca
601 gcgaagtcgg taccqgcagc caaatggaaa tcggcacccg tttcgccact ttggLcaaac
66L gcgccgacca aacccaagar. atgaaatacg tcatccaaaa cgttgcccac aa.t.7.ccggca
721 asaccgceac ctttatgccc aaaccgatta tgggcgacaa cggcagcggt atgcacgtcc
781 aceaatceat ttqqaiagac ggtcaaaacc tgttcqcagg cgacggctat gccgqtttgt
841 o'-gataccgc gctctactac atcggcggca tcatcaaaca cgccaaagcc ctgaacgcga
901 ttaccaatcc gtccaccaac tcctacaaac gcctcgtgcc gcactttgaa gcaccgacca
961 aattggccta ttccgccaaa aaccgttreg cttccatccg tatcccgtct gtgaacagca
1Q2L gcaaggcgcg ccqcstcgaa gcgcgtt ccqacccgac cgccaacccg tat.T.tqqcar.
IOS! tCgccgccct gctgatggcc ggt tLggacg gcattcaaaa caaaatccat ccgggcgacc
114L ctqccqataa aaacctqtac gacctgccgc cqqaaqaaga cgcgctagt a ccgaccgtct
1201 gcgcttcttt gqaagaagca cttgccgccc tcaaggtcga ccacgaattg ctgctqcgcg
1261 gcggcgtgtt cagcaaagac tggatcgaca gctacatcgc ctttaaagag gaagatgtcc
1321 gccgcatccg tatggcgccg cacccgctgg aatttg
[0033] Las secuencias de cebador utilizadas en la reacción de LAMP son las siguientes:
Plásmido de CT
[0034]
F3 TCTACAAGAGTACATCGGTCA (SEC. N.° ID. 11)
B3 TGAAGCGTTGTCTTCTCG (SEC. N.° ID. 12)
FIP GCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGTCTTCGTAACTCGCTCC (SEC. N.° ID. 13)
BIP TCGAGCAACCGCTGTGACCCTTCATTATGTCGGAGTCTG (SEC. N.° ID. 14)
LF1 CGGGCGATTTGCCTTAAC (SEC. N.° ID. 15)
LB1 TACAAACGCCTAGGGTGC (SEC. N.° ID. 16)
porA7 de GC
[0035]
F3 ACCAAAAACAGTACGACCGA (SEC. N.° ID. 17)
B3 AAGTGCGCTTGGAAAAATCG (SEC. N.° ID. 18)
FIPATGGGCATAGCTGATGCGCGAATTGCCGCCACTGCTTC (SEC. N.° ID. 19)
BIP TCGACTTTGTCGAACGCAGTCAAATCGACACCGGCGATGA (SEC. N.° ID. 20)
LoopF1 GCGAACATACCAGCTATGATCAA (SEC. N.° ID. 21)
glnA7 de GC
[0036]
F3 TCATATCTTGGGTTTGGTCG (SEC. N.° ID. 22)
B3 CTGCATATGGACGGTCAAA (SEC. N.° ID. 23)
FiP CGAAGTCCACCACAGCGAATTTGACCAAAGTGGCGAA (SEC. N.° ID. 24)
BiP CTTCGATGCCGAGTCCTTCCGATTGACTGCGGTCAAGAT (SEC. N.° ID. 25)
LF CAAATGGAAATCGGCACCC (SEC. N.° ID. 26)
LB ATGTTCACCATGGCGGAG (SEC. N.° ID. 27)
Solución amortiguadora
[0037] El solicitante ha desarrollado un sistema de solución amortiguadora para su uso con las sondas de la invención, al que en los siguientes ejemplos se designa como V6.21 (o V6.21p sin colorante V13). Las concentraciones de los componentes de la solución amortiguadora tras la reconstitución de esta son:
V6.21
[0038] dNTP a 4-10 mM, sal a 10 mM, Tris pH 8,8 a 30 mM, trehalosa a 30 mM, 1-8 U de polimerasa Bst, colorante y propanodiol al 0,05%.
V6.21p
[0039] dNTP a 4-10 mM, sal a 10 mM, Tris pH 8,8 a 30 mM, trehalosa a 30 mM, 1-8 U de polimerasa Bst y propanodiol al 0,05%.
[0040] La detección de CT/GC en muestras clínicas mediante PCR en tiempo real se llevó a cabo mediante el ensayo múltiple APTIMA CT/GC (Gen-Probe) conforme a las instrucciones del fabricante.
Electroforesis en gel de agarosa
[0041] La electroforesis del ADN se realizó en gel de agarosa al 1% y solución amortiguadora TAE 1X a 100 V. Los productos de ADN obtenidos mediante LAMP se visualizaron con GelRed (Invitrogen) en un transiluminador.
[0042] La solución amortiguadora V6.21 y V6.21p fue desarrollada por el solicitante. Los cebadores para LAMP se obtuvieron de Eurofins. Los oligonucleótidos marcados con fluoróforo se adquirieron de Integrated DNA Technologies. La solución amortiguadora Tris, el gel de agarosa y el agua de calidad para PCR se adquirieron de Sigma. Los patrones de ADN de CT y GC se obtuvieron de la ATCC.
Figuras
[0043] La Figura 1 es un esquema de la sonda de ADN de la invención. La sonda consiste en un oligonucleótido con una citosina interna conjugada con un fluoróforo definido. La sonda puede ser complementaria a la región interna del amplicón flanqueado por los cebadores Fip y Bip, o puede ser un cebador LoopF o LoopB modificado marcado en la parte interna con un fluoróforo.
Ejemplo 1
[0044] En las Figuras 2A a 2F se muestran las gráficas de amplificación generadas con los cebadores PB1 de CT (Figura 2A y Figura 2D), glnA7 de GC (Figura 2B y Figura 2E) y porA7 de GC (Figura 2C y Figura 2F) en la solución amortiguadora V6.21 que contenía V13 (Figuras 2A, 2B y 2C) o la solución amortiguadora V6.21p sin colorante V13 (Figuras 2D, 2E y 2F). Las secuencias de interés que se muestran en las SEC. N.° ID. 8 a 10 con la sonda interna PB1 de CT conjugada con FAM, la sonda en bucle glnA7 de GC conjugada con Joe y la sonda en bucle porA7 de GC conjugada con Alexa546, respectivamente. Todas las reacciones se realizaron durante 60 minutos a una temperatura constante de 63 °C con una máquina ABI7500.
Ejemplo 2
[0045] Las Figuras 3A y 3B son análisis de la curva de fusión de los productos de LAMP generados con los cebadores PB1 de CT en presencia de la sonda interna PB1 de CT conjugada con FAM. Como control positivo se utilizaron 100 pg por reacción del patrón de ADN de CT de la ATTC. A: gráfica del indicador normalizada; B: gráfica del indicador derivada. Las gráficas de las curvas de fusión se generaron basándose en las lecturas realizadas en el canal de FAM con la máquina ABI7500.
Ejemplo 3
[0046] Las Figuras 4A y B son análisis de la curva de fusión del producto de LAMP generado con los cebadores glnA7 de GC en presencia de una sonda en bucle glnA7 de GC conjugada con JOE. Como control positivo se utilizaron 100 pg por reacción del patrón de ADN de GC de la ATTC. En la Figura 4A se muestra una gráfica del indicador normalizada y en la Figura 4B se muestra una gráfica del indicador derivada. Las gráficas de las curvas de fusión se generaron basándose en las lecturas realizadas en el canal de JOE con la máquina ABI7500.
Ejemplo 4
[0047] Las Figuras 5A y B son análisis de la curva de fusión del producto de LAMP generado con los cebadores porA7 de GC en presencia de una sonda en bucle porA7 de GC conjugada con ALEXA546. Como control positivo se utilizaron 100 pg por reacción del patrón de ADN de GC de la ATTc . En la Figura 5A se muestra una gráfica del indicador normalizada, y en la Figura 4B se muestra una gráfica del indicador derivada. Las gráficas de la curva de fusión se generaron basándose en las lecturas realizadas en el canal de Cy3 con la máquina ABI7500.
Ejemplo 5
[0048] En las Figuras 6A a 6D se muestran los resultados de una prueba para confirmar la especificidad del producto de ADN con una sonda de la invención en la amplificación isotérmica mediada por bucle. El tiempo de amplificación tardío de los falsos positivos, más de 30 minutos tras alcanzar la concentración más baja detectable de ADN de interés en la reacción de LAMP (100 fg de ADN de GC), indica que la amplificación no específica podría deberse a la formación de dímeros de cebadores. El análisis de la curva de fusión estándar no permite distinguir entre el producto específico y el no específico en esta reacción de LAMP, pero el producto no específico se puede identificar con la sonda de la invención. El ADN de GC se amplificó con los cebadores porA7 de GC y se visualizó con el colorante V13 o la sonda porA7-ALXA546 de GC, según procediera.
Ejemplo 6
[0049] En la Figura 7 se muestran las gráficas de amplificación generadas con los cebadores PB1 de CT en la solución amortiguadora V6.21 que contenía V13 o la solución amortiguadora V6.21p sin colorante V13, pero en presencia de una sonda terminal PB1 de CT (complementaria a la región en bucle) con una C interna conjugada con FAM y un terminador en el extremo 3' (3'ddC). A pesar de que se logró una amplificación satisfactoria del ADN de interés, lo que se confirmó por la excitación del colorante V13 en la reacción de control, la sonda PB1 de CT con el terminador en el extremo 3' no generó una señal positiva.
Ejemplo 7
[0050] En las Figuras 8A y 8B se muestran las gráficas de amplificación generadas en la solución amortiguadora V6.21 p que contenía ROX en presencia de los cebadores PB1 de CT y la sonda terminal PB1 de CT con una citosina interna conjugada con FAM (Figura 8A), y los cebadores universales y la sonda 3'UP con citosina en el extremo 3' conjugada con FAM (Figura 8B). La primera línea representa las señales generadas por ROX, y la segunda línea corresponde a la señal generada en el canal de FAM. La unión al ADN de interés de la sonda con una C marcada en la parte interna produce la excitación de FAM. La unión al ADN de interés de la sonda con una C marcada en el extremo 3' no altera el estado de excitación de FAM.
Ejemplo 8
[0051] En las Figuras 9A a 9C se muestran las gráficas de amplificación generadas con los cebadores PB1 de CT en la solución amortiguadora V6.21p sin V13 en presencia de la sonda interna PB1 de CT con una C interna conjugada con FAM y un colorante de referencia (ROX). En la Figura 9A se muestran los datos sin procesar, las lecturas del canal de FAM en la primera línea y las del canal de ROX en una segunda línea. En la Figura 9B se muestran las gráficas de amplificación (generadas en el canal de FAM) normalizadas a ROX. En la Figura 9C se muestran las gráficas derivadas de las curvas de fusión del indicador.
Ejemplo 9
[0052] En las Figuras 10A a 10C se muestra la validación de la especificidad de la sonda PB1-FAM de CT. En la Figura 10A se muestran las gráficas de amplificación generadas con la sonda PB1-FAM de CT en presencia de ADN de CT y cebadores de CT. Como control, se llevaron a cabo dos series de reacciones donde genes no específicos, glnA7 de GC y porA7 de GC se amplificaron con los cebadores para LAMP correspondientes en presencia de la sonda PB1-FAM de CT. En la solución amortiguadora V6.21p, las gráficas de amplificación en presencia de la sonda PB1 de CT en el canal de FAM se generaron solamente cuando el ADN de CT estaba presente en la reacción, y no se generó ninguna señal cuando se amplificaron los genes no específicos (glnA7 de GC y porA7 de GC). Tampoco se generó ninguna señal al utilizar una sonda no específica en una reacción en la que el ADN de CT se amplificó con cebadores de CT. En la Figura 10C se muestran los datos obtenidos en un experimento análogo, pero realizado en la solución amortiguadora V6.21 que contenía un colorante intercalante V31. En la Figura 10C se muestran los productos de ADN generados en el experimento descrito en la Figura 10A.
Ejemplo 10
[0053] En las Figuras 11A y 11B se muestra la validación de la sonda PB1-FAM de CT frente al ensayo APTIMA CT. Cincuenta muestras clínicas de las que se confirmó que eran positivas (n = 29) (Figura 11A) o negativas (n = 21) (Figura 11B) para CT se analizaron en la solución amortiguadora V6.21p con la sonda PB1-FAM de CT. De 50 muestras, 24 dieron negativo (Figura 11A) y 26 dieron positivo (Figura 11B) para CT con la sonda PB1-FAM de CT. La concordancia entre las pruebas de Aptima y de PB-FAM de CT fue del 86%.
Ejemplo 11
[0054] En las Figuras 12A y 12B se muestran las gráficas de amplificación generadas en el ensayo múltiple de CT/g C con las sondas PB1-FAM de CT porA7-Alexa546 de GC. El ADN de CT y GC se amplificó en reacciones independientes o conjuntamente en la solución amortiguadora V6.21p en presencia de las sondas PB1-FAM de CT y porA7-Alexa546 de Gc . Las lecturas se hicieron en los canales de Cy3 (Figura 12A) y de FAM (Figura 12B). El experimento mostró que dos ADN de interés se pueden amplificar y detectar en una reacción simultánea con sondas marcadas con FAM y Alexa546, y que no había reactividad cruzada entre las sondas y los cebadores PB1 de CT y porA7 de GC.
Ejemplo 12
[0055] En el Cuadro 1 se muestra una comparación entre la LAMP con V13 para CT y GC, el CT/GC Aptima y el ensayo múltiple de CT/GC (PB1-FAM de CT porA7-Alexa546 de GC). El ADN extraído de 136 muestras clínicas se analizó con el ensayo múltiple CT/GC-Aptima, los cebadores PB1 de CT y porA7 de GC en la solución amortiguadora V6.21 que contenía V13 o en una reacción múltiple en la solución amortiguadora V6.21p en presencia de los cebadores PB1 de CT y porA7 de GC y las sondas PB1-fAm de CT y porA7-Alexa546 de GC. En un experimento de control, las muestras también se analizaron en una reacción simple con la sonda glnA7-joe de GC. En el Cuadro se muestran las puntuaciones de concordancia entre las pruebas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una secuencia de un ácido nucleico de interés en una muestra que comprende: amplificar un ácido nucleico de interés en la muestra mediante amplificación isotérmica mediada por bucle; sondear el ácido nucleico amplificado con una sonda que comprende;
una secuencia de una sonda oligonucleotídica complementaria a una región de una secuencia de un ácido nucleico de interés, donde dicha secuencia de una sonda oligonucleotídica tiene solamente un marcador fluoróforo y dicho marcador está unido a una base de citosina interna y donde dicha secuencia de una sonda oligonucleotídica no tiene un terminador en el extremo 3', donde la base de citosina está dispuesta sustancialmente de manera central a lo largo de la cadena oligonucleotídica a excepción de las posiciones 1-3 en el extremo 3' y la posición 1 en el extremo 5'; y
detectar la presencia del ácido nucleico de interés, donde un incremento en la fluorescencia de la sonda indica la presencia del ácido nucleico de interés en la muestra.
2. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia de la sonda oligonucleotídica es una secuencia de ADN y la secuencia del ácido nucleico de interés es una secuencia de ADN.
3. El método reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el fluoróforo comprende uno o más seleccionados de los siguientes: FAM, JOE, TET, HEX, TAMRA, ROX, ALEXA y ATTO.
4. El método según la reivindicación 3, donde el fluoróforo es FAM, Joe o Alexa546.
5. El método reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia de la sonda oligonucleotídica comprende la siguiente secuencia:
5' Xn C * Xm 3' (SEC. N.° ID. 1)
donde n es > 1, m > 3, X es una base nucleotídica; y * es un fluoróforo y
donde la base nucleotídica se selecciona de entre A, T, C y G,
n es más de 1 hasta 20, más preferentemente más de 1 hasta 10, y m es más de 3 hasta 20, preferentemente más de 3 hasta 10.
6. El método reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia de la sonda oligonucleotídica comprende una o más de las siguientes secuencias:
SEC. N.° ID. 3: TAAGATAAC[C-FAM]CCGCACGTG
SEC. N.° ID. 5: GCGAACATA [C-ALEXA546] CAGCTATGATCAA
o
SEC. N.° ID. 6: ATGTTCA [C-JOE] CATGGCGGAG
7. El método según las reivindicaciones 1-5, donde el ácido nucleico de interés procede de un microorganismo, un hongo, una levadura o un virus.
8. El método reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ácido nucleico de interés procede de Chlamydia trachomatis o Neisseria gonorrhoeae.
9. Un método para diagnosticar una infección por clamidia y/o gonorrea en un paciente, que comprende:
proporcionar una muestra obtenida a partir del paciente;
llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8; y
detectar la presencia de un ácido nucleico obtenido a partir de Chlamydia trachomatis y/o Neisseria gonorrhoeae, donde un incremento en la fluorescencia de la sonda indica la presencia de una infección por Chlamydia trachomatis y/o Neisseria gonorrhoeae.
10. El método de la reivindicación 9, donde a la muestra se añade un único tipo de sonda específica para un ácido nucleico procedente de Chlamydia trachomatis o Neisseria gonorrhoeae.
11. El método de la reivindicación 9, donde se añaden al menos dos sondas distintas a la muestra, donde una primera sonda se marca con un primer marcador fluorescente y es específica para sondear el ácido nucleico de Chlamydia Trachomatis, y una segunda sonda se marca con un marcador fluorescente diferente al de la primera sonda y es específica para sondear el ácido nucleico de Neisseria gonorrhoeae.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las sondas se proporcionan en un sistema de solución amortiguadora que comprende dNTP a una concentración de 1-10 mM, una o más sales a una concentración de cada sal de 2-20 mM, Tris pH 8,8 a una concentración de 10-100 mM, trehalosa a una concentración de 10-100 mM, polimerasa Bst en una cantidad de 1U-12 U y 1,2 propanodiol al 0,01% -1%.
13. El método de la reivindicación 12, donde la sal o las sales se seleccionan del grupo que consiste en KCl, (NH4)2SO4 y MgSO4.
14. Una sonda para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de una sonda oligonucleotídica complementaria a una región de una secuencia de un ácido nucleico de interés, donde dicha secuencia de una sonda oligonucleotídica tiene solamente un marcador fluoróforo y dicho marcador se une a una base de citosina interna y donde dicha secuencia de una sonda oligonucleotídica no tiene un terminador en el extremo 3', donde la base de citosina está dispuesta sustancialmente de manera central a lo largo de la cadena oligonucleotídica, a excepción de las posiciones 1-3 en el extremo 3' y la posición 1 en el extremo 5'; donde la sonda comprende una o más de las siguientes secuencias:
SEC. N.° ID. 3: TAAGATAAC[C-FAM]CCGCACGTG
SEC. N.° ID. 5: GCGAACATA [C-ALEXA546] CAGCTATGATCAA
o
SEC. N.° ID. 6: ATGTTCA [C-JOE] CATGGCGGAG
15. Un kit para detectar un ácido nucleico de interés conforme al método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende una sonda según se especifica en un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o según se reivindica en la reivindicación 14, una solución amortiguadora como reactivo para la amplificación isotérmica mediada por bucle, una enzima, dNTP y uno o más cebadores para la amplificación isotérmica mediada por bucle.
16. El kit según la reivindicación 15, que además comprende un control positivo y negativo.
17. El kit de la reivindicación 16, donde la solución amortiguadora como reactivo comprende dNTP a una concentración de 1-10 mM, una o más sales a una concentración de 2-20 mM, Tris pH 8,8 a una concentración de 10-100 mM, trehalosa a una concentración de 10-100 mM, polimerasa Bst en una cantidad de 1U-12 U y 1,2 propanodiol al 0,01%-1%.
18. El kit de la reivindicación 17, donde una o más sales se seleccionan del grupo que consiste en KCl, (NH4)2SO4 y MgSO4.
ES14793265T 2013-10-30 2014-10-30 Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle Active ES2773313T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1319180.4A GB201319180D0 (en) 2013-10-30 2013-10-30 Nucleic acid probe
PCT/GB2014/053238 WO2015063498A2 (en) 2013-10-30 2014-10-30 Nucleic acid probe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2773313T3 true ES2773313T3 (es) 2020-07-10

Family

ID=49767396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14793265T Active ES2773313T3 (es) 2013-10-30 2014-10-30 Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20160273029A1 (es)
EP (1) EP3063292B1 (es)
JP (2) JP2016534722A (es)
CN (1) CN105899674A (es)
AU (2) AU2014343439A1 (es)
CA (1) CA2926317C (es)
CY (1) CY1124064T1 (es)
DK (1) DK3063292T3 (es)
ES (1) ES2773313T3 (es)
GB (2) GB201319180D0 (es)
HR (1) HRP20200264T1 (es)
HU (1) HUE048579T2 (es)
LT (1) LT3063292T (es)
PL (1) PL3063292T3 (es)
PT (1) PT3063292T (es)
RS (1) RS59988B1 (es)
RU (1) RU2668154C2 (es)
SA (1) SA516371023B1 (es)
SI (1) SI3063292T1 (es)
WO (1) WO2015063498A2 (es)
ZA (1) ZA201602247B (es)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201402591D0 (en) * 2014-02-14 2014-04-02 Memo Therapeutics Ag Method for recovering two or more genes, or gene products, encoding an immunoreceptor
KR101875662B1 (ko) * 2015-12-01 2018-08-02 에스디 바이오센서 주식회사 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법
CA3008949A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Selfdiagnostics Deutschland Gmbh Method for the detection of a sexually transmitted infectious pathogen
CN110177887B (zh) * 2016-11-10 2024-10-29 达丽斯生物医学公司 用于扩增和检测沙眼衣原体的多核苷酸
CN110225919A (zh) * 2016-11-10 2019-09-10 达丽斯生物医学公司 用于扩增和检测淋病奈瑟氏菌的多核苷酸
CN107022645A (zh) * 2017-06-14 2017-08-08 苏州承美生物科技有限公司 检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针及试剂盒
US10450616B1 (en) 2018-05-09 2019-10-22 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis
KR102705173B1 (ko) 2018-11-30 2024-09-12 삼성디스플레이 주식회사 표시패널 및 이를 포함하는 전자장치
US10954572B2 (en) * 2019-07-25 2021-03-23 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae
US11891662B2 (en) 2019-12-02 2024-02-06 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin
PL435634A1 (pl) * 2020-10-09 2022-04-11 Genomtec Spółka Akcyjna Zestaw starterów, skład reagentów oraz metoda wykrywania bakterii atypowych
CN114182031A (zh) * 2021-12-22 2022-03-15 江苏猎阵生物科技有限公司 一种核酸探针及其应用
GB2620948A (en) * 2022-07-26 2024-01-31 Mast Group Ltd Method and kit

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE246360T1 (de) * 1991-05-22 2003-08-15 Dade Behring Marburg Gmbh Partikel, die eine zusammensetzung beinhalten, die eine chemilumineszierende verbindung umfassen
JP2003510017A (ja) 1999-06-22 2003-03-18 インビトロジェン コーポレイション 核酸の検出および識別のために改良されたプライマーおよび方法
US7998673B2 (en) 2000-03-29 2011-08-16 Lgc Limited Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
WO2002008414A1 (fr) * 2000-06-27 2002-01-31 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Nouvelles sondes d'acides nucléiques et procédés d'essai d'acide nucléique par utilisation des mêmes
WO2002014555A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 University Of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
GB0103424D0 (en) * 2001-02-12 2001-03-28 Chiron Spa Gonococcus proteins
US6960436B2 (en) 2002-02-06 2005-11-01 Epigenomics Ag Quantitative methylation detection in DNA samples
JP2004261017A (ja) * 2003-02-27 2004-09-24 Arkray Inc クラミジア・トラコマティスの検出方法およびそのためのキット
KR100885177B1 (ko) 2004-04-12 2009-02-23 학교법인 포항공과대학교 표적 ｄｎａ 또는 ｒｎａ 탐지용 올리고뉴클레오티드
GB0514889D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Lgc Ltd Oligonucleotides
JP2007275006A (ja) 2006-04-10 2007-10-25 Hitachi High-Technologies Corp 核酸検出用プローブ作製法
JP5313157B2 (ja) * 2007-10-19 2013-10-09 栄研化学株式会社 核酸増幅法、それに用いる試薬及び試薬キット
US8900807B2 (en) * 2008-02-25 2014-12-02 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Composition and methods for rapid detection of HIV by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
EP2285982B1 (en) * 2008-05-27 2018-04-11 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers
KR20100098570A (ko) * 2008-12-16 2010-09-07 아크레이 가부시키가이샤 핵산 증폭의 컨트롤의 검출 방법 및 그 용도
WO2010138973A2 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Phthisis Diagnostics Advanced pathogen detection and screening
EP2447378B1 (en) * 2010-10-29 2017-06-21 ARKRAY, Inc. Probe for detection of polymorphism in EGFR gene, amplification primer, and use thereof
JP2013074888A (ja) * 2011-09-15 2013-04-25 Arkray Inc ＩＬ２８Ｂ（ｒｓ８０９９９１７）とＩＴＰＡ（ｒｓ１１２７３５４）の変異を検出する方法
JP2013081450A (ja) * 2011-09-27 2013-05-09 Arkray Inc 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キット
US9121051B2 (en) * 2011-10-31 2015-09-01 Arkray, Inc. Method of determining the abundance of a target nucleotide sequence of a gene of interest
KR101958048B1 (ko) * 2011-10-31 2019-03-13 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤 표적 핵산의 검출법
JP6153758B2 (ja) * 2012-04-20 2017-06-28 アークレイ株式会社 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
CN102703433B (zh) * 2012-06-12 2014-10-08 中国水产科学研究院黄海水产研究所 基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂
WO2014017187A1 (ja) * 2012-07-25 2014-01-30 ソニー株式会社 核酸増幅反応用試料の調製方法及び核酸増幅反応用試料の調製装置
JP2014093996A (ja) * 2012-11-12 2014-05-22 Sony Corp 核酸等温増幅方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2926317A1 (en) 2015-05-07
RS59988B1 (sr) 2020-03-31
CY1124064T1 (el) 2022-03-24
US20160273029A1 (en) 2016-09-22
SI3063292T1 (sl) 2020-03-31
AU2020294316A1 (en) 2021-04-15
AU2020294316B2 (en) 2023-02-02
JP2016534722A (ja) 2016-11-10
US20190127785A1 (en) 2019-05-02
GB201319180D0 (en) 2013-12-11
HUE048579T2 (hu) 2020-07-28
WO2015063498A2 (en) 2015-05-07
US11111523B2 (en) 2021-09-07
CA2926317C (en) 2023-05-23
LT3063292T (lt) 2020-02-25
GB2524603A (en) 2015-09-30
RU2668154C2 (ru) 2018-09-26
EP3063292A2 (en) 2016-09-07
PT3063292T (pt) 2020-02-14
AU2014343439A1 (en) 2016-04-21
DK3063292T3 (da) 2020-02-24
CN105899674A (zh) 2016-08-24
NZ719238A (en) 2022-03-25
WO2015063498A3 (en) 2015-07-16
JP6983201B2 (ja) 2021-12-17
GB201419367D0 (en) 2014-12-17
SA516371023B1 (ar) 2021-01-12
JP2019216722A (ja) 2019-12-26
PL3063292T3 (pl) 2020-06-29
ZA201602247B (en) 2022-05-25
RU2016112354A (ru) 2017-12-01
EP3063292B1 (en) 2019-11-20
HRP20200264T1 (hr) 2020-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2773313T3 (es) Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle
US12077811B2 (en) Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
Lobato et al. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
ES2776427T3 (es) Método de amplificación de ADN basado en invasión de cadena
CN109251965A (zh) 一种具有增加的基因突变特异性的dna聚合酶活性增强用pcr缓冲液组合物
WO2009049630A1 (en) Isothermal amplification method for detection of nucleic acid mutation
WO2013101290A1 (en) Methods of using telomeres as markers for aging
CN112760308A (zh) LdCsm-dCsm3突变型复合物、含该复合物的检测系统及其在RNA检测中的应用
JP2008072951A (ja) Ｌａｍｐ法を用いたサルモネラｏ４群の血清型迅速検出法
CN114072521A (zh) 用于等温dna扩增的方法和组合物
JP2007135499A (ja) サルモネラｏ９群の検出法
NZ719238B2 (en) Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification
JP2007075052A (ja) 単一蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法
JP2001333783A (ja) メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド
JP2004033090A (ja) ビブリオ・バルニフィカスの検出方法
WO2013140339A1 (en) Positive control for pcr